番茄遺傳圖譜與基因定位研究進展

杜海東，游 茜，李毅豐，毛秀杰，張 寧，王 帥

(河北科技師范學院園藝科技學院，河北 秦皇島，066600)

番茄(SolanumlycopersicumL.)是研究植物遺傳學、分類學、生理學、分子生物學等學科的重要實驗材料?，F(xiàn)階段番茄育種目標主要集中在：增產(chǎn)量、提品質(zhì)、多抗性、促早熟等[1]。但傳統(tǒng)育種技術(shù)對土地面積需求較大、容易受外界環(huán)境條件影響、育種效率低、周期長；而分子標記輔助選擇(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)育種可以在分子水平上直接反應(yīng)遺傳本質(zhì)的優(yōu)點，快速、準確地篩選出目標性狀，縮短育種時間，加快種質(zhì)資源創(chuàng)新進程。分子標記輔助選擇育種將會成為現(xiàn)代作物遺傳育種的主要潮流，而獲得與目的基因緊密連鎖的分子標記是分子標記輔助選擇育種的重要基礎(chǔ)，實現(xiàn)這一目標的主要手段便是構(gòu)建高密度遺傳圖譜[2]。

遺傳圖譜是依據(jù)染色體交換與重組，以多態(tài)性的遺傳標記為“路標”，以標記間重組率為“圖距”，確定不同多態(tài)性標記位點在每條連鎖群上排列順序和遺傳距離的線性連鎖圖譜[3，4]。高密度、高分辨率遺傳圖譜的構(gòu)建是進行基因定位、基因克隆、基因結(jié)構(gòu)與功能研究和標記輔助選擇育種的前提。

構(gòu)建遺傳圖譜包括：(1)選擇用于建立作圖群體的親本組合；(2)構(gòu)建研究所需的暫時或永久性作圖群體；(3)選擇合適的對群體基因型進行鑒定的多態(tài)性分子標記；(4)對標記基因型數(shù)據(jù)進行連鎖分析，應(yīng)用作圖軟件繪制遺傳圖譜[5]。

1 番茄遺傳圖譜的研究

1.1 基于AFLP，RAPD，SSR，RFLP等分子標記的遺傳圖譜

早在1926～1931年間，MacArthur開始繪制番茄遺傳圖譜，但只鎖定了20個基因的近似位置。20世紀80年代初，Rick以同工酶為標記繪制了番茄經(jīng)典遺傳圖譜，鑒定出300多個遺傳標記，但都是基于形態(tài)、細胞等標記所構(gòu)建的遺傳圖譜，標記數(shù)量少、多態(tài)性低、極大限制了其應(yīng)用。

Tanksley等[6]以普通栽培番茄VF36-Tm2a和潘娜麗番茄LA716為親本，通過雜交獲得的67株F2群體，以RFLP標記技術(shù)為主，使用軟件繪制了番茄第一張總長1 276 cM，含有1 030個遺傳標記，標記間平均距離1.2 cM，覆蓋12個連鎖群組成的高密度遺傳圖譜。該圖譜與之前所構(gòu)建的經(jīng)典圖譜相比：圖距縮小，標記密度顯著提升，同時也帶動更多遺傳圖譜的研究如雨后春筍般地在全世界范圍內(nèi)開展起來。

Grandillo等[7]以優(yōu)良加工品系(CV'M82-1-7')和近緣野生種(LA1589)雜交后代BC1群體(257株)，將120個標記(115個RFLP，3個RAPD和2個形態(tài)標記)定位于總長1 279 cM，標記間平均距離為10.7 cM的遺傳圖譜。Foolad等[8]以鹽敏性番茄UCT5和耐鹽性番茄LA716為研究材料，利用RAPD標記構(gòu)建了包括53個RAPD標記的遺傳圖譜。Fulton等[9]基于LA925和LA716雜交獲得的80株F2代群體建立了一張名為“Tomato-EXPEN2000”的遺傳圖譜，包括1 342個RFLP，1 070個CAPS，19個SNP和155個SSR標記，較好地覆蓋了番茄的12條染色體。該圖譜還包括基于ESTs數(shù)據(jù)庫和擬南芥全基因組比較的COS標記，比較了番茄與擬南芥基因組的同線性關(guān)系。Liu等[10]采用SSR標記方法以栽培番茄XF98-7與野生醋栗番茄LA2184進行雜交，對一個單株的F3中選出143個單株構(gòu)建了一張長度為808.4 cM，平均長度7.22 cM，含有112個標記的遺傳圖譜。

1.2 基于高通量測序技術(shù)的遺傳圖譜

隨著高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，在遺傳圖譜構(gòu)建中充分展現(xiàn)了成本低、速度快、高通量、開發(fā)的標記分布廣、密度大、多態(tài)性高等特點，以及2012年番茄‘Heinz 1706’基因組的數(shù)據(jù)公布，極大地促進了番茄在許多領(lǐng)域的研究發(fā)展。通過轉(zhuǎn)錄組測序、全基因組重測序、簡化基因組測序等技術(shù)發(fā)掘分子標記為構(gòu)建高密度遺傳圖譜提供了新思路、新方法[11]。

Sim等[12]以426份番茄材料通過轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)了8 784個SNP位點，并利用其構(gòu)建了3個種間F2群體的高密度遺傳圖譜。Chen等[13]以番茄T3224(感病親本)與L3708(抗病親本)獲得的F2∶3為作圖群體，基于酶切簡化基因組測序技術(shù)構(gòu)建了包含440個多態(tài)性標記的遺傳圖譜，該圖譜覆蓋12個連鎖群，標記平均間隔3.56 cM，并在L3708的2號染色體上鑒定出一個新的抗晚疫病QTL位點。Lin等[14，15]基于全球收集的360份番茄種質(zhì)資源進行全基因組重測序，構(gòu)建了完整的遺傳變異圖譜，揭示了番茄果實由小變大的兩次進化歷程、果皮顏色變異的關(guān)鍵位點和調(diào)控果實營養(yǎng)和風味物質(zhì)的重要遺傳位點，為番茄的基因挖掘和分子育種奠定了基礎(chǔ)。

劉希艷[16]利用醋栗番茄(PI365967)和普通番茄(Moneymaker)為親本構(gòu)建含有211個株系的RIL群體，利用全基因組測序技術(shù)發(fā)掘到22 570個重組bin，選擇其中的1 800個bin，采用繪圖軟件繪制了一個總長1 194.08 cM，平均圖距0.66 cM，包含了12個連鎖群的高密度遺傳圖譜。Gonda等[17]基于簡化基因組測序技術(shù)對栽培品種NCEBR-1和野生番茄LA2093雜交獲得的包含148個單株的RIL群體，構(gòu)建了基于bin高分辨率遺傳圖譜。該圖譜包含了在12條染色體上的2 869個bin，全長超過1 362 cM，標記間平均間隔距離僅為0.48 cM，并利用該圖譜對RIL群體中兩個果實品質(zhì)性狀(果實質(zhì)量和番茄紅素含量)的QTL進行了驗證和優(yōu)化。Wen等[18]以熱敏感番茄LA1698和耐熱番茄LA2093構(gòu)建的200株F2群體進行繪制遺傳圖譜，該圖譜全長1 503.82 cM，平均距離10.98 cM，包含12個連鎖群的137個位點。

2 番茄重要性狀基因定位研究

利用遺傳圖譜對一個或多個數(shù)量性狀進行基因定位，可以快速、有效地確定控制該性狀的基因位點在染色體上的具體位置及基因間的相互作用，為基因克隆奠定基礎(chǔ)。

2.1 葉色相關(guān)性狀基因定位

葉片是綠色植物積累有機物的場所，貫穿植株整個生命周期，對植株的生長發(fā)育具有不可或缺的作用，而葉片顏色的變化不僅決定地上部的外觀，而且通過改變光吸收來影響光合效率，而光吸收反過來又可以影響作物的產(chǎn)量[19，20]。

目前，關(guān)于番茄葉色突變基因定位研究已有很多研究報道，宋麗華[21]通過構(gòu)建近等基因系群體，利用CAPS和InDel標記對黃葉基因nv進行定位，nv基因被定位于9號染色體InD-09-4-1和HP63/64兩標記之間，物理距離為51 Mb，并結(jié)合基因組重測序分析技術(shù)，篩選出12個候選基因。郭麗杰[22]發(fā)現(xiàn)一株雜色葉突變體，該突變體在30 d左右苗齡期開始逐步發(fā)生葉色變化，后期葉片出現(xiàn)部分白色斑駁，隨著秧苗的生長具有白色斑駁的葉片增多，秧苗后期長勢弱，直至死亡。通過普通栽培番茄與突變體構(gòu)建F2代遺傳分離群體，利用CAPS和InDel標記技術(shù)對突變體vg基因進行精細定位，鑒定出目的基因位于7號染色體上S6027和Ba6040兩標記間128 kb的區(qū)域內(nèi)。

2.2 果實相關(guān)性狀基因定位

2.2.1果實質(zhì)量與形態(tài) 番茄果實質(zhì)量的變化，一直是眾多學者研究的焦點。栽培番茄在很長一段時間內(nèi)是通過野生番茄進化而來，并經(jīng)歷了從南美地區(qū)到世界各地區(qū)的復(fù)雜遷移模式。總的來說，栽培番茄的進化可以被認為有兩個階段：早期馴化階段和后期改良階段[23]。許多與番茄果實發(fā)育相關(guān)的遺傳和分子機制已被闡明，并且通過基因定位方法鑒定出近30多個控制果實質(zhì)量的QTL位點。然而，只有少數(shù)處于QTL位點內(nèi)的基因被克隆，如fw2.2，fw3.2，fw11.3，lc，fas。在這些被克隆的基因中，fw2.2和fw3.2是調(diào)控細胞分裂的必需基因，fw11.3在調(diào)控細胞大小中起著重要作用，而fas和lc則是通過改變心室數(shù)目來調(diào)控果實大小的變化。

Illa-Berenguer等[24]利用QTL-seq對番茄果實質(zhì)量變化的3個F2群體(12S139，12S141和12S143)進行QTL定位。共檢測到3個控制果重的QTL位點(fw1.1，fw3.3，fw11.2)，其中fw11.2被精細定位到第11號染色體上的一個750 kb的區(qū)域內(nèi)。該區(qū)域包含66個候選基因，編碼一系列蛋白，如DNA-RNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、酶和許多功能未知的蛋白質(zhì)。Qi等[25]鑒定并克隆到一個新的控制番茄果實質(zhì)量的基因(CSR)，該基因編碼一個未知的蛋白，CSR發(fā)生變異后會導(dǎo)致番茄果皮細胞增大，果實質(zhì)量增加，果肉豐滿多汁。這項研究結(jié)果不僅揭示了番茄人工馴化的分子機制，還為番茄果實大小的遺傳改良提供了新思路。Li等[26]采用全基因組關(guān)聯(lián)法對288份番茄材料進行果實質(zhì)量性狀的關(guān)聯(lián)分析，鑒定到GRAS2基因在調(diào)控果實質(zhì)量性狀中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)，GRAS2在番茄果實發(fā)育初期表達活躍，尤其在胚珠部位表現(xiàn)更為明顯。而抑制GRAS2表達的轉(zhuǎn)基因植株，則表現(xiàn)為果實發(fā)育受阻，果重降低、單果種子數(shù)目減少、花器官變小等性狀，這為后續(xù)研究胚珠與果實發(fā)育的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

Fernando等[27]利用高通量測序和CRISPR/Cas9基因編輯方法，識別到一個決定番茄果實質(zhì)量的基因開關(guān)(ENO)，它是一種調(diào)節(jié)花分生組織活性的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子。遺傳分析表明，在栽培番茄的馴化過程中，ENO與子房數(shù)(編碼WUS)和束狀(編碼CLV3)基因座的突變具有協(xié)同效應(yīng)，這兩個基因座是果實質(zhì)量進化的兩個中心因子。在馴化過程中，ENO啟動子的順式調(diào)節(jié)突變是正向選擇的靶點，為番茄果實質(zhì)量的顯著增加奠定了基礎(chǔ)。

蔬菜的果實形態(tài)是作物多樣化或改良過程中的另一個重要性狀，它不僅能滿足人們的好奇心，而且還可以區(qū)分不同作物品種。在番茄中，大而圓的果實在商場中很受歡迎，而細長或塊狀的果實則受到加工業(yè)的青睞。

迄今為止，已在番茄中確定出多個控制果實形狀的基因，其中包括長果形、束狀形和圓形等，果形主要受sun，ovate，sov1，fs8.1，fas和ovate等6個基因座所控制，而sun，ovate和sov1基因已經(jīng)被克隆。

Xu等[28]認為SlCLV3(Solyc11g071380)基因是fas位點的基礎(chǔ)，其突變被證明是由于在SlCLV3基因上游有一個294 kb片段發(fā)生倒位致使SlCLV3發(fā)生弱表達引起的。番茄CLV3基因編碼擬南芥CLV3的一個同源基因，它可以與受體激酶CLV1結(jié)合。當CLV3與CLV1相結(jié)合，CLV1會抑制WUS的表達并減少細胞過度增殖；同時，WUS的表達可以促進CLV3的轉(zhuǎn)錄。因此，fas，CLV3的低表達導(dǎo)致WUS的過度表達，從而增加了子房數(shù)量，最終產(chǎn)生了一個束狀的番茄果實。Sun等[29]對控制番茄果實細長形狀的主要QTL-fs8.1進行精細定位，將fs8.1定位于第8號染色體長臂的3.03 Mb區(qū)間，并在fs8.1區(qū)域發(fā)現(xiàn)122個基因，其中存在6個差異表達基因。后期通過基因組序列分析，確定了12個候選基因作為fs8.1的基礎(chǔ)。Wu等[30]通過克隆、蛋白互作和基因組編輯等技術(shù)，克隆到一個位于sov1基因座內(nèi)的新基因—OFP20，并認為sov1可能是OFP20上游調(diào)控區(qū)發(fā)生31 kb缺失，致使該基因降低表達豐度，從而導(dǎo)致果實伸長。

2.2.2果實品質(zhì) 隨著社會經(jīng)濟發(fā)展水平的提高，消費者對果實品質(zhì)特別是果實風味的要求日益提高，糖類和酸類物質(zhì)在植物界中廣泛存在，在品質(zhì)形成方面發(fā)揮著重要作用。

王紹會[31]利用野生番茄(LA0317)和普通栽培番茄(9706)為親本的后代群體BC2S7和BC2S8，對果實中可溶性固形物含量進行了定位分析。結(jié)果表明：在這兩個群體中共被定位到9個QTL位點，可解釋大約10%的表型變異率。其中qssc-9-1與Brix9-2-5的位置完全相符，同屬于一個位點，并發(fā)現(xiàn)該基因來源于S.galapagense。趙建濤[32]以174份番茄種質(zhì)為材料，對果實中含有的主要糖酸組成成分進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共鑒定出139個顯著關(guān)聯(lián)位點，其中與檸檬酸顯著關(guān)聯(lián)的位點有38個；與蘋果酸顯著關(guān)聯(lián)的位點共有5個；與脯氨酸顯著關(guān)聯(lián)的位點有4個；與葡萄糖酸顯著關(guān)聯(lián)的位點只有1個；與琥珀酸顯著關(guān)聯(lián)的位點有20個，對番茄的品質(zhì)育種具有重要參考價值。

Ye等[33]基于代謝產(chǎn)物的全基因組關(guān)聯(lián)、連鎖圖譜和基因功能研究相結(jié)合，定位到TFM6是調(diào)控番茄果實蘋果酸積累的主要QTL，其編碼一個鋁激活蘋果酸運轉(zhuǎn)蛋白ALMT9，該基因位于細胞膜內(nèi)。通過進一步研究表明，ALMT9啟動子區(qū)的一個3-bp Indel與蘋果酸含量完全連鎖。而該Indel破壞了ALMT9啟動子中的W-box元件結(jié)合位點，該位點阻止了WRKY轉(zhuǎn)錄抑制因子WRKY42的結(jié)合，從而減輕了ALMT9表達的抑制，促進了蘋果酸的大量積累。此外，鋁處理后，液泡膜局部ALMT9的表達豐度增加，從而提高蘋果酸轉(zhuǎn)運和增強對鋁的抗性。此項研究首次揭示了ALMT基因在番茄品質(zhì)形成和抗性方面的雙重作用，ALMT9可能是番茄馴化和改良過程中的關(guān)鍵基因，為改善番茄風味品質(zhì)和抗性方面的研究提供了基礎(chǔ)，具有重要的科學意義。Wang等[34]通過3個櫻桃番茄品種發(fā)現(xiàn)了SLMYB12基因的表達與黃酮醇的合成高度相關(guān)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗證了SLMYB12基因發(fā)生超表達后，黃酮醇含量顯著增加。因此，認為SLMYB12基因在櫻桃番茄中黃酮醇的合成途徑起著正向調(diào)控作用。

2.3 抗病相關(guān)性狀基因定位

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)屬于DNA雙生病毒，對許多重要作物造成嚴重危害。被其侵染后會導(dǎo)致葉片生長發(fā)育遲緩、異常，包括葉緣卷曲、葉面積縮小、葉片黃化脫落等[35]。目前關(guān)于TYLCV的抗性基因已經(jīng)被報道，包括Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4和Ty-5。了解TYLCV及其相關(guān)種的發(fā)病機制，有助于制定新的防控措施，解決病毒入侵和傳播的關(guān)鍵問題。

董淑芳[36]利用含有Ty-2基因的材料與易感材料構(gòu)建了1 320株F2代分離群體，對Ty-2基因進行精細定位，并預(yù)測到了21個候選基因，其中Solyc11g069620.1含有NB-ARC類保守結(jié)構(gòu)域，重點將Solyc11g069620.1作為Ty-2的候選基因。Wang等[37]基于高抗TYLCV材料(AVTO1227)和高感TYLCV材料(Money maker)構(gòu)建F2和BC1群體用來評估抗病遺傳機制，并鑒定到一個與SlNACI連鎖的隱性抗病基因(Ty-5)。對子代的抗、感材料進行BSA定位，在4號染色體2.22-3.19 Mb區(qū)間定位到TYLCV抗病基因。利用定位區(qū)間標記將抗病基因進行進一步定位在Ty5-25～Ty5-29(14.5 kb)標記之間，且該區(qū)間只有1個pelota基因，因此將該基因作為Ty-5的候選基因。

番茄葉霉病是一種危害植株的葉、莖、果實的病害，由活體營養(yǎng)菌(Cladosporium fulvum，C.fulvum)引起的病害，在溫室、大棚等保護地栽培時經(jīng)常發(fā)生，嚴重威脅著番茄的生產(chǎn)。番茄的Cf系列基因(Cf-2，Cf-4，Cf-5，Cf-9，Cf-10，Cf-12和Cf-19)是一類重要的葉霉病抗性基因，可與C.fulvumAvr基因相匹配，激活防御基因的表達。Cf-19基因在1980年被定位在2號染色體的長臂上，之后對于該基因的研究一直處于停滯狀態(tài)，嚴重影響了Cf-19基因在育種中的應(yīng)用。Zhao等[38]利用含有Cf-19基因的抗葉霉病番茄品種CGN18423和易感病品種Money Maker分別構(gòu)建F1，F(xiàn)2和F3群體，通過各世代群體進行抗病性鑒定，結(jié)果顯示含有Cf-19的抗病材料的抗病性是由顯性單基因所控制，遺傳模式符合孟德爾遺傳定律。通過SLAF-seq技術(shù)、基因功能注釋、分子標記開發(fā)和表達模式驗證等多種手段結(jié)合，將Cf-19基因定位1號染色體短臂的2.14 Mb區(qū)間內(nèi)，獲得了7個候選基因。根據(jù)熒光定量PCR分析結(jié)果，在全部7個候選基因中有2個Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1表現(xiàn)出與抗病應(yīng)答過程相關(guān)的表達模式。其中，Solyc01g006550.2.1位于Cf-4/Cf-9基因位點之上，為Cf-10的等位基因。Lui等[39]根據(jù)F1，F(xiàn)2與BC1F1抗病與感病材料的表型證明番茄葉霉病菌抗性受顯性單基因控制；通過對F2群體的抗/感病重測序，聯(lián)合運用SNP-index與InDel-index的分析方法將Cf-10定位在Chr1上的3.29 Mb區(qū)間內(nèi)。并利用在此區(qū)間開發(fā)的KASP標記進行精細定位，將Cf-10的定位區(qū)間縮短到790 kb，其中只有1個候選基因Solyc01g007130.3，此基因注釋為1個含有LRR的受體蛋白激酶。最后通過RT-qPCR分析進一步驗證Solyc01g007130.3為Cf-10候選基因，為克隆Cf-10基因奠定了堅實的基礎(chǔ)。

2.4 其他農(nóng)藝性狀基因定位

Takisawa等[40]利用具有單性結(jié)實特性的番茄品種MPK-1與具有非單性結(jié)實的品種Micro-Tom構(gòu)建了F4群體，對Pat-k基因進行精細定位。Pat-k被定位于1號染色體兩個標記間的529 kb區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域包含60個候選基因。通過全基因組重測序和MPK-1基因組序列分析，確定了MPK-1中的SlAGL6基因是被一個反轉(zhuǎn)座子插入而失活，從而造成番茄發(fā)生單性結(jié)實。田小琴[41]利用F2群體構(gòu)建遺傳圖譜對番茄花序的間隔節(jié)位進行定位研究，共發(fā)現(xiàn)了2個QTL(qN1SU-1-1和qN1SU-1-2)位點，2者的遺傳貢獻率可解釋45%的表型變異率。劉星雨[42]對番茄葉片夾角進行定位研究，研究表明：番茄葉片夾角性狀是由2個主效QTL(LA1-1和LA1-2)位點所控制的，2者的遺傳貢獻率分別為18.7%和22.5%。并推測Solyc10g008620，Solyc10g008970，Solyc10g008990，Solyc10g009055可能是LA1-1的候選基因；Solyc10g054760可能是LA1-2的候選基因。Ye等[43]發(fā)現(xiàn)番茄莖稈的粗壯程度與果實大小之間存在顯著相關(guān)性，基于GWAS和基因功能分析等方法定位到1個控制番茄莖粗的主效QTL(SDR9)，該位點編碼1個激酶互作蛋白SD1。通過顯微鏡觀察，SD1主要在莖稈的形成層部位表達，它通過調(diào)控次生韌皮部細胞的大小和數(shù)量來正向調(diào)控番茄莖稈發(fā)育。

3 展 望

自2012年番茄全基因組序列公開發(fā)表以來，已被用于篩選、鑒定與果實發(fā)育和成熟過程相關(guān)的候選基因、番茄序列的數(shù)據(jù)庫和生物信息學研究，并作為其他茄科植物的參考基因組。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，在全基因組水平上開發(fā)分子標記以構(gòu)建高密度遺傳圖譜成為可能。為進一步推動番茄遺傳圖譜和基因定位的深入研究，建議在以下3方面加強工作：(1)構(gòu)建更高密度和標記分布更均勻的遺傳圖譜，以滿足番茄分子遺傳研究的要求；(2)對番茄遺傳育種上具有重要價值的性狀基因進行深入研究，促進分子標記輔助育種的發(fā)展；(3)對現(xiàn)有的番茄遺傳圖譜進行整合，以提高番茄遺傳圖譜的通用性。通過構(gòu)建高密度遺傳圖譜，對相關(guān)性狀基因進行精細定位，促進分子標記輔助育種快速發(fā)展，加快育種進程。