耐多藥肺結(jié)核患者外周血CTL細(xì)胞抗結(jié)核活性的實(shí)驗(yàn)研究

劉婷 賴惠婷 郭夏娜

1深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)）/廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東深圳518133）；2深圳市寶安區(qū)慢性病防治院檢驗(yàn)科（廣東深圳518100）

2018年，全球確診為結(jié)核病患者中對(duì)利福平耐藥的患者從2017年的41%上升到51%[1]。由于多藥耐藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的與日劇增，對(duì)結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）耐藥檢測(cè)手段的局限和治療上困難，使病程向慢性化發(fā)展。有證據(jù)表明結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）能在肺空洞中躲避免疫因子的作用并只對(duì)抗菌藥物有較低的可接觸性，從而為耐藥性的發(fā)展提供了完美的條件[2]?？梢?jiàn)MTB感染人體的轉(zhuǎn)歸在很大程度上取決于人體免疫狀態(tài)[3]。免疫功能低下可能是是導(dǎo)致結(jié)核病感染慢性化且出現(xiàn)耐藥的原因之一，因此，本研究選擇研究MTB耐藥的免疫學(xué)機(jī)制，試圖從CD8+T淋巴細(xì)胞（CD8+T lymphocytes，CTL）為切入點(diǎn)初步探索它們?cè)贛TB耐藥免疫學(xué)機(jī)制中的作用，以期為耐藥結(jié)核病的臨床免疫診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2016年2月至2017年9月就診于深圳市寶安區(qū)慢性病防治院，經(jīng)Ⅹ光檢查，痰涂片抗酸桿菌檢查，痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)結(jié)合臨床癥狀確診為初治肺結(jié)核患者56例，根據(jù)痰標(biāo)本的XpertgeneMTB/RIF檢測(cè)結(jié)果初步分為原發(fā)性耐藥組和非耐藥組。耐藥組（異煙肼和利福平雙重耐藥）26例，其中男16例，女9例，平均年齡（34.92±11.14）歲；非耐藥組（無(wú)耐藥現(xiàn)象）30例，其中男18例，女12例，平均年齡（33.62±9.93）歲。健康對(duì)照組為寶安區(qū)健康體檢中心的健康體檢者30例，其中男18例，女12例，平均（35.38±7.94）歲。對(duì)各組性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，分別有以下研究對(duì)象：經(jīng)自身MTB刺激的耐藥組巨噬細(xì)胞（RMTBRMAC）、經(jīng)自身MTB刺激的非耐藥組巨噬細(xì)胞（SMTBSMAC）、未經(jīng)MTB刺激的健康對(duì)照組巨噬細(xì)胞（NMac）、耐藥組CTL（RCTL）、非耐藥組CTL（SCTL）以及健康對(duì)照組CTL（NCTL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑淋巴細(xì)胞分離液為天津?yàn)笊锕井a(chǎn)品，完全RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，臺(tái)盼藍(lán)染液為北京Solarbio公司產(chǎn)品，穿孔素（perfoin）、顆粒酶B（GranB）、顆粒溶素（Granu）及TLR2的ELISA檢測(cè)試劑盒為武漢伊萊瑞特生物公司產(chǎn)品，Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物公司產(chǎn)品，MB-580型酶標(biāo)儀和PW-960G型洗板機(jī)為深圳匯松公司產(chǎn)品[4]。

1.3 研究方法

1.3.1 MTB分離與培養(yǎng)于藥物干預(yù)前根據(jù)XpertgeneMTB/RIF檢測(cè)結(jié)果收集耐藥組和非耐藥組MTB，于羅氏培養(yǎng)基37℃，5%CO2至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌株，貯存于-70℃。待痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)和比例法藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果出來(lái)后，根據(jù)比例法和Xpert gene結(jié)果進(jìn)一步細(xì)化實(shí)驗(yàn)分組：兩者結(jié)果均耐藥者納入耐藥組（結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)至少對(duì)利福平、異煙肼耐藥）；兩者結(jié)果均敏感者納入非耐藥組；兩者結(jié)果不一致者不納入實(shí)驗(yàn)研究范圍。每組選取10例臨床結(jié)核桿菌分離株（如分組時(shí)各組大于10例，采取隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)抽樣方法選出10菌株）。

1.3.2 各免疫細(xì)胞的分離于藥物干預(yù)前抽取各組患者EDTA抗凝血6 mL，分離出PBMC，后者進(jìn)一步分離出巨噬細(xì)胞（Mac）和CD8+T淋巴細(xì)胞（經(jīng)抗原刺激活化后即為CTL[5]），體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，凍存于-196℃液氮罐中，待MTB培養(yǎng)出后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)選擇生長(zhǎng)良好的10株細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)（如大于10株，隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)抽樣10株細(xì)胞）。

1.3.3 MTB抗原制備收集耐藥組和非耐藥組MTB菌株，于羅氏培養(yǎng)基37℃，5%CO2至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌株，用無(wú)菌PBS洗滌3次后，重懸于PBS。于80℃加熱1 h滅菌，用無(wú)菌PBS調(diào)整細(xì)菌濃度至1×106/mL），貯存于-20℃，備用。此菌懸液包含有MTB的可溶性和顆粒性抗原。

1.3.4 檢測(cè)不同CTL經(jīng)各組MTB-Ag刺激后分泌各種細(xì)胞毒分子的能力于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入各組Mac（2×105個(gè)/mL）及相應(yīng)組MTB-Ag 1 mL[即耐藥組MTB+耐藥組Mac（RMTB-RMac）、非耐藥組MTB+非耐藥組Mac（SMTB-SMac），同時(shí)設(shè)立未加菌株的健康對(duì)照組Mac空白對(duì)照（NMac）]培養(yǎng)18 h后，在培養(yǎng)板中每孔加入各組CTL（2×106cells/mL）1 mL，具體實(shí)驗(yàn)分組情況如下：SCTL+SMTB-SMac、SCTL+RMTB-RMac、SCTL+NMac、RCTL+SMTB-SMac、RCTL+RMTB-RMac、RCTL+NMac、NCTL+SMTB-SMac、NCTL+RMTB-RMac、NCTL+NMac。上述各組再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，收集各孔細(xì)胞上清液，用ELISA分別檢測(cè)各上清液中穿孔素、顆粒酶B、顆粒溶素水平。每份標(biāo)本同時(shí)平行檢測(cè)3次。

1.3.5 檢測(cè)不同CTL對(duì)各組Mac凋亡的影響12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入各組Mac（2×105cells/mL），待其貼壁后加入相應(yīng)組MTB-Ag 1 mL[即耐藥組MTB+耐藥組Mac（RMTB-RMac）、非耐藥組MTB+非耐藥組Mac（SMTB-SMac）]，培養(yǎng)18 h后，在培養(yǎng)板中每孔加入各組CTL 1 mL（2×106個(gè)/mL），具體實(shí)驗(yàn)分組情況如下：SCTL+SMTB-SMac、RCTL+SMTB-SMac、SCTL+RMTB-RMac、RCTL+RMTB-RMac、SMTB-SMac對(duì)照、RMTB-RMac對(duì)照。上述各組再繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去除CTL細(xì)胞，清洗Mac兩次后，加入完全RPMI-1640繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞上清及Mac細(xì)胞。消化收集各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)貼壁的Mac，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，按照南京凱基公司的化學(xué)發(fā)光法Caspase-3檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)各組Mac中Caspase-3水平；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TLR2濃度水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0及GraphPad Prism7.6軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料組間差異采用兩因素方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型構(gòu)建體外模擬耐藥組及非耐藥組MTB患者體內(nèi)環(huán)境，成功構(gòu)建MTB-Ag+Mac+CTL的細(xì)胞模型后，檢測(cè)了經(jīng)耐藥組及非耐藥組MTB-Ag刺激后各組CTL細(xì)胞培養(yǎng)上清中穿孔素，顆粒酶B和細(xì)胞溶素的水平及兩組MTB-Ag刺激后Mac上凋亡指標(biāo)TLR2與Caspase-3的水平。見(jiàn)圖1、2。

圖1 不同MTB-Ag刺激后各組細(xì)胞毒分子水平Fig.1 RCTL express lower levels of different groups after adifferent MTB-Ag stimulated

2.2 不同MTB-Ag刺激后各種CD8+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒分子水平

2.2.1 耐藥患者CTL經(jīng)自身MTB-Ag刺激后分泌細(xì)胞毒分子的能力低于非耐藥患者CTLRCTL+RMTB-RMac組上清液中三種細(xì)胞毒分子水平小于SCTL+SMTB-SMac（穿孔素t=16.960，P＜0.001；顆粒酶Bt=10.953，P＜0.001；顆粒溶素t=24.611，P＜0.001）。除顆粒酶B（t=1.704，P=0.106）外，RCTL+RMTB-RMac組穿孔素（t=3.529，P=0.004）、顆粒溶素水平小于 NCTL+NMac組（t=12.898，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

2.2.2 耐藥組CTL經(jīng)不同MTB-Ag刺激后分泌細(xì)胞毒分子的水平RCTL+SMTB-SMac、RCTL+RMTB-RMac和RCTL+NMac組的培養(yǎng)上清液中各細(xì)胞毒分子水平除去顆粒酶B（F=6.119，P=0.006）以外，穿孔素（F=0.497，P=0.614）、顆粒溶素水平?jīng)]有差異（F=1.779，P=0.188）。見(jiàn)圖1。

2.2.3 三種細(xì)胞毒分子的分泌水平非耐藥組CTL經(jīng)耐藥MTB-Ag刺激后，分泌三種細(xì)胞毒分子的能力顯著高于耐藥組CTL。雖然SMTB-SMAC及RMTBRMAC均能刺激SCTL上穿孔素，顆粒酶B和顆粒溶素高水平表達(dá)，SCTL+RMTB-RMAC組中細(xì)胞培養(yǎng)上清液中這些細(xì)胞毒分子水平卻明顯低于SCTL+SMTB-SMAC（穿孔素t=6.513，P＜0.001；顆粒酶 Bt=2.558，P=0.02；顆粒溶素t=3.822，P=0.001），可同時(shí)又顯著高于RCTL+RMTB-RMAC（穿孔素t=14.722，P＜0.001；顆粒酶Bt=5.397，P＜0.001；顆粒溶素t=20.293，P＜0.001）。SCTL與SMTB-SMac，RMTB-RMac，NMac共培養(yǎng)后穿孔素、顆粒酶B和顆粒溶素高水平表達(dá)，顯著高于RCTL及NCTL組（均P＜0.0001）。見(jiàn)圖1。

2.3 不同MTB-Ag及CTL對(duì)各組巨噬細(xì)胞上凋亡指標(biāo)TLR2與Caspase-3的影響

2.3.1 經(jīng)不同MTB-Ag刺激后不同組巨噬細(xì)胞的TLR2與Caspase-3水平不同組Mac經(jīng)相應(yīng)的MTB-Ag刺激后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐藥組Mac（RMTB-RMac）的 TLR2（t=4.538，P＜0.001），Caspase-3（t=18.136，P＜0.001）水平均小于非耐藥組（SMTBSMac）。非耐藥組CTL對(duì)相應(yīng)組SMTB-SMac的TLR2，Caspase-3刺激作用高于耐藥組CTL。SCTL+SMTBSMac與 RCTL+RMTB-RMac相比，TLR2（t=10.030，P＜0.001）、Caspase-3有差異（t=18.136，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同MTB-Ag及CTL對(duì)各組Mac上凋亡指標(biāo)TLR2與Caspase-3的影響Fig.2 The effect of different MTB-Ag and CTL on the level of TLR2 and Caspase-3 on macrophage

2.3.2 非耐藥病人體外模型與耐藥病人模型結(jié)果比較非耐藥組CTL對(duì)相應(yīng)組SMTB-SMac的TLR2，Caspase-3刺激作用高于耐藥組CTL。SCTL+SMTB-SMac與 RCTL+RMTB-RMac相比，TLR2（t=10.030，P＜0.001）、Caspase-3差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.136，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

2.3.3 非耐藥組CTL能提高耐藥組RMTB-RMac的TLR2與Caspase-3表達(dá)水平SCTL+RMTB-RMac的TLR2（t=6.484，P＜0.001），Caspase-3（t=7.657，P＜0.001）顯著高于RMTB-RMac，也顯著高于RCTL+RMTB-RMac[TLR2（t=6.874，P＜0.001），Caspase-3（t=9.206，P＜0.001）]。見(jiàn)圖2。

3 討論

目前，對(duì)結(jié)核病的免疫學(xué)研究多以CD4+T淋巴細(xì)胞為主[5]，對(duì)CTL在抗結(jié)核中的作用關(guān)注甚少。越來(lái)越多的證據(jù)表明CTL在對(duì)抗MTB免疫中亦發(fā)揮了非常重要的作用[6]。在人MTB感染中，MTB特異性CTL活化在MTB感染4周內(nèi)就已產(chǎn)生并且能持續(xù)至少9個(gè)月。

在特異性免疫應(yīng)答中，巨噬細(xì)胞將MTB抗原通過(guò)MHC-I類分子提呈給CTL，后者釋放溶細(xì)胞分子如穿孔素，顆粒酶及顆粒溶素，穿孔素先在細(xì)胞膜上打孔以便顆粒酶或顆粒溶素進(jìn)入細(xì)胞成分[6]，一旦進(jìn)入靶細(xì)胞，顆粒酶A和B及顆粒溶素，通過(guò)Caspase途徑觸發(fā)受感巨噬細(xì)胞的凋亡并直接攻擊感染細(xì)胞中內(nèi)體/溶酶體中的MTB來(lái)減少其生長(zhǎng)。

已發(fā)現(xiàn)慢性肺結(jié)核的發(fā)展與感染部分CTL穿孔素和顆粒溶素的減少有關(guān)，后者的減少又與CTL成熟障礙相符合[7]，說(shuō)明這些溶細(xì)胞分子的增加與MTB生長(zhǎng)控制是有關(guān)的。而且研究發(fā)現(xiàn)缺少了穿孔素的CTL細(xì)胞毒功能減弱。這些已有研究證明在宿主CTL對(duì)MTB的免疫過(guò)程中，穿孔素，顆粒酶等溶細(xì)胞分子誘導(dǎo)受感巨噬細(xì)胞凋亡起到了關(guān)鍵作用。

本研究觀察到耐藥MTB刺激其耐藥組Mac后再與耐藥組CTL（RCTL+RMTB-RMac）共培養(yǎng)后，其分泌三種細(xì)胞毒分子水平均顯著低于非耐藥組（SCTL+SMTB-SMac）。說(shuō)明耐藥結(jié)核患者體內(nèi)分離出的CTL細(xì)胞分泌細(xì)胞毒分子的功能確實(shí)較非耐藥組弱。并且即使是在體外培養(yǎng)，耐藥MTB也對(duì)CTL的分泌能力起到抑制作用。GEFFNER等[8]研究發(fā)現(xiàn)MTB耐藥菌株M在體外只能激活極低的CTL活性，且脫顆粒信號(hào)CD107減少，其后續(xù)報(bào)道[9]指出經(jīng)菌株M刺激的健康自愿者CTL僅表現(xiàn)出少量的溶細(xì)胞分子和CCL5表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組CTL與其相應(yīng)巨噬細(xì)胞（NCTL+NMac）培養(yǎng)后其上清液中也可檢測(cè)出少量的溶細(xì)胞分子水平，推測(cè)是由于自身抗原（如體內(nèi)衰老死亡的紅細(xì)胞等）被Mac吞噬后引起的一種微弱的免疫反應(yīng)，但不足以引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。然而RCTL+RMTB-RMac組各溶細(xì)胞分子的水平與正常對(duì)照組無(wú)差別，甚至小于正常對(duì)照組，說(shuō)明耐藥結(jié)核患者機(jī)體的免疫應(yīng)答水平極低，甚至低于正常健康時(shí)的免疫耐受狀態(tài)，這可能是由于耐藥結(jié)核病患者體內(nèi)Mac無(wú)法正常識(shí)別或處理MTB-Ag肽并提呈給CTL引起，也有可能是由于CTL功能缺陷，無(wú)法正常分泌細(xì)胞毒分子引起的。RCTL作用于SMTB-SMac，RMTB-RMac，Mac空白對(duì)照后，其分泌穿孔素與顆粒溶素水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能由于耐藥結(jié)核病患者CTL細(xì)胞功能受損，在體外單獨(dú)培養(yǎng)后，也保持免疫缺陷特性，即使是非耐藥MTB-Ag刺激，也無(wú)法使RCTL發(fā)揮正常的細(xì)胞毒作用。RCTL經(jīng)SMTB-SMac和對(duì)照組NMac刺激后各細(xì)胞毒分子分泌水平不僅顯著低于SCTL組，甚至明顯低于NCTL組，特別就顆粒溶素，分泌量極低，這進(jìn)一步說(shuō)明耐藥MTB患者CTL細(xì)胞免疫功能受損，其細(xì)胞毒活性遠(yuǎn)低于非耐藥MTB患者，且低于正常健康人群。

非耐藥組患者外周血中CTL與不同MTB-Ag共培養(yǎng)后，其分泌細(xì)胞毒分子水平都顯著高于耐藥組和正常組CTL，說(shuō)明非耐藥結(jié)核患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)良好，并被積極調(diào)動(dòng)參與到機(jī)體對(duì)MTB的防御中，即使是在體外培養(yǎng)，SCTL仍能發(fā)揮良好的細(xì)胞毒作用。當(dāng)耐藥患者M(jìn)TB-Ag體外刺激相應(yīng)Mac，再與非耐藥MTB患者CTL細(xì)胞共培養(yǎng)（SCTL+RMTB-RMac），發(fā)現(xiàn)其對(duì)SCTL細(xì)胞毒作用的激活能力確實(shí)較SMTB-SMac組（SCTL+SMTB-SMac）弱。這可能就由于耐藥MTB患者其自身Mac在分離之前已經(jīng)出現(xiàn)免疫損傷，其抗原攝取，處理及提呈MTB-Ag過(guò)程中某個(gè)環(huán)節(jié)能力減弱，或者是均有所損傷，從而導(dǎo)致耐藥MTB患者的MTB-Ag肽對(duì)SCTL的刺激強(qiáng)度不夠；或者與CTL結(jié)合能力受損，導(dǎo)致其刺激SCTL分泌細(xì)胞毒分子的能力較非耐藥MTB患者的Mac弱。同時(shí)，SCTL+RMTB-RMac的穿孔素，顆粒酶B和顆粒溶素雖然低于SCTL+SMTB-SMac，卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RCTL+RMTB-RMac組，甚至其顆粒溶素及顆粒酶的分泌量還高于NCTL+RMTB-RMac。說(shuō)明即便是耐藥患者M(jìn)ac可能存在功能受損，能夠提呈的MTB-Ag肽有限，SCTL也能對(duì)這有限的耐藥MTB-Ag刺激產(chǎn)生良好免疫應(yīng)答。

耐藥組Mac上TLR2及Caspase-3水平顯著低于非耐藥者，其誘導(dǎo)自身凋亡能力減弱。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）為膜結(jié)合的一類模式識(shí)別受體（pattern recognize receptors，PRRs），TLR2在抗結(jié)核中發(fā)揮重要作用。結(jié)核分枝桿菌能通過(guò)抑制免疫應(yīng)答來(lái)增強(qiáng)其在巨噬細(xì)胞的存活期，有部分原因是因?yàn)樗鼜?fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。結(jié)核桿菌的脂蛋白能被TLR2識(shí)別激活固有免疫細(xì)胞，介導(dǎo)抗分枝桿菌適應(yīng)性免疫，巨噬細(xì)胞內(nèi)P38磷酸化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生都依賴于TLR2[10]。有研究發(fā)現(xiàn)MTB刺激的TLR2能在P38MAPK（p38 mitogenactivatedprotei kinase）持續(xù)磷酸化的作用下增強(qiáng)ROS產(chǎn)物，ROS可以通過(guò)Caspase途徑引起細(xì)胞凋亡。移植了已感染MTB的預(yù)凋亡Mac后可以增強(qiáng)T細(xì)胞免疫并控制感染[11]，感染了MTB細(xì)胞的凋亡可以增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌復(fù)制的控制并增強(qiáng)特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，后者需要凋亡Mac提呈相應(yīng)MTB抗原，而前面已述CTL可以通過(guò)分泌溶細(xì)胞分子經(jīng)Caspase途徑促進(jìn)Mac凋亡。

筆者發(fā)現(xiàn)SMTB-SMac上清液中TLR2及Caspase-3水平明顯高于RMTB-RMac，說(shuō)明非耐藥組巨噬細(xì)胞較耐藥組巨噬細(xì)胞能更高水平地表達(dá)TLR2及Caspase-3，進(jìn)而更好的識(shí)別，吞噬MTB-Ag并提呈給CTL，并且能更好地促進(jìn)已吞噬了MTB的巨噬細(xì)胞的凋亡；在SMTB-SMac，RMTB-RMac分別加入相應(yīng)CTL后，發(fā)現(xiàn)SCTL+SMTB-SMac細(xì)胞上清液中TLR2（t=6.735，P＜ 0.001）及Caspase-3（t=5.602，P＜0.001）水平明顯高于SMTB-SMac，而RCTL+RMTB-RMac與，RMTBRMac沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TLR2（t=1.536，P=0.142）Caspase-3（t=0.089，P=0.930），這反應(yīng)出可能在耐藥結(jié)核患者機(jī)體內(nèi)RCTL并不能上調(diào)對(duì)Mac表達(dá)TLR2，但是非耐藥結(jié)核患者的SCTL具有這種正向調(diào)節(jié)能力。SCTL+SMTB-SMac與RCTL+RMTB-RMac相比較更是差異顯著。說(shuō)明SCTL與吞噬了SMTB的巨噬細(xì)胞結(jié)合后，可以上調(diào)其表達(dá)TLR2，更有助于后者將MTB-Ag提呈給SCTL，發(fā)揮SCTL細(xì)胞免疫功能。以上兩點(diǎn)進(jìn)一步說(shuō)明在非耐藥結(jié)核患者體內(nèi)無(wú)論是CTL還是Mac的細(xì)胞免疫功能都高于耐藥結(jié)核患者。

同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中觀察到SCTL作用于RMTB-RMac（SCTL+RMTB-RMac）后，后者 TLR2與Caspase-3水平明顯較RCTL+RMTB-RMac提高。因此筆者大膽推測(cè)SCTL能夠促進(jìn)RMTB-RMac的自身凋亡，從而達(dá)到殺傷清除吞噬在其內(nèi)體中的耐藥MTB。

綜上，經(jīng)耐藥MTB-Ag致敏的耐藥CTL細(xì)胞分泌穿孔素，顆粒酶B和細(xì)胞溶素的能力及其Mac上TLR2和Caspase-3表達(dá)確實(shí)顯著低于非耐藥MTB-Ag致敏的SCTL，說(shuō)明耐藥MTB的耐藥特性與其能使CTL活性受損且不能有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)而逃避機(jī)體的免疫應(yīng)答有一定關(guān)系；同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將非耐藥肺結(jié)核患者的CTL與耐藥MTB-Ag共同培養(yǎng)后上述溶細(xì)胞分子分泌水平明顯高于耐藥患者的CTL，且耐藥Mac上TLR2和Caspase-3表達(dá)也大幅提高。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)僅僅是對(duì)異煙肼和利福平雙重耐藥肺結(jié)核患者的CTL的抗結(jié)核免疫功能作了一個(gè)初步探討，其具體還涉及到哪些免疫分子和信號(hào)傳導(dǎo)通路，尚未可知，還有待進(jìn)行一步研究。