轉(zhuǎn)錄因子EB在同型半胱氨酸誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用

柴麗芬 王艷華 吳琪瑞 王睿 李淑霞 劉林英 石青 吳凱 張慧萍

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川750001）；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（銀川750004）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種妊娠期特有疾病，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡與增殖平衡失調(diào)是PE發(fā)生的關(guān)鍵[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠的婦女相比，PE患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，但其機(jī)制不清。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy），是蛋氨酸代謝過程中的重要產(chǎn)物，通過影響細(xì)胞功能、參與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及改變基因表達(dá)活性等多種環(huán)節(jié)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控，進(jìn)而誘發(fā)疾病的發(fā)生[3]。另有研究[4]發(fā)現(xiàn)，正常妊娠時(shí)，血清Hcy濃度降低，而PE患者的血清Hcy濃度較正常孕婦升高，以上提示，在PE發(fā)生的過程中，Hcy可能促進(jìn)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，但機(jī)制不清。轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）是亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，以磷酸化狀態(tài)穩(wěn)定于細(xì)胞漿，受到不良刺激后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄，從而參與多種病理生理過程，如：調(diào)節(jié)線粒體功能、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡、抑制炎癥因子釋放等[5]，但其在Hcy引起的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用尚不清楚。因此，本研究以人源胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞為研究對(duì)象，利用不同濃度Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞并過表達(dá)TFEB后，檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化，從而探討TFEB在Hcy誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株（HTR8-S/Vneo）購自上海瑞鹿生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（碧云天生物技術(shù)研究所）；CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Cell Viability Imaging Kit試劑盒（Roche Applied Science公司）RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒（Takara生物公司）；蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒（南京凱基有限公司）；Cleaved-caspase3抗體（ab49822）、Bcl-2抗體（ab692）、TFEB抗體（D207D），羊抗兔或鼠二抗（Abcam公司）；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、1%雙抗1640培養(yǎng)基，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞（HTR8-S/Vneo）。

1.2.2 CCK8檢測(cè)HTR8-S/Vneo細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長期的HTR8-S/Vneo，制成2×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁及生長狀態(tài)良好，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后，各組分別加入不同濃度Hcy（0、0.1、0.2、0.5、1、2、2.5、5 mmol/L）孵育48 h，然后，每孔加入10 μL CCK8試劑，放至培養(yǎng)箱共同孵育4 h，取出培養(yǎng)板于酶標(biāo)儀上490 nm測(cè)定各孔OD值，通過與正常組比較求出存活率。同時(shí)，繪制不同濃度Hcy對(duì)HTR8-S/Vneo生長活力的影響曲線圖。

1.2.3 細(xì)胞活力熒光測(cè)定使用Cell Viability Imaging Kit試劑盒，檢測(cè)前選擇生長狀態(tài)較好的HTR8-S/Vneo細(xì)胞，分為正常組和Hcy組：（1）Hcy組，細(xì)胞經(jīng) 1 mmol/L Hcy處理 48 h；（2）正常組，10%1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后使用細(xì)胞活力熒光測(cè)定試劑盒進(jìn)行染色，共聚焦顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞活力情況。

1.2.4 qRT-PCR法檢測(cè)兩組TFEB mRNA表達(dá)按照總RNA抽提試劑盒說明書抽提總RNA，分析樣品純度及濃度。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫查詢TFEB的基因序列并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。TFEB引物，上游：5′-ACCTGTCCGAGACCTATGGG-3′，下游：5′-CGTCCAGACGCATAATGTTGTC-3′，GAPDH 引物，上游：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。熒光PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性 30 s，95℃變性5 s、57℃退火34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，分析qRT-PCR原始數(shù)據(jù)，用內(nèi)參基因GAPDH校正，結(jié)果用2-△△CT計(jì)算。

1.2.5 TFEB腺病毒感染HTR-8/SVneo細(xì)胞委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建TFEB腺病毒過表達(dá)載體，感染前選擇生長狀態(tài)較好的HTR8-S/Vneo進(jìn)行培養(yǎng)，吸去舊培養(yǎng)液，PBS洗1遍，加入調(diào)整好滴度的腺病毒液，病毒感染細(xì)胞6 h后，棄掉培養(yǎng)液，加入新含血清培養(yǎng)液，感染48 h后，收集細(xì)胞。

1.2.6 Westernblot檢測(cè)Cleaved-caspase3、Bcl-2、TFEB蛋白表達(dá) 收集各組滋養(yǎng)細(xì)胞，提取總蛋白并定量，加入上樣緩沖液煮沸變性。每孔蛋白樣品30 μg，SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至孔徑0.22 μm 硝酸纖維素薄膜；含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉2 h；加入一抗（兔抗TFEB，1∶1 000；鼠抗Bcl-2，1∶1 000；兔抗Cleaved-caspase3，1∶1 000；β-actin兔抗，1∶1 000），4℃ 過夜；PBST 洗滌10 min，3次；再加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），搖床孵育2 h；PBST洗滌10 min，3次；加入ECL顯色底物，凝膠成像分析儀上成像。進(jìn)行目的基因灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，計(jì)量資料兩組對(duì)比采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，組間的兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞存活率的影響不同濃度的Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞48 h后，CCK8法檢測(cè)并計(jì)算各組細(xì)胞存活率。與正常組比較，Hcy干預(yù)后細(xì)胞存活率降低，在濃度為1 mmol/L時(shí)細(xì)胞存活率69.4%，而在2 mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率降低至33%（故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均選用1 mmol/L Hcy濃度為實(shí)驗(yàn)組），提示Hcy對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生長有抑制作用。見圖1。

2.2 細(xì)胞活力熒光測(cè)定觀察Hcy對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞活力的影響1 mmol/L Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后，細(xì)胞活力熒光測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞活力（綠色為細(xì)胞有活力，紅色為細(xì)胞無活力，藍(lán)色為細(xì)胞核），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常組細(xì)胞活力正常；Hcy組與正常組比較，紅染細(xì)胞及細(xì)胞碎片明顯增多，細(xì)胞活性顯著降低。見圖2。

圖1 Hcy對(duì)HTR-8/SVneo增殖活力的影響Fig.1 Effect of Hcy on proliferation activity of HTR-8/SVneo

2.3 Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)1 mmol/L Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后，運(yùn)用Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)改變。與正常組比較，Hcy組Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量增高，Bcl-2表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果提示：Hcy可能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。見圖3。

2.4 Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后TFEB的表達(dá)1 mmol/L Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后，采用qRT-PCR及Western blot檢測(cè)TFEB的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與正常組比較，Hcy組中TFEB mRNA表達(dá)量降低，TFEB蛋白表達(dá)趨勢(shì)與TFEB mRNA表達(dá)趨勢(shì)一致，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示Hcy抑制了TFEB的表達(dá)。見圖4。

圖2 Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化Fig.2 Changes of cell viability after Hcy intervention of HTR-8/SVneo cells

2.5 過表達(dá)TFEB并驗(yàn)證表達(dá)效果為進(jìn)一步探討TFEB在Hcy促滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用，將TFEB重組包裝的腺病毒感染滋養(yǎng)細(xì)胞，并運(yùn)用Western blot驗(yàn)證過表達(dá)效果，結(jié)果呈現(xiàn)出Ad-TFEB組TFEB表達(dá)顯著升高，提示TFEB重組腺病毒感染成功。見圖5。

2.6 過表達(dá)TFEB后檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的改變HTR-8/SVneo感染TFEB過表達(dá)腺病毒，同時(shí)再給予1mmol/L Hcy干預(yù)48 h后，運(yùn)用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)TFEB后，Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示TFEB抑制Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。見圖6。

3 討論

胎盤是母體與胎兒間進(jìn)行物質(zhì)交換的器官，其中胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞是妊娠得以建立和維持的基礎(chǔ)，占妊娠胎盤的主要部分。已有研究表明胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能和形態(tài)異常影響其浸潤、遷移及胎盤的種植[6-8]。PE患者胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡較正常孕婦明顯增加，提示妊娠期間胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡可能是PE的重要致病因素之一[9]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠早期高的Hcy能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖從而影響其侵襲過程[10]。周登詩等研究發(fā)現(xiàn)，PE患者的血清Hcy濃度較正常孕婦升高，而在正常妊娠時(shí)，血清Hcy濃度是降低的[11-13]，這意味著在PE發(fā)生的過程中，較高濃度的同型半胱氨酸可能會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，從而影響其浸潤、遷移及胎盤的種植。本研究中Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力及存活率均降低，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3明顯升高、Bcl-2降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。細(xì)胞凋亡通路包括死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路及線粒體通路，研究表明過高濃度Hcy可通過過度激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體應(yīng)激，引起細(xì)胞凋亡[14-15]。其中，在線粒體應(yīng)激途徑中，Hcy誘導(dǎo)線粒體功能障礙，導(dǎo)致caspase依賴的級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)激活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡事件發(fā)生。

圖3 Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expression of Cleaved caspase3 and Bcl-2 in HTR-8/SVneo cells after treated with Hcy

圖4 Hcy干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞后TFEB的表達(dá)Fig.4 Expression of TFEB in HTR-8/SVneo cells after treated with Hcy

圖5 TFEB腺病毒感染HTR-8/SVneo后Western blot檢測(cè)TFEB的蛋白表達(dá)Fig.5 The protein expression of TFEB detected by Western blot after infected with TFEB adenovirus in HTR-8/SVneo

圖6 過表達(dá)TFEB同時(shí)Hcy干預(yù)后檢測(cè)Cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.6 The protein expression of Cleaved caspase3 and Bcl-2 were detected after over-expressed TFEB and treated with Hcy

近年，研究發(fā)現(xiàn)TFEB這一家族的分子在脊椎動(dòng)物中結(jié)構(gòu)相似，具有遺傳保守性，序列中都包含有一段可識(shí)別的DNA特殊結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，與細(xì)胞的發(fā)生和分化密切相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)，TFEB可在多種類型的細(xì)胞中廣泛表達(dá)，正常狀態(tài)下大部分TFEB以無活性的磷酸化形式定位于胞漿，當(dāng)受到負(fù)性應(yīng)激時(shí)被激活脫磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，通過識(shí)別、啟動(dòng)下游相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，參與多種生理病理過程[5，16-17]。LI等[18]發(fā)現(xiàn)檸檬酸克羅米芬（CC），可促進(jìn)TFEB的核易位，增加細(xì)胞的溶酶體生物發(fā)生，抑制細(xì)胞活力，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在糖尿病足細(xì)胞，帕金森病患者神經(jīng)細(xì)胞等的細(xì)胞凋亡過程中TFEB也均發(fā)生明顯變化，提示TFEB可參與調(diào)控細(xì)胞凋亡，但目前在滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡中是否亦同樣發(fā)生變化，尚無文獻(xiàn)報(bào)道[16，19]。本實(shí)驗(yàn)利用Hcy干預(yù)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡模擬PE病理變化，檢測(cè)TFEB的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)較高濃度Hcy干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞可導(dǎo)致其降低，提示TFEB在Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制中可能起到了重要作用。為了進(jìn)一步探討TFEB在Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)過表達(dá)TFEB后發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡水平降低，暗示TFEB抑制了Hcy誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在KANG等[20]的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TFEB可以明顯增加抗氧化應(yīng)激蛋白的表達(dá)，促進(jìn)線粒體生物合成，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，從而抑制凋亡的線粒體調(diào)控途徑。

綜上，TFEB在Hcy誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中可能起到保護(hù)作用，這就提示TFEB可能參與了高Hcy致PE的發(fā)病過程，但機(jī)制不明，是否與其抑制凋亡作用相關(guān)需進(jìn)一步研究。