自噬在脊髓細胞中的作用與機制研究進展

朱 寧，楊新明，張 瑛

(1.河北北方學(xué)院研究生院，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科，河北 張家口 075000)

脊髓損傷后因運動神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元被破壞可導(dǎo)致截癱和四肢癱瘓，是脊柱外科常見的復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全亞洲脊髓損傷平均年患病約為12.1～61.6人次/100萬，中國脊髓損傷年患病約為37人次/100萬[1]。由于尚無有效的治療方法，脊髓損傷的致殘率及致死率較高。脊髓損傷中多種細胞參與自我修復(fù)過程，大致分為3大類：①神經(jīng)元細胞；②神經(jīng)膠質(zhì)細胞，如星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞；③其他細胞，如血管內(nèi)皮細胞和血源性巨噬細胞[2]。脊髓損傷相關(guān)研究多集中在神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞。現(xiàn)綜述脊髓損傷后自噬在不同類型細胞中作用機制的研究進展及自噬對受損組織的影響。

1 脊髓損傷病理生理機制

墜落、暴力襲擊、車禍、工傷事故等原因可導(dǎo)致脊柱分離錯位，脊髓受到壓迫或離斷，可導(dǎo)致細胞壞死、軸突物理性橫斷及損傷部位局部血管丟失，該過程被稱為原發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷導(dǎo)致炎性細胞如巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞、T細胞和中性粒細胞浸潤病變區(qū)域，釋放出TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等炎性因子[3]，浸潤的巨噬細胞，嗜中性粒細胞和活化的小膠質(zhì)細胞參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進自由基形成，導(dǎo)致細胞和亞細胞器細胞膜正常磷脂結(jié)構(gòu)過氧化，結(jié)構(gòu)紊亂，加重神經(jīng)損害[4]。此外，細胞釋放谷氨酸產(chǎn)生谷氨酸興奮性毒性，離子失衡，進一步導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡[5]。細胞死亡的3種常見類型為細胞凋亡、自噬性細胞死亡和細胞壞死。

2 細胞自噬

自噬是一種細胞自我保護機制，通過自噬體-溶酶體途徑降解和再循環(huán)胞內(nèi)物質(zhì)，如受損細胞器、有毒物質(zhì)、錯誤折疊蛋白質(zhì)等，在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[6-7]。多數(shù)細胞中自噬發(fā)生在基礎(chǔ)水平，但在環(huán)境壓力、營養(yǎng)缺乏或急性細胞損傷等不利條件下，自噬會被進一步激活，膜結(jié)構(gòu)包繞細胞質(zhì)成分，包括受損的細胞器和蛋白質(zhì)，自噬小體形成，自噬小體在細胞內(nèi)運輸并與溶酶體融合，溶酶體水解酶降解自噬體的內(nèi)膜和自噬體中包含的細胞成分[8]。LC3、Beclin1和p62通常用于監(jiān)測脊髓損傷中細胞自噬的活性，細胞中存在兩種剪切形式的LC3蛋白：LC3I和LC3II，當(dāng)發(fā)生自噬時，LC3I發(fā)生類泛素化，并與自噬體液泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合，形成與自噬液泡膜結(jié)合的LC3II。因此，LC3II的表達或LC3II/LC3I的比率可作為反映自噬泡數(shù)目的直接指標(biāo)[9-10]。此外，自噬前體中需要Beclin1-Vps34-Vps15核心復(fù)合物，Beclin1參與自噬前體構(gòu)成，且Beclin1的表達與自噬體活性密切相關(guān)[11]。由于自噬是降解受損細胞器和有害蛋白質(zhì)的動態(tài)機制，因此檢測降解標(biāo)記具有重要意義，例如，p62也稱為Sequestosome 1(SQSTM1)，通過與LC3結(jié)合摻入自噬體，隨后通過自噬降解，因此p62水平可用于評估自噬通量[12]。

2.1 自噬在脊髓損傷后神經(jīng)元中的作用

神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本單位，大多數(shù)神經(jīng)元具有細胞體、軸突和樹突。中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷導(dǎo)致進行性繼發(fā)性損傷過程包括神經(jīng)元細胞死亡和軸突損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。神經(jīng)元自噬的變化取決于損傷模型和嚴重程度。脊髓缺血后，LC3II/LC3I和Beclin1表達的比率均增加，分別在8 h(早期)和72 h(晚期)達到兩次峰值，然后緩慢降低至基線[13]。在嚴重脊髓挫傷模型中，Beclin1和LC3II的表達水平在1 h開始上升，2 h達到峰值，并在24 h逐漸下降至接近正常水平[14]；在小鼠脊髓半切模型中，術(shù)后6 h可觀察到自噬改變[15]；在脊髓壓迫損傷模型中，自噬相關(guān)蛋白LC3B及p62表達在脊髓損傷后第1天達到峰值，然后在第7天下降[16]。

通過免疫組織化學(xué)法染色觀察脊髓背角、前角、背柱和腹側(cè)白質(zhì)神經(jīng)元，研究發(fā)現(xiàn)損傷后LC3陽性細胞和p62陽性細胞的總數(shù)均顯著提高。自噬體積累程度與損傷部位接近程度相關(guān)。從受傷后第1天開始，在白質(zhì)中，LC3和p62陽性細胞集中在靠近損傷區(qū)域的背側(cè)；在灰質(zhì)中，LC3和p62陽性細胞優(yōu)先集中在前角區(qū)域，可能原因是自噬通量受損，導(dǎo)致自噬小體在脊髓損傷后積累[17]。同時，自噬受損的運動神經(jīng)元也表達了更高水平的凋亡相關(guān)蛋白caspase 12和cleaved caspase 3，表明與溶酶體損傷誘導(dǎo)的自噬功能障礙可導(dǎo)致脊髓損傷后神經(jīng)元細胞死亡[16]。

一些學(xué)者研究了自噬體在神經(jīng)元中的運輸。在沒有饑餓或環(huán)境壓力的基礎(chǔ)條件下，自噬體主要在突觸前末端和遠端軸突中產(chǎn)生，其膜和蛋白來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而不是胞漿或線粒體[18]。動作電位后，通過胞吐作用將神經(jīng)遞質(zhì)由突觸前膜釋放，此時突觸囊泡與質(zhì)膜融合，因此，突觸小泡循環(huán)可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)和其他膜成分的積累，這些蛋白質(zhì)和其他膜成分需要通過自噬進行降解和再循環(huán)，以維持神經(jīng)傳遞的效率并促進突觸的可塑性[7]。在神經(jīng)元中，與非神經(jīng)元細胞不同，自噬體的形成及其與溶酶體融合后的轉(zhuǎn)運在空間上是分離的，因為自噬體在遠端軸突中形成，并沿微管逆行轉(zhuǎn)運至細胞體,與細胞體溶酶體結(jié)合[19]。自噬體以依賴于動力蛋白的方式逆行運輸至胞體[20-21]，并與溶酶體融合[22]。盡管許多神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)元自噬缺陷有關(guān)，但神經(jīng)元自噬體的功能目前未被完全了解。最近的一項研究表明自噬體可將神經(jīng)營養(yǎng)信號從突觸前末端傳遞至細胞體，例如，包含腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)整合遠端軸突的TrkB/BDNF信號，進而控制BDNF的表達。這些發(fā)現(xiàn)突顯了突觸前末端自噬與BDNF/TrkB信號傳導(dǎo)之間的聯(lián)系[23]。

2.2 自噬在脊髓損傷后少突膠質(zhì)細胞存活中的作用

少突膠質(zhì)細胞(oligodendrocyte,OL)是一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞，主要來源于少突膠質(zhì)細胞前體細胞(oligodendrocyte progenitor cell，OPC)。OPC特異性表達血小板源性生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor α，PDGFRα)及神經(jīng)膠質(zhì)抗原2(neuron-glia antigen 2，NG2)，分化早期逐漸開始表達O4蛋白；隨著分化的進行，逐漸表達O1、GalC及CNPase等蛋白；成熟的OL包裹多個神經(jīng)軸突形成髓鞘，因此髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達預(yù)示著OL的成熟[24]。OL主要功能是為軸突提供支持和絕緣，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘細胞在發(fā)生脫髓鞘損傷時，具有一定的再生能力。

由于這一復(fù)雜的分化程序及其獨特的代謝和生理機制，OL屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最脆弱的細胞之一。OL在脊髓損傷后會發(fā)生凋亡，因此OL的死亡和脫髓鞘作用是繼發(fā)性損傷的主要病理過程[8]。有研究證明脊髓損傷會引起OL自噬改變，但對OL和OPC自噬的產(chǎn)生機制或功能知之甚少。為研究自噬的作用，在OL選擇性敲除Atg5的轉(zhuǎn)基因小鼠建立脊髓挫傷模型中，發(fā)現(xiàn)選擇性Atg5敲除后的OL自噬通量減少，后肢運動功能恢復(fù)顯著降低，因此，自噬是OL中必不可少的細胞保護途徑[25]。有研究表明Atg5的喪失嚴重損害了OPC的存活并抑制其向OL分化，分化成熟的OL可表達高水平的自噬標(biāo)記，且在髓鞘形成過程中發(fā)生自噬，因此自噬誘導(dǎo)和抑制可分別促進和抑制髓鞘形成[26]。以上結(jié)果表明自噬對少突膠質(zhì)細胞分化和存活及正常的髓鞘形成至關(guān)重要。

2.3 自噬在脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞中的作用

小膠質(zhì)細胞是遍布整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)膠質(zhì)細胞，可在數(shù)小時內(nèi)被激活并被招募到脊髓病變部位，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主動免疫防御的主要形式[27]。炎癥主要由活化的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞產(chǎn)生，小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞表型可分為M1表型和M2表型[28]。在脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞主要極化到M1表型，引起神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放，如自由基、炎性細胞因子和趨化因子等，這些炎性介質(zhì)可加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[29]。相反，M2表型能夠通過釋放IL-4和TGF-β抑制過強的免疫反應(yīng)，促進神經(jīng)再生，特別是軸突延伸[30-31]。因此小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞表型及不同表型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中的不同作用有待深入研究。有研究表明調(diào)節(jié)AMPK/mTOR途徑介導(dǎo)的自噬可激活小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞向M2極化并抑制小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞向M1極化，從而保護神經(jīng)元細胞免受凋亡[29]。激活自噬可減少CD68陽性標(biāo)記的活化小膠質(zhì)細胞數(shù)目，促炎因子TNF-α，IL-1β和IL-6減低，抑制炎性因子的分泌來減輕神經(jīng)炎癥[32]。在機制水平上，自噬被認為調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的活性，減少IL-1B釋放的細胞反應(yīng)[33]。自噬也可限制線粒體損傷和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，例如siRNA-Beclin 1或siRNA-ATG5轉(zhuǎn)染抑制自噬導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞活化，線粒體ROS大量產(chǎn)生，線粒體膜電位喪失，促炎細胞因子分泌，包括IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α及促進MAPK、NF-κB表達，而雷帕霉素治療誘導(dǎo)的自噬可以顯著抑制小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)[34]。此外，自噬直接靶向作用RELA/p65蛋白，通過調(diào)節(jié)NF-κB激活所需的p62調(diào)節(jié)炎癥[35-36]。調(diào)節(jié)自噬可以影響小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)，相反，促炎環(huán)境也可能調(diào)節(jié)自噬水平，如脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥模型中，自噬相關(guān)蛋白LC3和p62表達增加[29]。

2.4 自噬在星形膠質(zhì)細胞中的作用

星形膠質(zhì)細胞通常被認為是“管家細胞”，可以促進神經(jīng)元的健康生存,該作用包括通過控制離子成分及攝取神經(jīng)遞質(zhì)等監(jiān)測和維持細胞外區(qū)域的穩(wěn)定，響應(yīng)神經(jīng)元活動，調(diào)節(jié)血流和循環(huán)，維持血腦屏障和維持突觸功能等[37]。脊髓損傷后原始星形膠質(zhì)細胞依次表現(xiàn)出不同的表型，先是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，再是形成疤痕的星形膠質(zhì)細胞。GFAP是僅在星形膠質(zhì)細胞中表達的中間絲，星形膠質(zhì)細胞受刺激后其表達水平會大大增加[38]。關(guān)于星形膠質(zhì)細胞自噬的機制或功能知之甚少。自噬激動劑雷帕霉素可抑制星形膠質(zhì)細胞增殖并減少病變部位表達GFAP的細胞數(shù)量，但自噬抑制劑3-MA降低星形膠質(zhì)細胞數(shù)量[39]。最近的研究表明脊髓繼發(fā)性損傷中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞死亡是通過壞死性病變，而不是通過自噬發(fā)生[40]。但是，有必要做進一步研究來確定自噬如何影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后星形膠質(zhì)細胞的存活和功能，以了解繼發(fā)性脊髓損傷機制并改善功能恢復(fù)。

3 小結(jié)和展望

脊髓損傷是難治性疾病，自噬參與調(diào)節(jié)多種疾病、細胞功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷,可能是未來治療脊髓損傷的突破口。我們需要更深入地了解繼發(fā)性脊髓損傷引起的自噬反應(yīng)，自噬可通過降解受損細胞器和多余蛋白質(zhì)維持細胞穩(wěn)態(tài)，但過度自噬引起過度的自我消化和基本細胞成分降解可導(dǎo)致細胞死亡。自噬增強藥物能顯著影響多種細胞類型，促進神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞存活，促進少突膠質(zhì)細胞分化，減輕神經(jīng)炎癥。然而，關(guān)于脊髓損傷不同階段的自噬作用和具體分子機制還有待進一步研究。