4種噬菌體對(duì)寄主青枯菌的敏感性及作用受體分析

余成鵬，胡蓉花，林培炯，李杏蔚，鐘 敏，劉瓊光,3

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642； 2 吉安市煙草公司，江西 吉安 343000；3 廣東省微生物信號(hào)與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642)

茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum，俗稱青枯菌，引起的煙葉青枯病是煙草生產(chǎn)中的重要細(xì)菌病害，該病在我國大多數(shù)煙葉種植區(qū)普遍發(fā)生且為害嚴(yán)重，已造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前煙草青枯病的防治主要以輪作和化學(xué)防治為主，但效果不理想。噬菌體是侵染細(xì)菌的病毒，具有高度的特異性及快速裂解宿主(寄主)的能力，可用于動(dòng)物和人體細(xì)菌疾病的治療[1-4]。由于細(xì)菌對(duì)抗生素的抗性日趨增強(qiáng)，“超級(jí)細(xì)菌”對(duì)細(xì)菌病害防治具有嚴(yán)重的潛在威脅，利用噬菌體來防治植物細(xì)菌病害受到廣泛關(guān)注，已有較多的相關(guān)研究[5-13]。例如，利用噬菌體防治番茄和辣椒細(xì)菌性瘡痂病Xanthomonas campestrispv.vesicatoria[6]、天竺葵細(xì)菌性枯萎病Xanthomonas campestrispv.pelargonii[7]、柑橘潰瘍病Xanthomonas citripv.citri[8]、梨火疫病Erwinia amylovora[9]和大白菜軟腐病Pectobacterium carotovorasubsp.carotovora[10]等植物細(xì)菌病害，已取得了一定的成效。在作物青枯病防治方面，Addy等[11]發(fā)現(xiàn)感染噬菌體φRSM1和φRSM3后，青枯菌毒性明顯減弱，絲狀噬菌體φRSM3的施用可明顯減輕番茄青枯病的發(fā)病率；施用裂解性噬菌體可以有效防治作物青枯病[13]。

對(duì)于寄主范圍廣、遺傳多樣性豐富的青枯菌來說，噬菌體具有高度的特異性，因此利用噬菌體來防治青枯病受到寄主范圍的限制。這也是噬菌體未能廣泛地實(shí)際應(yīng)用的原因。此外，有關(guān)青枯菌噬菌體的抗性機(jī)制及作用受體尚不完全清楚，本文探究噬菌體與青枯菌的互作，分析青枯菌對(duì)噬菌體的敏感性與抗性，研究噬菌體的作用受體，以期為利用噬菌體防治作物青枯病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與噬菌體

供試的4種青枯菌噬菌體P1556-1、P1556-2、P7-1和P1521分離自江西省吉安市煙葉種植區(qū)土壤，以煙草青枯菌Tb1556作為噬菌體寄主，所有噬菌體和青枯菌均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院細(xì)菌研究室保存和提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB 液體培養(yǎng)基：酵母提取物 5 g，氯化鈉 10 g，胰蛋白胨 10 g，蒸餾水 1 000 mL，LB 固體培養(yǎng)基加 15 g 瓊脂。

普通細(xì)菌固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，酵母膏 3 g，蛋白胨 3 g，硫酸鎂 0.25 g，磷酸氫二鉀 2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，蔗糖 15 g，瓊脂 18 g，蒸餾水 1 000 mL。

普通細(xì)菌半固體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨 3 g，硫酸鎂 0.25 g，磷酸氫二鉀 2 g，磷酸二氫鉀 0.5 g，蔗糖 15 g，瓊脂 8 g，蒸餾水 1 000 mL。

TTC 培養(yǎng)基：水解干酪素 1 g，蛋白胨 10 g，甘油 5 mL，瓊脂 32 g，蒸餾水 1 000 mL，使用前加入10 g/L 三苯基四氮唑 (TTC)10 mL。

8.5 g/L的氯化鈉溶液。

1.3 青枯菌及噬菌體的培養(yǎng)

青枯菌Tb1556在TTC平板上劃線，培養(yǎng)24～48 h后，挑取典型單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 條件下，200 r/min 培養(yǎng) 24 h，獲得青枯菌懸液。?80 ℃活化噬菌體并制成含單個(gè)噬菌斑的雙層平板。取單個(gè)噬菌斑與100 μL青枯菌懸液接種到10 mL LB 培養(yǎng)基中，30 ℃ 條件下培養(yǎng) 24 h，得到純化的單一噬菌體。

1.4 噬菌體雙層平板制備及效價(jià)測(cè)定

將噬菌體與青枯菌共培養(yǎng) 24 h 后，10 000 r/min 10 min，取上清進(jìn)行 10 倍梯度稀釋。取 100 μL噬菌體稀釋液、100 μL青枯菌懸液和15 mL普通細(xì)菌半固體培養(yǎng)基充分混合，隨即倒入預(yù)先制備好的普通細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，根據(jù)平板上的噬菌斑個(gè)數(shù)，計(jì)算噬菌體效價(jià)。

1.5 噬菌體混合對(duì)青枯菌裂解能力的影響

取D600nm=0.6 的青枯菌液 100 μL 與普通細(xì)菌半固體培養(yǎng)基混合，倒入空白培養(yǎng)皿中，吹干備用。分別將過濾后效價(jià)為1.0×1010PFU/mL的噬菌體(單一噬菌體及1∶1兩兩混合)各3 μL，點(diǎn)接至含青枯菌的普通細(xì)菌半固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，測(cè)量噬菌斑直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 抗噬菌體菌株分析

取D600nm=0.6 的青枯菌液 100 μL 分別與 4 個(gè)噬菌體 (效價(jià)為 1.0×1010PFU/mL)及以體積比 1∶1混合的噬菌體各 100 μL 接種于 10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 條件下，200 r/min 振蕩培養(yǎng)，并于24、48 和 72 h 測(cè)定青枯菌的D600nm，若青枯菌的D600nm越大，說明青枯菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的菌株數(shù)量越多，以不加噬菌體的青枯菌培養(yǎng)為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.7 噬菌體受體分析

1.7.1 青枯菌脂多糖提取 采用熱酚法提取青枯菌脂多糖，參考康潔[14]的方法進(jìn)行。將培養(yǎng)至D600nm=0.6 的青枯菌懸液，5 000 r/min 10 min，棄上清，菌體用 8.5 g/L NaCl溶液 20 mL 洗滌 2 次，離心，沉淀懸浮于 20 mL 8.5 g/L 的 NaCl溶液中。66 ℃水浴，并加入等量的預(yù)熱的φ為90%的苯酚溶液，攪拌 25 min，4 ℃ 靜置過夜，2 000 r/min 15 min，取上層水相，按此方法重復(fù)1次。取2次水相混合、透析，直至氯化鐵檢測(cè)不到酚為止，即得到粗制脂多糖。

1.7.2 噬菌體作用于青枯菌的受體 為明確噬菌體的作用受體，選擇青枯菌的脂多糖和菌體表面膜蛋白進(jìn)行分析。將青枯菌Tb1556加入蛋白酶K至終濃度為 100 mg/mL，37 ℃ 條件下處理 30 min，以消化青枯菌細(xì)胞表面蛋白。

將 100 μL 噬菌體分別與 900 μL 無菌水、青枯菌、蛋白酶K處理后的青枯菌及脂多糖提取液混合，30 ℃ 條件下靜置 30 min 后，10 000 r/min 10 min，取上清，按1.4的方法，測(cè)定噬菌體效價(jià)，每個(gè)處理重復(fù)3次，并計(jì)算噬菌體吸附率。

1.8 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定噬菌體雙層平板各處理組的噬菌體效價(jià)(PFU/mL)，分別計(jì)算脂多糖吸附率及表面蛋白吸附率，公式如下：

噬菌體效價(jià)=平板噬菌斑個(gè)數(shù)×10×稀釋倍數(shù)，

脂多糖吸附量=空白組效價(jià)?脂多糖處理組效價(jià)，

表面蛋白吸附量=青枯菌處理組效價(jià)?蛋白酶K處理組效價(jià)，

青枯菌吸附量=空白組效價(jià)?青枯菌處理組效價(jià)，

脂多糖(蛋白)吸附率=脂多糖(蛋白)吸附量/青枯菌吸附量×100%。

研究數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體混合對(duì)青枯菌裂解能力的影響

圖1為4種不同噬菌體及其兩兩混合后對(duì)青枯菌Tb1556平板產(chǎn)生噬菌斑的示意圖。單一噬菌體及噬菌體兩兩混合后在平板上產(chǎn)生噬菌斑的直徑見圖2，由圖2可知，單一噬菌體形成噬菌斑的直徑由大到小分別為 P1556-1＞P7-1＞P1556-2＞P1521，且在統(tǒng)計(jì)上具有顯著差異(P＜0.05)；除P1556-2與P1521混合后產(chǎn)生的噬菌斑略大于各自形成的噬菌斑外，其他噬菌體混合后并不能形成更大的噬菌斑，結(jié)果表明，噬菌體的混合并不能顯著提高其對(duì)青枯菌的裂解能力。

圖1 4種不同噬菌體及兩兩混合對(duì)青枯菌Tb1556平板產(chǎn)生的噬菌斑Fig. 1 The plaques of four types of phages and their mixtures in pairs on Ralstonia solanacearum Tb1556 plates

圖2 4種不同噬菌體及其兩兩混合對(duì)青枯菌Tb1556生長(zhǎng)的影響Fig. 2 Effects of four types of phages and their mixtures in pairs on Ralstonia solanacearum Tb1556 growth

2.2 青枯菌對(duì)噬菌體的抗性

在與噬菌體斗爭(zhēng)的過程中，青枯菌進(jìn)化出多種抵抗噬菌體的機(jī)制，從而避免被噬菌體消滅殆盡。本試驗(yàn)通過單一噬菌體及噬菌體兩兩混合后與青枯菌共培養(yǎng)，在不同時(shí)間段測(cè)定青枯菌的D600nm，來探究青枯菌對(duì)不同噬菌體產(chǎn)生抗性的時(shí)間和概率。

在培養(yǎng)24 h后，含有噬菌體的處理組D600nm均接近0，表明在該時(shí)間范圍內(nèi)，各噬菌體處理組均沒有產(chǎn)生抗性青枯菌，或產(chǎn)生量極其少而未能檢測(cè)出。當(dāng)噬菌體與青枯菌共培養(yǎng)48 和72 h后，均發(fā)現(xiàn)有抗噬菌體的青枯菌產(chǎn)生。其中P1556-1在共培養(yǎng) 48 h 后，D600nm達(dá)到 0.210，72 h 達(dá)到 0.641，表明青枯菌對(duì)P1556-1的抗性增長(zhǎng)最快；其次為P1556-2 和 P1521，在培養(yǎng) 48 h 后，D600nm分別為 0.104和 0.106，培養(yǎng) 72 h 后，D600nm分別為 0.396 和0.492；培養(yǎng) 48 h 內(nèi)，青枯菌抗 P1556-1、P1556-2 與P1521菌株便開始產(chǎn)生，而P7-1在72 h后才開始大量產(chǎn)生抗性菌株，其D600nm在 48 h 為 0.023，72 h為 0.355(圖3)。

圖3 噬菌體與青枯菌Tb1556共培養(yǎng)下的青枯菌D600 nmFig. 3 D600 nm of Ralstonia solanacearum Tb1556 after co-culturing with phages

噬菌體混合測(cè)定結(jié)果(圖3)表明，含有噬菌體P7-1能有效降低抗性菌的產(chǎn)生速度，且比單一噬菌體效果更明顯；與單一噬菌體處理組相比，含有噬菌體P1556-2和P1521的處理組在共培養(yǎng)48 h時(shí)，產(chǎn)生抗性菌株的差異不明顯，但在共培養(yǎng)72 h后，卻能減緩抗性菌的產(chǎn)生速度。

2.3 噬菌體作用受體分析

噬菌體吸附試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體P1556-2能夠被寄主菌的脂多糖吸附，而且吸附率高達(dá)99.80%，但不吸附表面蛋白，表明脂多糖是該噬菌體的作用受體；P1521既可以吸附脂多糖，也能吸附表面蛋白，或細(xì)菌鞭毛等其他受體，說明該噬菌體可能具有多種作用受體，侵染機(jī)制更為復(fù)雜；噬菌體P1556-1和P7-1對(duì)脂多糖和膜蛋白的吸附率較低，屬于其他種類受體(圖4)。

圖4 噬菌體對(duì)脂多糖和膜蛋白的吸附率Fig. 4 Adsorption rates of lipopolysaccharide and membrane protein by phages

3 討論與結(jié)論

隨著噬菌體成功應(yīng)用于治療人類疾病，利用噬菌體防治植物細(xì)菌病害已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。噬菌體的寄主范圍以及抗噬菌體菌株的產(chǎn)生，在一定程度上影響噬菌體防治植物細(xì)菌病害的效果。篩選寄主范圍廣泛、裂解能力強(qiáng)、且不易使寄主產(chǎn)生抗性的噬菌體，對(duì)于應(yīng)用噬菌體防治植物病害具有重要意義。

本研究選擇的P1556-1、P1521、P7-1和P1556-2噬菌體寄主范圍較廣，前期研究表明，對(duì)來自不同地區(qū)的75個(gè)青枯菌菌株，P1556-1、P1521、P7-1和P1556-2分別能侵染其中86.7%、84.0%、81.3%和77.3%的菌株[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寄主范圍最為廣泛的噬菌體P1556-1在平板上產(chǎn)生的噬菌斑最大，說明它裂解青枯菌的能力強(qiáng)，表明噬菌體的裂解能力可能與寄主范圍存在一定關(guān)系。

用噬菌體治療疾病或防治植物細(xì)菌病害，可通過噬菌體間的混合及噬菌體與其他化學(xué)物質(zhì)或生物的混配來實(shí)現(xiàn)，以達(dá)到更好的防治效果。噬菌體混合已被證明具有較好的預(yù)防青枯病的效果[16]，將噬菌體與表面活性劑混合后能夠?qū)⑹删w有效地吸附在番茄根部，從而加強(qiáng)噬菌體的預(yù)防作用[17]。然而，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除P1521外，噬菌體兩兩混合后形成的噬菌斑大小與其單一噬菌體所能形成最大噬菌斑的噬菌體有關(guān)，盡管P1556-2與P1521混合后略高于P1556-2單獨(dú)形成的噬菌斑，但效果不明顯。因此，噬菌體的混合并不能明顯提高其對(duì)青枯菌的裂解能力，但是否能夠提高作物青枯病的防治效果，需要進(jìn)一步的田間防治試驗(yàn)驗(yàn)證。

在噬菌體與青枯菌相互作用的過程中，往往會(huì)出現(xiàn)抗噬菌體菌株，這將極大影響噬菌體的防治效果。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噬菌體與青枯菌共培養(yǎng)48 和72 h后，均發(fā)現(xiàn)抗噬菌體的青枯菌產(chǎn)生。其中青枯菌對(duì)P1556-1的抗性產(chǎn)生最快，其次是P1556-2和P1521，而P7-1最慢。當(dāng)噬菌體兩兩混合后發(fā)現(xiàn)，含有P7-1能有效降低抗性菌株的產(chǎn)生，P1556-2和P1521混合72 h也能減少抗性菌株產(chǎn)生的數(shù)量。噬菌體與寄主受體結(jié)合后，寄主能夠通過注入阻滯、CRISPR-Cas系統(tǒng)、限制修飾系統(tǒng)(Restrictionmodification system, R-M system)、流產(chǎn)感染系統(tǒng)(Abortive infection system，Abi system)等抵抗噬菌體復(fù)制及繁殖。CRISPR序列是一段高度保守的序列[18]，與Cas蛋白構(gòu)成CRISPR-Cas系統(tǒng)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)外源核酸時(shí)，通過編輯將外源基因整合至CRISPR前端[19]，產(chǎn)生crRNA誘導(dǎo)細(xì)菌裂解外源核酸實(shí)現(xiàn)免疫[20-21]?？漳c彎曲桿菌Campylobacter jejuni11168R菌株的cj1521基因從9個(gè)G突變?yōu)?0個(gè)G后，對(duì)噬菌體F336表現(xiàn)出抗性[22]；流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae能夠改變lic2A基因的重復(fù)序列從而改變受體組成，對(duì)噬菌體HP1c1表現(xiàn)出抗性[23]；大腸埃希菌Escherichia coli的btuB基因在插入IS2序列后，噬菌體SPC35無法與之結(jié)合[24]。本研究結(jié)果表明，將不同噬菌體兩兩混合，可以延緩抗性青枯菌的產(chǎn)生，這在實(shí)際應(yīng)用中具有參考價(jià)值，但其抗性機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

噬菌體受體識(shí)別是噬菌體侵染細(xì)菌的第一步。噬菌體能夠特異性識(shí)別寄主受體并與之結(jié)合，然后將自身遺傳物質(zhì)注入寄主體內(nèi)進(jìn)行侵染。細(xì)菌在與噬菌體長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的進(jìn)化過程中，會(huì)通過改變受體來應(yīng)對(duì)噬菌體的侵染。革蘭陰性菌的噬菌體受體包括脂多糖、膜蛋白、菌毛、鞭毛、莢膜等，其中以脂多糖和膜蛋白為主[25]，銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[26]和青枯菌[27]噬菌體能夠與細(xì)菌的鞭毛結(jié)合。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體P1556-2的作用受體為青枯菌的脂多糖，噬菌體P1521能被脂多糖吸附，也能被膜蛋白吸附，表明它能與多種受體結(jié)合，侵染機(jī)制更為復(fù)雜，而噬菌體P1556-1和P7-1則不被脂多糖和膜蛋白吸附，其作用受體有待進(jìn)一步研究。

本文關(guān)于4種青枯菌噬菌體及其兩兩混合后的裂解能力、抗噬菌體青枯菌菌株的產(chǎn)生，以及噬菌體的作用受體等研究結(jié)果，將為利用噬菌體防治作物青枯病的實(shí)際應(yīng)用提供參考。