禽白血病的研究現(xiàn)狀

葛 成，張海龍，陳 玥，焦賀靜，李蘊(yùn)玉，李佩國，張志強(qiáng)，張香齋

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島，066600)

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的對(duì)家禽危害較大的一種以垂直及水平傳播的腫瘤性疾病。病毒分類委員會(huì)報(bào)告，ALV類屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科、正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科、甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬[1～3]。AL在我國被列為二類動(dòng)物疫病，國務(wù)院發(fā)布《國家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012～2020年)》將其列為養(yǎng)禽業(yè)必須凈化的疫病之一[4,5]。為盡早達(dá)到國家對(duì)AL凈化的要求，從理論上指導(dǎo)各養(yǎng)殖場(chǎng)防控該病，為此展開綜述。

1 病原學(xué)

1.1 ALV的分類

按照病毒囊膜糖蛋白抗原特異性、病毒干擾試驗(yàn)及宿主范圍將ALV分為A～K 11個(gè)亞群[6,7]，從雞群分離到的有A～E，J，K亞群，其中E亞群為內(nèi)源性病毒，致病性弱或無致病性，其余為外源性病毒，以J亞群傳染性及致病力最強(qiáng)[8]。J亞群是由Payne等[9]于1988年首次從商品代肉用雞中分離。1999年J亞群首次在我國商品代肉雞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)[10]。目前，J亞群在我國各個(gè)品種雞群中均有存在。ALV在臨床上可導(dǎo)致雞發(fā)生淋巴細(xì)胞性AL，成紅細(xì)胞性AL，成髓細(xì)胞AL，髓細(xì)胞樣AL[11,12]。研究表明，J亞群是由外源性ALV和內(nèi)源性ALV重組而成，主要引起傳染性致骨髓細(xì)胞瘤疾病或成髓性白血病[8]。

1.2 ALV的結(jié)構(gòu)特征

ALV是反轉(zhuǎn)錄病毒，具有脂質(zhì)囊膜，病毒粒子為20面體對(duì)稱性的近似球形結(jié)構(gòu)[13]。病毒粒子從外到內(nèi)分為3層結(jié)構(gòu)，外層是來自于宿主細(xì)胞膜的類脂質(zhì)囊膜，在其表面分布有特征性的放射狀突起即纖突，直徑約8 nm；其中間層即為病毒的內(nèi)膜，是一種20面體衣殼，直徑約為60 nm；最內(nèi)層是致密的核心，直徑為35～45 nm，核心結(jié)構(gòu)的組成成分由二倍體 RNA 和核衣殼、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶組成[14]。

1.3 ALV的理化特性

ALV對(duì)外界環(huán)境抵抗力較弱，對(duì)脂溶性溶劑、去污劑和甲醛敏感，但對(duì)紫外線有一定的抵抗力[15]。pH值在4.5～9.0保持穩(wěn)定，不耐高溫，溫度在60 ℃時(shí) 42 s 失活，溫度在56 ℃時(shí)30 min 失活；溫度在37 ℃時(shí)下半衰期為100～540 min，平均為260 min。因此，熱不穩(wěn)定性成為保存病毒最重要的因素。當(dāng)溫度低于-60 ℃以下時(shí)，ALV可保存幾年而不降低感染力，反復(fù)凍融亦可使病毒裂解釋放群特異性抗原p27，進(jìn)而變于ALV的檢測(cè)。

1.4 ALV基因組

ALV基因組是二聚體結(jié)構(gòu)，由單股、正鏈、線性RNA等3種結(jié)構(gòu)組成，全長(zhǎng)約為7.2～7.8 kb。RNA存在于病毒粒子中，但并不具有感染性，兩分子的RNA在各自的5′端由氫鍵相連。除此之外，基因組RNA的一分子還與來自特異宿主的一分子tRNA相連，在反轉(zhuǎn)錄過程中病毒RNA生成DNA的引物。病毒基因組RNA單體結(jié)構(gòu)在反轉(zhuǎn)錄過程中類似于真核細(xì)胞的mRNA，5′端為甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，3′端為 ploy(A)[1，2]。

1.5 ALV蛋白結(jié)構(gòu)

ALV編碼區(qū)主要編碼Gag，Pol及Env蛋白，分別為病毒群特異性和蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶及囊膜糖蛋白[16]。

1.5.1Gag基因編碼的蛋白Gag基因長(zhǎng)約2 100 bp，核苷酸序列高度保守，非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白是ALV內(nèi)部編碼的主要基因之一，由其編碼的蛋白主要分為基質(zhì)蛋白(MA)p19，p10蛋白，衣殼蛋白(CA)p27，核衣殼蛋白(NC)pl4及酶蛋白中的蛋白酶(Pro)p15，其中p19主要起連接作用，p10和早期感染及后期病毒裝配相關(guān)[17]，主要維持病毒粒子的近球形結(jié)構(gòu)。病毒的重要核心組成為p27，它是主要的群特異性抗原，不同亞群之間核苷酸序列高度保守，以此利用ELISA檢查ALV的抗原位點(diǎn)。p14與基因組RNA密切結(jié)合，主要負(fù)責(zé)RNA的加工和包裝，p15主要對(duì)蛋白的前體進(jìn)行剪切，參與Gag和Pol前體蛋白的水解過程，從而生成成熟蛋白質(zhì)，組合病毒粒子。

1.5.2Pol基因編碼的蛋白Pol基因長(zhǎng)約2 600 bp，其內(nèi)部的核苷酸序列非常保守，編碼的主要有反轉(zhuǎn)錄酶(RT)p68和整合酶(IN)p32[18]，p68和p32主要作用是介導(dǎo)ALV的cDNA基因組整合進(jìn)宿主，這一步驟是反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進(jìn)而使Pol基因在ALV侵染宿主細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。

1.5.3Env基因編碼的蛋白Env基因主要對(duì)2種囊膜基因糖蛋白進(jìn)行編碼，即囊膜糖蛋白gp85和跨膜糖蛋白gp37[19]。Env基因主要與病毒的抗原性、致瘤類型及宿主范圍密切相關(guān)，是致瘤的關(guān)鍵基因，不同亞群之間Env基因核苷酸序列差異很大，其中J亞群Env基因與其他亞群核苷酸序列同源性僅為40%左右，而其他亞群間核苷酸序列同源性可達(dá)80%～85%。進(jìn)而說明，在J亞群Env基因中存在J亞群特異性表位抗原[20]。

ALV gp85中有5個(gè)重要區(qū)域，2個(gè)高變區(qū)hr1和hr2，是主要的受體相互作用區(qū)域[21,22]，3個(gè)可變區(qū)vr1，vr2和vr3，vr3在決定受體識(shí)別的特異性中發(fā)揮作用[23]。ALV各亞群間群特異性由2個(gè)高變區(qū)和1個(gè)可變區(qū)(vr3)決定，不同ALV毒株間差異性取決于該3區(qū)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，ALV的hr1，hr2和vr3中，以hr1和hr2區(qū)核苷酸序列變化明顯，親水性較好的為hr1和hr2，這種親水性主要體現(xiàn)為hr2擁有特征性的彎曲回旋結(jié)構(gòu)[24]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，J亞群hr2區(qū)在病毒與宿主細(xì)胞膜表面受體結(jié)合時(shí)發(fā)揮了主要作用，J亞群Env基因呈現(xiàn)高度變異的是hr1和vr3區(qū)，和其他亞群相比，在很大范圍內(nèi)可能有利于J亞群ALV較好地避開宿主的天然免疫[25]。gp85基因中擁有病毒受體決定簇，而且能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，病毒亞群特異性也由其決定，其序列的高度突變可使宿主范圍改變，因此，使ALV得以擁有跨種傳播的潛力[26,27]。

ALV gp37中有3個(gè)功能區(qū)，為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，能夠與gp85相結(jié)合的結(jié)合區(qū)分布于胞外區(qū)，胞外區(qū)具有超螺旋結(jié)構(gòu)，能夠介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜進(jìn)行融合。當(dāng)gp85與宿主細(xì)胞受體進(jìn)行結(jié)合，便會(huì)啟動(dòng)跨膜蛋白一系列結(jié)構(gòu)變化，使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜拉近，進(jìn)而釋放能量使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，由此病毒粒子釋放到宿主細(xì)胞。

2 流行病學(xué)

2.1 宿主范圍

依據(jù)ALV宿主特異性是由囊膜糖蛋白決定的這一特性，從目前的研究中發(fā)現(xiàn)，雞是ALV的自然宿主，宿主范圍包括雉雞、鴿、鷓鴣等一些野鳥類[28～31]。研究ALV持續(xù)帶毒理想的試驗(yàn)動(dòng)物為鴨，給鴨胚接種ALV，其病毒可在鴨胚中存活3年且不出現(xiàn)中和抗體及病毒血癥。

2.2 傳播途徑與傳染源

ALV主要通過垂直和水平兩種方式進(jìn)行傳播，其中以垂直傳播為主[32]。ALV在傳播過程中，傳染源主要為病雞、帶毒雞和被感染的種蛋，而起至關(guān)重要作用的是帶毒雞。病毒繁殖存在于帶毒母雞的整個(gè)生殖系統(tǒng)當(dāng)中，病毒濃度最高的部位為輸卵管，特別是蛋白分泌部，因此產(chǎn)出帶毒雞蛋，孵出的雛雞也攜帶有病毒。這種先天性感染的雛雞常有免疫耐受現(xiàn)象，其不產(chǎn)生抗腫瘤病毒抗體，長(zhǎng)期帶毒排毒，成為重要傳染源。雞群感染ALV后，存在4種血清類型，即無病毒血癥，有抗體；無病毒血癥，無抗體；有病毒血癥，無抗體；有病毒血癥，有抗體。

3 臨床癥狀及病理變化

感染ALV的雞群主要表現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩、高死亡率、免疫抑制及腫瘤多樣性，所感染毒株的不同，所呈現(xiàn)出來的臨床癥狀和病理變化也不一樣，其中最為常見是淋巴細(xì)胞性AL，成年雞易感，產(chǎn)蛋前期發(fā)病率較高[18,25]。病雞表現(xiàn)食欲不振，精神萎靡，雞冠蒼白，消瘦，排灰白色稀糞，腹部膨大。剖檢可見，心、肝、脾實(shí)質(zhì)性器官出現(xiàn)大小不一的腫瘤，呈彌漫性或結(jié)節(jié)形，肝臟腫大。成紅細(xì)胞性AL是較少見的一種類型，臨床上可見的類型有成紅細(xì)胞大量增生型和血液中只含有少量的未成熟的細(xì)胞貧血型，成紅細(xì)胞增生型在臨床當(dāng)中較為常見。病雞表現(xiàn)雞冠蒼白、消瘦、腹瀉、精神不振、全身性貧血。剖檢可見，增生型肝、脾、腎等臟器出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)且呈櫻桃紅色或暗紅色彌漫性腫大。貧血型則表現(xiàn)為內(nèi)臟萎縮，其中以脾臟萎縮最為嚴(yán)重。對(duì)病理組織進(jìn)行切片鏡檢可見，大量的成紅細(xì)胞在骨髓和肝臟的竇狀隙及毛細(xì)血管內(nèi)積聚。成髓細(xì)胞AL是較少發(fā)生的一種類型，主要見于成年雞。臨床可見雞只貧血，消瘦，毛囊出血等。剖檢可見病雞心、肝、脾等實(shí)質(zhì)性器官呈現(xiàn)灰白色彌漫性腫瘤結(jié)節(jié)。髓細(xì)胞樣AL是極少見的一種類型。臨床上可見精神低迷，食欲不佳，消瘦，貧血。病理組織切片鏡下觀察可見骨髓細(xì)胞特異性生長(zhǎng)。

4 診 斷

AL可依據(jù)流行病學(xué)及臨床癥狀和病理變化進(jìn)行初步判斷，但確診需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，主要包括病毒的分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光技術(shù)、快速檢測(cè)試紙條、核酸斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)等[32]。

4.1 病毒分離鑒定

ALV的分離與鑒定被認(rèn)為是最可靠的診斷方法。ALV的分離常選擇的樣品為全血、血漿、血清、雞體多種軟組織及10～11日齡雞胚等[33,34]。病毒的分離一般通過DF-1細(xì)胞或CEF細(xì)胞進(jìn)行，進(jìn)而利用特異性單克隆抗體接種細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)行ALV毒株的分離鑒定[35]。

4.2 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)的特點(diǎn)是靈敏度高，為此，在病原鑒定、流行病學(xué)調(diào)查等一系列生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中廣泛使用。在ALV鑒別診斷上，Kim Y等[36]于2012年將反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)半定量(QC-RT-PCR)方法應(yīng)用到 ALV-J 的實(shí)時(shí)檢測(cè)中。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)

ELISA是在臨床上應(yīng)用較普遍的檢測(cè)方法。其原理是將群特異性抗原血清中的抗體利用熒光標(biāo)記處理或酶處理，制作成熒光抗體或酶標(biāo)抗體檢測(cè)群特異性抗原。1979年，英美等國相繼報(bào)道了利用ELISA方法檢測(cè)ALV，我國于1991年起開展了雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)ALV[37]。當(dāng)前，市場(chǎng)上有許多針對(duì)ALVp27抗原及ALV-A,B,J抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒，不同廠商間的試劑盒靈敏度和特異性存在差異。在凈化進(jìn)程中，由于p27抗原是ALV所有群均具有的，不區(qū)分內(nèi)源性病毒和外源性病毒，所以，直接對(duì)胎糞、蛋清等樣品進(jìn)行ALV p27抗原的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。因此，結(jié)合病毒分離鑒定更為可靠有效。

4.4 間接免疫熒光技術(shù)

2001年，秦愛建等[35]通過制備ALV-J特異性單克隆抗體建立了免疫熒光檢測(cè)ALV-J抗原和抗體的方法，且能夠保證檢測(cè)方法均具有高度特異性。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)適用于樣品數(shù)量較少時(shí)，進(jìn)而代替ELISA，降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。免疫熒光技術(shù)在檢測(cè)ALV疑似病例及雞體器官腫瘤方面起到了重大作用。

4.5 快速檢測(cè)試紙條

快速檢測(cè)試紙條是采用膠體金免疫層析技術(shù)以硝酸纖維膜為固相載體，其中的示蹤標(biāo)記為膠體金，使得抗原與抗體能夠形成免疫復(fù)合物從而顯色的一種檢測(cè)技術(shù)。崔賀等[38]通過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膠體金試紙條的檢出率遠(yuǎn)低于ELISA試劑盒檢出率，目前膠體金試紙條還無法完全替代ELISA檢測(cè)試劑盒。

4.6 核酸斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)

核酸斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)是將獲得的DNA點(diǎn)于尼龍膜上變性固定，最后與用地高辛標(biāo)記的探針對(duì)ALV各個(gè)亞群的特異性探針雜交，通過是否著色進(jìn)行檢測(cè)樣品當(dāng)中的病毒基因序列，進(jìn)而判斷是否感染ALV[24,26]。該方法不僅區(qū)分外源性病毒和內(nèi)源性病毒，還可以區(qū)分A，B和J亞群。其利用的是特異性核酸探針交叉斑點(diǎn)試驗(yàn)具有方法簡(jiǎn)便快速、特異、靈敏、結(jié)果直觀等特點(diǎn)，在診斷ALV中具有重要意義。

目前，確診雞群中是否感染ALV的常用的方法主要是PCR技術(shù)，ELISA，間接免疫熒光技術(shù)等。

5 防 控

5.1 加強(qiáng)檢疫，控制垂直傳播

目前，對(duì)ALV還沒有合適的疫苗和有效的藥物可用來對(duì)抗，因此，只有早期檢測(cè)及嚴(yán)格淘汰種雞，經(jīng)過持久地凈化從而達(dá)到種群純凈的目的[39,40]。國際凈化AL的金標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)核心雞群在68日和168日齡分2次全部采用血漿接種DF-1細(xì)胞，培養(yǎng)9 d后檢測(cè)p27抗原，陽性淘汰，對(duì)于留種的下一代進(jìn)行1日齡胎糞檢測(cè)，淘汰同一家系的陽性雞，如此反復(fù)進(jìn)行。世界上各大型種禽場(chǎng)對(duì)ALV已基本達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。然而，我國基于的現(xiàn)狀是養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量多、分散，尤其自繁自養(yǎng)的地方雞種群ALV感染問題相當(dāng)嚴(yán)峻。在面對(duì)我國基本國情及雞群品種復(fù)雜的條件下，我國也制定了適用于原種雞場(chǎng)AL凈化體系，形成了國家標(biāo)準(zhǔn)《原種雞群禽白血病凈化檢測(cè)規(guī)程》，各地方在國家標(biāo)準(zhǔn)的前提下，制定了適合本地區(qū)的凈化方案，許多種雞場(chǎng)也在積極開展地方品種雞和培育的黃羽肉雞、蛋用型雞的AL凈化工作，并取得了一定成效，如張桂枝等[41]報(bào)道，河南省某地方品種核心雞群經(jīng)過2個(gè)世代的ALV凈化，其ALVp27 抗原陽性率由20.06%下降到4.73%，ALV分離陽性率由13.04%降低到2.17%。張銳等[42]采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析了全國297個(gè)規(guī)模養(yǎng)雞場(chǎng)疫病凈化對(duì)其后代繁育的影響，結(jié)果顯示，與未凈化雞場(chǎng)比較，已凈化雞場(chǎng)的日最高產(chǎn)蛋率、種蛋合格率、種蛋受精率、受精蛋孵化率分別比提高了1.091%，1.090%，0.892%，0.528%。

5.2 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，控制水平傳播

除了控制好垂直傳播，AL的水平傳播也不可忽視。根據(jù)ALV感染的機(jī)率及結(jié)合AL的特點(diǎn)，水平傳播主要發(fā)生在孵化期間和出雛后的前兩周內(nèi)，在出雛廳的雌雄鑒別、免疫及苗箱之內(nèi)雛雞啄食胎糞等機(jī)率都會(huì)增加。因此，控制水平傳播關(guān)鍵是控制好孵化、出雛、生產(chǎn)和免疫等環(huán)節(jié)。對(duì)原種雞群應(yīng)采取單家系入孵與出雛，并按家系單籠飼養(yǎng)，雞籠間加紙板阻隔，實(shí)現(xiàn)籠與籠之間“只聞雞鳴，不見雞面”，避免直接接觸。所用疫苗應(yīng)嚴(yán)格檢測(cè)，堅(jiān)持應(yīng)用安全高效的生物制品，杜絕禽白血病病原感染，不同家系的免疫應(yīng)更換針頭，避免注射器傳播。

5.3 加強(qiáng)抗病育種研究，培育抗AL的種雞群

從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，通過抗AL的育種研究，提高雞對(duì)ALV的抗性，才能從根本上控制AL的發(fā)生。目前，研究確定tva，tvb，tvc和tvj4個(gè)常染色體基因分別控制A，B，C，D，E，和J亞群的易感性[43]。通過探索各亞群受體基因遺傳多樣性情況，進(jìn)而培育出具有抗AL的雞群。

6 展 望

AL是嚴(yán)重危害家禽生產(chǎn)的重要種源性疫病。目前，對(duì)AL還沒有合適的疫苗和有效的藥物加以對(duì)抗，現(xiàn)階段控制ALV最有效的途徑就是凈化。因此，探索一條既科學(xué)又經(jīng)濟(jì)實(shí)用的凈化程序以及研發(fā)抗禽白血病的藥物、核酸疫苗和AL抗病育種遺傳資源的開發(fā)將是今后研究方向。