閩楠微扦插繁育體系的建立

肖業(yè)玲， 童再康， 吳建輝

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州311300； 2. 浙江省建德市三都鎮(zhèn)人民政府， 浙江 建德311605）

閩楠Phoebe bournei為樟科Lauraceae 楠屬Phoebe植物， 常綠喬木， 分布于江西、 福建、 浙江南部、廣東、 廣西等地的亞熱帶常綠闊葉林地帶， 為中國特有的國家二級(jí)保護(hù)植物。 閩楠材質(zhì)優(yōu)良、 用途廣泛， 有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值， 是優(yōu)良珍貴用材和園林綠化樹種［1-2］。 然而， 由于長期人為破壞， 閩楠自然繁育率低， 自然資源已接近枯竭［3］。 種子繁殖是楠木常規(guī)的繁殖方式［4］， 但是種苗繁殖效率低， 生長周期長， 具有很高的雜合性， 很難保持其優(yōu)良性狀。 目前， 在扦插繁殖中， 基質(zhì)、 生根促進(jìn)劑質(zhì)量濃度、 季節(jié)等3 種因子都會(huì)影響閩楠嫩枝扦插生根率及幼根生長［5-6］。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)是建立珍貴樹種無性繁殖體系的重要手段， 這一技術(shù)不僅能縮短育種周期， 在短時(shí)間內(nèi)快速繁育良種， 還能為轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的搭建打下基礎(chǔ)。 以閩楠近成熟種子為外植體進(jìn)行組培快繁技術(shù)研究未見報(bào)道。 因此， 本研究以閩楠近成熟胚為外植體建立閩楠微扦插繁殖體系， 探討抗褐化劑和生長素對(duì)近成熟胚萌發(fā)以及微扦插生根的影響，以期獲得閩楠微扦插繁殖的最佳培養(yǎng)條件， 為閩楠良種的快速繁殖、 后續(xù)生理及分子研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

閩楠果實(shí)在未成熟時(shí)為青綠色， 質(zhì)地較硬， 等到發(fā)育至成熟時(shí)果皮變?yōu)樽虾谏?同時(shí)果肉變軟， 擠壓有汁液流出。 由于未成熟的閩楠種子組培萌發(fā)率較低， 而成熟種子外部的果肉易霉?fàn)€， 組培污染率較高， 因此以果皮顏色變?yōu)樽虾谏馕疵黠@變軟的近成熟果作為試驗(yàn)材料。

2017 年11 月19 日于江西婺源上梅洲塘村和馬家村采集閩楠近成熟果實(shí)。 選取長勢(shì)良好、 樹干通直、 結(jié)實(shí)量較多的7 個(gè)株系， 采集光滑飽滿、 無病蟲害的果實(shí)， 沙藏保存， 每隔5 d 噴水1 次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒處理 取閩楠近成熟果實(shí)于組培瓶中， 流水沖洗2 h 后， 用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡30 s， 無菌水沖洗3～4 次后， 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞（HgCl2）溶液消毒8～10 min， 期間搖動(dòng)組培瓶2～3 次， 使消毒液與果實(shí)充分接觸， 隨后用無菌水沖洗4～5 次。 在超凈工作臺(tái)上， 用無菌濾紙吸干表面水分， 用鑷子將果皮撥開， 用解剖刀將種皮劃開。 將去掉種皮的胚快速接種至培養(yǎng)基中， 每瓶接種2～4 個(gè)。 培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃， 光照/黑暗周期為18 h/6 h， 光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx。

1.2.2 胚褐化試驗(yàn) 以1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加0.2 mg·L-1的IBA。 將種子消毒后去掉種皮， 分別切去全部子葉、 切去一半子葉， 與保留全部子葉（ck）作為對(duì)照組， 每組試驗(yàn)至少接種5 瓶， 每瓶4～6 個(gè)胚， 重復(fù)3 次， 統(tǒng)計(jì)褐化率。 褐化率=褐化植株數(shù)量/接種植株數(shù)量×100%。

1.2.3 褐化程度和褐化多酚氧化酶（PPO）活性 以1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加0.2 mg·L-1的IBA， 分別添加1.00、 2.00、 4.00 g·L-1的聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）和0.25、 0.50、 1.00 g·L-1的維生素C（VC）。 取接入培養(yǎng)基0， 3 和10 d 的7 號(hào)株系近成熟胚， 測(cè)定其褐化程度等生理指標(biāo)。 褐化程度： 取0.5 g 胚， 加入預(yù)冷磷酸緩沖液（pH 7.0）3 mL， 快速研磨， 將研磨液倒入離心管中， 用7 mL 緩沖液沖洗研缽， 合并后4 ℃離心（1 200×g）10 min， 取上清液3 mL 于比色皿中， 在475 nm 測(cè)光密度， 重復(fù)3 次。 以光密度代表褐化程度， 光密度D（475）越大代表褐化程度越大［7］。 PPO 活性： 取0.5 g 胚， 加入預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 7.0）3 mL， 研磨， 轉(zhuǎn)移至離心管中， 再用7 mL 緩沖液沖洗研缽， 合并提取液， 4 ℃離心（1 200×g）10 min， 取上清液為粗酶液， 將0.5 mL 鄰苯二酚加入2 mL 磷酸緩沖液（pH 7.0）中， 加入0.5 mL 酶提取液， 立即于波長410 nm 下測(cè)定光密度， 2 min 后再計(jì)光密度， 以不加酶提取液的反應(yīng)液為對(duì)照， 重復(fù)3次， 以2 min 內(nèi)光密度上升1 為1 個(gè)酶活單位［8］。

1.2.4 不同抗褐化劑對(duì)胚萌發(fā)試驗(yàn) 采用的實(shí)驗(yàn)材料為3 號(hào)株系， 以1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加0.2 mg·L-1IBA， 分別添加1.00、 2.00、 4.00 g·L-1PVP 和0.25、 0.50、 1.00 g·L-1VC， 每組培養(yǎng)基均添加30 g·L-1蔗糖， 7 g·L-1瓊脂， pH 調(diào)至6.0， 每個(gè)處理接種15 瓶， 接種2～4 個(gè)胚·瓶-1， 重復(fù)3 次。 培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)情況， 并計(jì)算每個(gè)處理相應(yīng)的萌發(fā)率。 萌發(fā)率=萌發(fā)植株數(shù)量/接種植株數(shù)量×100%。

1.2.5 不同吲哚丁酸（IBA）質(zhì)量濃度對(duì)胚萌發(fā)試驗(yàn) 以1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)， 分別添加0.2、 0.5、 1.0、 1.5 mg·L-14 個(gè)質(zhì)量濃度的IBA， 以不添加植物生長素為對(duì)照（ck）， 附加2 g·L-1PVP，7 g·L-1的瓊脂， 蔗糖30 g·L-1， pH 調(diào)至6.0， 每個(gè)處理接種15 瓶， 重復(fù)3 次。 培養(yǎng)45 d 后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)情況， 并計(jì)算出每個(gè)處理相應(yīng)的萌發(fā)率。

1.2.6 不同抗褐化劑對(duì)微扦插生根試驗(yàn) 采用5 號(hào)株系作為實(shí)驗(yàn)材料， 以1/2 MS+1.5 mg·L-1IBA 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 分別加入0.25、 0.50、 1.00 g·L-1VC 和1.00、 2.00、 4.00 g·L-1PVP， 以不添加任何抗褐化劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照（ck）， 每個(gè)處理接種10 瓶， 接種3～5 個(gè)芽·瓶-1， 重復(fù)3 次。 30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率、 平均生根數(shù)和平均根長。 生根率=生根植株數(shù)量/接種植株數(shù)量×100%； 平均生根數(shù)=所有生根植株總的生根數(shù)量/生根植株數(shù)量； 平均根長=所有生根的長度總和/生根植株數(shù)量。

1.2.7 不同質(zhì)量濃度IBA 對(duì)無菌苗微扦插試驗(yàn) 以1/2MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 采用6 號(hào)株系， 分別添加0.2和1.5 mg·L-12 個(gè)IBA 質(zhì)量濃度， 以不添加IBA 的培養(yǎng)基為對(duì)照（ck）， 附加2 g·L-1PVP， 7 g·L-1的瓊脂， 蔗糖30 g·L-1， pH 調(diào)至6.0， 每個(gè)處理接種15 瓶， 重復(fù)3 次。 培養(yǎng)45 d 后統(tǒng)計(jì)生根情況， 并計(jì)算出每個(gè)處理相應(yīng)的生根率。

1.2.8 繁殖系數(shù) 閩楠近成熟胚接種30 d 后去掉頂芽， 60 d 后側(cè)芽可用于微扦插， 微扦插苗生長60～90 d 后可進(jìn)行移栽， 每年每株無菌苗最多可剪取4 次芽用于微扦插。 去掉頂芽60 d 后統(tǒng)計(jì)長度大于1 cm 芽的數(shù)量， 每個(gè)株系至少統(tǒng)計(jì)5 株。 繁殖系數(shù)=平均新生側(cè)芽數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用Excel 2007 與SPSS 20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 子葉切除處理下的胚褐化

從表1 可見： 雖然不同株系胚褐化率有所差異， 但是整體表現(xiàn)出相似的規(guī)律， 即保留全部子葉時(shí)褐化率最高， 其中1 號(hào)株系褐化率最高， 達(dá)60.81%， 而不留子葉時(shí)褐化率最低， 在6 號(hào)株系中褐化率僅為13.84%。 然而， 對(duì)萌發(fā)后無菌苗后續(xù)生長觀察發(fā)現(xiàn)， 切除全部子葉的無菌苗較細(xì)長， 長勢(shì)較差， 真葉無法正常展開。 因而， 后續(xù)研究中采用保留全部子葉、 通過抗褐化劑控制子葉褐化程度的方法來提高胚的萌發(fā)率并保證無菌苗的生長。

表1 子葉切除對(duì)胚褐化的影響Table 1 Effect of cotyledonectomy on embryo browning

2.2 不同抗褐化劑下子葉褐化和PPO 活性

2.2.1 子葉褐化 如圖1A 所示： 閩楠近成熟胚在1/2 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d 時(shí)開始發(fā)生褐變， 在未加入任何抗褐化劑時(shí)， 種子褐化程度較重， 10 d 時(shí)光密度D（475）達(dá)1.2， 且萌發(fā)較為遲緩。 而添加VC 和PVP 的種子褐化程度降低， 生長狀況漸好。 不同種類和質(zhì)量濃度的抗褐化劑對(duì)抑制褐化的效果不同， 添加了PVP 或VC 時(shí)在第3 天時(shí)都有不同程度褐化， 其中褐化程度為添加1.00 g·L-1PVP＞2.00 g·L-1PVP＞4.00 g·L-1PVP。 VC 褐化值在0～10 d 均低于PVP 和ck， 到第3 天時(shí)， 添加0.50 和1.00 g·L-1VC 的褐化值均下降， 到了第10 天時(shí)， VC 褐化程度均呈上升趨勢(shì)， 當(dāng)VC 的添加量為1.00 g·L-1， 培養(yǎng)10 d 時(shí)，種子褐化率最低， 為25%。

2.2.2 PPO 活性 分析PPO 活力（圖1B）可見： 在添加了PVP 的培養(yǎng)基中， 子葉中PPO 活性在第3 天時(shí)與ck 大致相等， 呈平穩(wěn)狀態(tài)， 到第10 天時(shí)， PVP 組的活性高于ck 組， 其中， PPO 活性為添加4.00 g·L-1PVP＞1.00 g·L-1PVP＞2.00 g·L-1PVP。 VC 組在整個(gè)過程中， 子葉中PPO 活性一直呈下降趨勢(shì)， 第3天時(shí)， PPO 活性為添加1.00 g·L-1VC＞0.25 g·L-1VC＞0.50 g·L-1VC， 到了第10 天， PPO 活性為添加0.25 g·L-1VC＞0.50 g·L-1VC＞1.00 g·L-1VC， 且一直低于PVP 組和ck 組。 因此， 添加的最適抗褐化劑為2.00 g·L-1PVP。

圖1 不同抗褐化劑對(duì)子葉褐化及PPO 活性的影響Figure 1 Influence of different anti-browning agents on browning and PPO activity

2.3 不同抗褐化劑對(duì)胚萌發(fā)的影響

從表2 可見： 以1/2 MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加0.2 mg·L-1IBA， 3 號(hào)株系在添加PVP 誘導(dǎo)近成熟種子胚的萌發(fā)效果較好， 而添加2.00 g·L-1PVP 的效果最好， 萌發(fā)率為83.57%， 添加VC 時(shí)胚萌發(fā)則較差，在添加0.25 g·L-1時(shí)， 胚萌發(fā)率為53.06%。

2.4 不同質(zhì)量濃度IBA 對(duì)胚萌發(fā)的影響

從表3 可以看出： 閩楠近成熟胚萌發(fā)對(duì)IBA 較為敏感， 較低質(zhì)量濃度的IBA 誘導(dǎo)即可萌發(fā)， 且萌發(fā)率較高。 IBA 質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時(shí)效果最好， 萌發(fā)率最高的6 號(hào)株系可達(dá)89.71%。 隨著IBA 質(zhì)量濃度的升高萌發(fā)率下降， IBA 質(zhì)量濃度達(dá)1.0 mg·L-1及以上時(shí)， 萌發(fā)率低于ck。 閩楠近成熟胚萌發(fā)較適IBA 質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1。

表2 不同抗褐化劑下胚萌發(fā)的變化Table 2 Change of different anti-browning agents on cotyledon embryo germination

表3 不同質(zhì)量濃度IBA 下胚萌發(fā)的變化Table 3 Change of different concentrations of IBA on cotyledon embryo germination

2.5 不同抗褐化劑對(duì)無菌苗微扦插生根的影響

從表4 可見： 以添加1.5 mg·L-1IBA 的1/2 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加PVP 誘導(dǎo)閩楠無菌苗微扦插生根效果較好， 頂芽生根率均達(dá)100%。 其中， 添加2.00 g·L-1PVP 在接種15 d 開始生根， 至30 d 時(shí)，頂芽平均生根數(shù)為3.86 條， 平均根長1.56 cm； 側(cè)芽生根率為60.27%， 平均生根數(shù)為1.55 條， 平均根長0.85 cm。 添加VC 時(shí)生根效果較差， 僅在添加0.25 g·L-1時(shí)有66.81%的頂芽生根， 但是生根數(shù)量與平均根長均明顯低于添加PVP 的培養(yǎng)基， 而隨著質(zhì)量濃度的升高， 頂芽微扦插后無法生根。 在添加了VC 的生根培養(yǎng)基中， 側(cè)芽均無法生根。 在不添加任何抗褐化劑（ck）中頂芽生根情況也沒有添加PVP 效果好， 閩楠近成熟種子微扦插生根較適用的抗褐化劑為2.00 g·L-1PVP。

2.6 不同質(zhì)量濃度IBA 對(duì)無菌苗微扦插的影響

如圖2 所示： 閩楠微扦插生根較慢， 平均15 d 左右開始生根。 從表5 可以看出： 在無菌苗繼代生根培養(yǎng)中， 1.5 mg·L-1IBA 效果最好， 生根率最高， 頂芽生根率均達(dá)100%， 15 d 可發(fā)新根， 平均生根數(shù)約2.85 條， 平均根長為1.07 cm， 側(cè)芽生根率為52.24%， 平均生根數(shù)約1.48 條， 平均根長為0.56 cm。閩楠無菌苗微扦插生根較適培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg·L-1IBA+2.00 g·L-1PVP。

表4 不同抗褐化劑下微扦插生根的變化Table 4 Change of different anti-browning agents and concentrations on rootage after microcuttage

表5 不同質(zhì)量濃度IBA 處理下無菌苗微扦插的變化Table 5 Change of different concentrations of IBA on micro-cutting of sterile seedlings

2.7 不同株系的繁殖系數(shù)

從表6 可見： 4 號(hào)、 5 號(hào)、 6 號(hào)株系生根率均為100%。 其中4 號(hào)株系的無菌苗芽小而短， 可用于微扦插的芽較少， 因而繁殖系數(shù)偏低， 而3 號(hào)株系有較多叢生芽現(xiàn)象出現(xiàn)（圖2G～I(xiàn)）， 繁殖系數(shù)高。 綜上，閩楠無菌苗微扦插體系中， 3 號(hào)、 5 號(hào)、 6 號(hào)株系表現(xiàn)較好， 其中3 號(hào)家系繁殖系數(shù)為24.40。

表6 不同株系繁殖系數(shù)的變化Table 6 Change of reproductive coefficient of different families

3 結(jié)論與討論

PPO 是一類廣泛存在于植物中的氧化酶［9］， 在褐化過程中起關(guān)鍵作用［10］。 當(dāng)細(xì)胞中的膜結(jié)構(gòu)遭到破壞后， 原本綁定于膜上的PPO 隨即被激活［11］， 將酚類物質(zhì)氧化生成醌類物質(zhì)， 再經(jīng)非酶促反應(yīng)聚合形成褐色物質(zhì)， 對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［12］。 褐化發(fā)生與外植體體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)［13］。 由于細(xì)胞中含有較多的酚類化合物， 閩楠近成熟胚在組培體系中萌發(fā)時(shí)， 子葉褐化情況較為嚴(yán)重， 對(duì)其萌發(fā)以及后續(xù)的生長均會(huì)產(chǎn)生不利影響。 在切除子葉后發(fā)現(xiàn)， 胚在培養(yǎng)基中的萌發(fā)率明顯提高， 但由于缺乏子葉所提供的營養(yǎng)， 其后續(xù)生長較為緩慢， 葉片無法正常展開。 因此， 本研究保留子葉以保證無菌苗萌發(fā)后的生長， 同時(shí)通過添加抗褐化劑的方法來抑制子葉褐化。 抗褐化劑按作用原理可主要分為2 種： 一種是具有還原能力的抗氧化劑， 另一種是具有多孔洞結(jié)構(gòu)的吸收劑。 還原型抗氧化劑主要有維生素C（VC）、 硫代硫酸鈉（Na2S2O3）和硝酸銀（AgNO3）等， 添加這一類抗褐化劑可以改變外植體周圍的氧化還原電勢(shì)， 從而抑制酚類氧化， 減輕褐變。 而吸收型抗褐化劑主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和活性炭（AC）等， 這類抗褐化劑具有特殊的孔洞結(jié)構(gòu)， 能夠吸收固定酚類物質(zhì)， 阻止其與PPO 的接觸， 從而起到減輕褐化的效果［14］。 本研究發(fā)現(xiàn)： 還原型抗褐化劑VC 能夠抑制PPO 活性， 對(duì)子葉褐化的抑制能力較強(qiáng)， 但是它同時(shí)也影響了其他生理過程， 最終造成胚萌發(fā)受阻。 而吸收型抗褐化劑PVP 不影響PPO 活性， 對(duì)子葉褐化有一定的抑制能力， 能夠顯著提高胚的萌發(fā)率， 同時(shí)對(duì)無菌植株的后續(xù)生長也無明顯抑制。 因此， 本研究中閩楠胚萌發(fā)培養(yǎng)基中添加2.00 g·L-1PVP 顯著抵制PPO 活性， 這與陳夢(mèng)倩等［15］研究的抗褐化劑對(duì)香港四照花Dendrobenthamia hongkongensis褐化的影響試驗(yàn)結(jié)果一致。

適宜質(zhì)量濃度的抗褐化劑不僅能夠緩解子葉的褐化和促進(jìn)胚的萌發(fā)， 同時(shí)在微扦插生根時(shí)也能起到積極作用。 本研究中， 添加2.00 g·L-1PVP 時(shí)頂芽和側(cè)芽的生根情況最好， 與不添加任何抗褐化劑的對(duì)照組（ck）相比， 所生出的根較為粗壯， 顏色也較淺。 而VC 作為一種還原劑， 雖然能強(qiáng)烈抑制褐化， 但同時(shí)也抑制了植物組織其他正常的生理活動(dòng)， 導(dǎo)致微扦插生根率降低。

添加適量的IBA 能夠顯著提高生根率和不定根以及試管苗的生長速度。 本研究表明： 添加0.2 mg·L-1IBA 能夠促進(jìn)閩楠近成熟胚萌發(fā)。 隨著IBA 質(zhì)量濃度的升高， 萌發(fā)率下降。 IBA 質(zhì)量濃度達(dá)1.0 mg·L-1及以上時(shí)， 根粗短、 植株小、 長勢(shì)慢， 不利于后期生長， 這與二花蝴蝶草Torenia biniflora的組織培養(yǎng)及植株再生現(xiàn)象相似［16］。 添加高質(zhì)量濃度的1.5 mg·L-1IBA 能夠促進(jìn)閩楠無菌苗生根， 頂芽生根率為100%， 平均生根數(shù)為3.86 條， 平均根長為1.56 cm； 側(cè)芽生根率為60.27%， 平均生根數(shù)為1.55 條， 平均根長為0.85 cm， 比添加低濃度IBA 效果顯著。

圖2 閩楠近成熟胚微扦插繁育情況Figure 2 Micro-cutting and breeding of near mature embryos of P. bournei