酶法催化酸解合成富含OPO的人乳替代脂

鄒 碩，王笑寒，王小三，金青哲，王興國(guó)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

對(duì)嬰幼兒來說，母乳是生長(zhǎng)發(fā)育過程中最理想的食物來源。乳脂肪作為母乳的重要成分之一，雖然僅占母乳的3%～5%，卻能提供50%～60%的能量，也提供必需脂肪酸、脂溶性維生素和生物活性物質(zhì)，是嬰兒成長(zhǎng)所需能量的主要來源[1]。乳脂肪中甘油三酯大部分都是USU結(jié)構(gòu)(U不飽和，S飽和)，這與大部分植物油的構(gòu)型顯著不同[2]。大量文獻(xiàn)證實(shí)，1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)是典型的USU結(jié)構(gòu)，在母乳中含量高，可以預(yù)防嬰兒便秘，防止嬰兒礦物質(zhì)流失和為嬰兒提供充足的能量[3-7]。乳脂肪進(jìn)入嬰兒體內(nèi)后，首先在胃中被胃脂酶進(jìn)行初步消化，10%～30%的甘油三酯在此過程中被消化。而后脂肪球經(jīng)胃排空作用進(jìn)入小腸，被胰脂酶水解成sn-2位單甘酯和游離脂肪酸[8]。sn-2位單甘酯能直接被小腸吸收，給嬰兒供能。而游離脂肪酸若熔點(diǎn)高于人體體溫，則容易在小腸的酸性環(huán)境下與鈣、鎂離子發(fā)生皂化反應(yīng)，引起能量和鈣丟失，導(dǎo)致嬰兒產(chǎn)生便秘等不良反應(yīng)[9]。考慮到棕櫚酸熔點(diǎn)高于體溫，因此在生產(chǎn)人乳替代脂時(shí)應(yīng)使大部分棕櫚酸在sn-2位，以避免上述情況發(fā)生。

由于我國(guó)嬰幼兒純母乳喂養(yǎng)率不斷下降，嬰幼兒奶粉消費(fèi)量呈快速上升趨勢(shì)，這給奶粉市場(chǎng)帶來了巨大商機(jī)。而OPO作為母乳中重要的功能成分，是許多廠家致力于模擬的對(duì)象。文獻(xiàn)中關(guān)于酶法合成OPO的報(bào)道很多，常見的原料有豬油、巴沙鯰魚油和棕櫚硬脂三大類。李昕倩等[10]以豬油和油酸為原料，選擇Candidasp. 99-125脂肪酶作催化劑，在無溶劑體系下反應(yīng)，產(chǎn)物中含有43%以上的OPO。黃磊等[11]以巴沙鯰魚油和油酸為原料，Lipozyme RM IM脂肪酶作催化劑催化反應(yīng)，產(chǎn)物中OPO含量達(dá)到34.28%。李世磊等[12]以52℃棕櫚硬脂和油酸為原料，Lipozyme RM IM脂肪酶作催化劑催化反應(yīng)，產(chǎn)物中OPO含量達(dá)45.23%。豬油雖然與母乳脂肪酸組成相似，分提后OPO含量也較高[13]，但無法通過HALAL清真認(rèn)證，在推廣上有一定局限性。巴沙鯰魚油雖然原料豐富，但是產(chǎn)品中OPO含量較低，資源利用率較低。棕櫚硬脂來源廣泛，價(jià)格低廉，但在sn-2位上棕櫚酸含量不夠高，若想產(chǎn)品中得到含量更高的OPO，需對(duì)棕櫚硬脂進(jìn)行進(jìn)一步處理。綜上所述，目前市場(chǎng)上有關(guān)OPO的產(chǎn)品很多，但絕大部分產(chǎn)品中OPO含量都低于50%，純度不足以滿足市場(chǎng)的需求。為了得到純度足夠高的產(chǎn)品，本文從兩方面著手：一方面對(duì)原料進(jìn)行進(jìn)一步處理，將棕櫚硬脂分提，得到三棕櫚酸甘油三酯(PPP)含量超過90%的棕櫚硬脂——制備OPO的理想原料；另一方面對(duì)酶法催化酸解反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以求在經(jīng)濟(jì)合理的情況下得到純度更高的富含OPO的產(chǎn)品。

本文以棕櫚硬脂和油酸為原料，酶法催化酸解合成富含OPO的人乳替代脂。首先對(duì)棕櫚硬脂進(jìn)行分提，得到PPP含量足夠高的棕櫚硬脂作為反應(yīng)底物。再在無溶劑體系下，探究不同酶種類、反應(yīng)時(shí)間、底物摩爾比、反應(yīng)溫度、脂肪酶用量對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的影響，得到最優(yōu)反應(yīng)條件，最后采用高效液相色譜與氣相色譜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的甘油三酯及sn-2位脂肪酸組成進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

58℃棕櫚硬脂，東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司；商業(yè)化油酸(純度為89.6%)，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；固定化脂肪酶NS40086、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM，諾維信(中國(guó))投資有限公司；豬胰脂酶，Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司；TLC硅膠板60G(10 cm×20 cm)，煙臺(tái)江友硅膠有限公司；正己烷、異丙醇和甲醇為色譜純，百靈威科技有限公司；乙醚、膽酸鈉、氯化鈣、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、冰醋酸和乙醚為分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑上海有限公司。

AR2140電子精密天平，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，TGL-16B離心機(jī)，IKAHS 7加熱磁力攪拌器，Agilent 7820A氣相色譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀，ELSD 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棕櫚硬脂的分提

將20 g棕櫚硬脂與100 mL丙酮混合，在60℃下溶解，然后降溫至38℃，養(yǎng)晶3 h，迅速分離得到固體部分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到富含PPP的棕櫚硬脂。

1.2.2 OPO的合成

將富含PPP的棕櫚硬脂和油酸按一定摩爾比混合，加入到密閉的容器中，加入一定量的脂肪酶，在一定溫度下磁力攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后，離心沉降去除脂肪酶，再按質(zhì)量體積比1∶10加入正己烷溶解，置于分液漏斗，加入0.5 mol/L的KOH-CH3CH2OH溶液，劇烈振蕩，靜置分層后取上層，再加入10倍體積的去離子水振蕩，靜置分層后取上層[14]，即為反應(yīng)產(chǎn)物OPO。

1.2.3 高效液相色譜法分析甘油三酯組成

將樣品溶于色譜純正己烷中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品，過膜，采用配備有蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和Lichrospher C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)的高效液相色譜儀進(jìn)行分析。

色譜條件：柱溫30℃；梯度洗脫條件為0～40 min 60%乙腈、40%異丙醇，45～85 min 55%乙腈、45%異丙醇，85～90 min 60%乙腈、40%異丙醇；洗脫流速0.8 mL/min；霧化室溫度55℃；氣體流速1.8 L/min；增益1。采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量。

1.2.4 氣相色譜法分析脂肪酸組成

1.2.4.1 分提產(chǎn)物脂肪酸分析

將分提產(chǎn)物根據(jù)GB 5009.168—2016和實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行甲酯化處理。取20 mg樣品于5 mL離心管中，溶于1.5 mL正己烷，加入500 μL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，振蕩反應(yīng)2 min。加入適量無水硫酸鈉，振蕩脫水。靜置后吸取上清液，過0.22 μm有機(jī)濾膜后進(jìn)行GC分析。將脂肪酸甲酯的保留時(shí)間同Supelco 37脂肪酸甲酯混標(biāo)比較進(jìn)行脂肪酸定性分析。采用面積歸一化法進(jìn)行各脂肪酸的定量。

1.2.4.2 反應(yīng)產(chǎn)物sn-2位脂肪酸分析

反應(yīng)產(chǎn)物的水解產(chǎn)物2-MAG的制備按照GB/T 24894—2010進(jìn)行。取50 mg樣品于15 mL離心管，依次加入0.7 mL氯化鈣溶液、1.25 mL膽酸鈉溶液和7 mL Tris-HCl緩沖液(pH 7.6)，再加入30 mg豬胰脂酶，振蕩1 min。置于37℃水浴振蕩3 min，取出后振蕩30 s，重復(fù)兩次，最后一次水浴時(shí)間縮短為2 min。取出后在流動(dòng)的冷水下冷卻，加入2 mL乙醚振蕩，離心(4 000 r/min，3 min)后取上清液，氮吹至近干濃縮。將濃縮液點(diǎn)樣在硅膠板上，展開劑為正己烷-乙醚-乙酸(體積比為50∶50∶1)。將2-MAG的條帶刮下，用乙醚提取，氮吹除去乙醚得2-MAG。根據(jù)GB 5009.168—2016甲酯化方法處理，取10 mg上述2-MAG 于1.5 mL離心管中，溶于700 μL正己烷，加入375 μL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，振蕩反應(yīng)2 min。加入無水硫酸鈉，振蕩脫水。靜置后吸取上清液，過膜進(jìn)行GC分析。脂肪酸定性定量方法同1.2.4.1。

1.2.4.3 氣相色譜分析條件

采用配備火焰離子化檢測(cè)器的Agilent 7820A氣相色譜儀進(jìn)行分析，分析柱為Trace Tr-Fame(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序?yàn)椋?0℃保留3 min，5℃/min升溫至180℃，保留15 min，最終以2℃/min升溫至220℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)底物分析

分提后的棕櫚硬脂的甘油三酯及脂肪酸組成分析結(jié)果如表1、表2所示。

表1 分提后的棕櫚硬脂甘油三酯組成

表2 分提后的棕櫚硬脂脂肪酸組成 %

從表1、表2可以看出，分提后的棕櫚硬脂中PPP含量達(dá)到了92.32%，棕櫚酸含量也高于90%，是制備高含量OPO的理想原料。原料油酸的純度為89.6%，可作為良好的?；w。因此，以分提后的棕櫚硬脂與高純度油酸為原料，制備富含OPO的人乳替代脂，是一條經(jīng)濟(jì)實(shí)用的技術(shù)路線。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 脂肪酶種類的影響

將富含PPP的棕櫚硬脂和油酸以底物摩爾比1∶8混合，分別加入占底物總質(zhì)量10%的固定化脂肪酶NS40086、Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM，在60℃下反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 脂肪酶種類對(duì)OPO含量、sn-2位棕櫚酸含量的影響

從圖1可以看出，使用3種脂肪酶分別催化反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)物中sn-2位棕櫚酸含量均穩(wěn)定保持在80%以上，而使用脂肪酶NS40086時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量最高。因此，選擇脂肪酶NS40086作為進(jìn)一步研究的條件。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的影響

將富含PPP的棕櫚硬脂和油酸以底物摩爾比1∶8混合，脂肪酶NS40086用量為底物總質(zhì)量的10%，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)過程中每小時(shí)間隔取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)OPO含量、sn-2位棕櫚酸含量的影響

從圖2可以看出，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物中OPO含量逐漸上升，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，OPO含量達(dá)到67.21%。反應(yīng)時(shí)間超過4 h后，OPO含量趨于穩(wěn)定。這說明酸解反應(yīng)經(jīng)過4 h后達(dá)到平衡。產(chǎn)物中sn-2位棕櫚酸含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，表明反應(yīng)過程中出現(xiàn)了?；D(zhuǎn)移，并且反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)?；D(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。體系中?；D(zhuǎn)移量越多，會(huì)降低反應(yīng)產(chǎn)物的純度，增加副產(chǎn)物?？紤]到原料成本及以上情況，選擇4 h作為進(jìn)一步研究的條件。

2.2.3 底物摩爾比的影響

保持其他反應(yīng)條件不變，將富含PPP的棕櫚硬脂和油酸以1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15不同摩爾比混合，反應(yīng)結(jié)束后取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物摩爾比對(duì)OPO含量、sn-2位棕櫚酸含量的影響

酶催化的酸解反應(yīng)是可逆反應(yīng)，較高的底物摩爾比有利于平衡向正反應(yīng)方向移動(dòng)，但也會(huì)為后續(xù)的脫酸帶來困難，同時(shí)增加了經(jīng)濟(jì)成本。從圖3可以看出：當(dāng)?shù)孜锬柋扔?∶8增加至1∶10時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量由60.45%增加至68.29%，增加7.84個(gè)百分點(diǎn)；當(dāng)?shù)孜锬柋扔?∶10增加至1∶12時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量增加4.24個(gè)百分點(diǎn)；而當(dāng)?shù)孜锬柋扔?∶12增加至1∶15時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量增加3.64個(gè)百分點(diǎn)。這說明產(chǎn)物中OPO增加量隨著底物摩爾比的增加而不斷降低。同時(shí)產(chǎn)物中sn-2位棕櫚酸含量隨著底物摩爾比的增加逐漸降低，表明底物中較高的游離脂肪酸含量對(duì)酰基轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。綜合以上分析，選擇底物摩爾比1∶10作為進(jìn)一步研究的條件。

2.2.4 酶用量的影響

保持其他反應(yīng)條件不變，分別加入占底物總質(zhì)量6%、8%、10%、12%、15%的脂肪酶NS40086，反應(yīng)結(jié)束后取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，產(chǎn)物中OPO含量隨著酶用量的增加而不斷增加。但從另一方面考慮，產(chǎn)物中sn-2位棕櫚酸含量隨著酶用量的增加而不斷下降，直到酶用量為12%時(shí)，sn-2位棕櫚酸含量基本保持穩(wěn)定。這表明高酶用量也會(huì)導(dǎo)致?；D(zhuǎn)移增加，但在酶用量高于12%后，?；D(zhuǎn)移現(xiàn)象基本不再增加。當(dāng)酶用量由8%增加至12%時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量增加較快，當(dāng)酶用量由12%增加至15%時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量增加較少，明顯低于前者?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本問題，綜合上述情況，選擇酶用量12%作為進(jìn)一步研究的條件。

圖4 酶用量對(duì)OPO含量、sn-2位棕櫚酸含量的影響

2.2.5 反應(yīng)溫度的影響

保持其他反應(yīng)條件不變，分別在55、60、65℃下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)OPO含量、sn-2位棕櫚酸含量的影響

較高的溫度可以提高反應(yīng)速率，從而縮短反應(yīng)達(dá)到平衡所需的時(shí)間，但是相應(yīng)也會(huì)增加?；D(zhuǎn)移的速率，降低反應(yīng)產(chǎn)物的純度。從圖5可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度由55℃上升至65℃過程中，sn-2位棕櫚酸的含量穩(wěn)定保持在80%以上，而在60℃時(shí)，產(chǎn)物中OPO含量最大。因此，為了在反應(yīng)效率較高的同時(shí)降低酰基轉(zhuǎn)移量，選擇最佳反應(yīng)溫度為60℃。

綜上所述，酶法催化酸解合成富含OPO人乳替代脂的優(yōu)化條件為：反應(yīng)時(shí)間4 h，底物摩爾比1∶10，反應(yīng)溫度60℃，脂肪酶NS40086用量12%。

2.3 與市售人乳替代脂的比較

Infat作為市場(chǎng)占有率最高的人乳替代脂之一，將本文優(yōu)化條件下合成的產(chǎn)品與其進(jìn)行比較，結(jié)果如表3、表4所示。

表3 本產(chǎn)品和Infat的甘油三酯組成 %

表4 本產(chǎn)品和Infat的sn-2位脂肪酸組成 %

由表3、表4可知，在優(yōu)化條件下，酶催化酸解產(chǎn)物的OPO含量可達(dá)72.53%，sn-2位棕櫚酸含量為87.03%。而市售人乳替代脂Infat中的OPO含量與sn-2位棕櫚酸含量分別為21.21%、26.68%，遠(yuǎn)低于本產(chǎn)品。

3 結(jié) 論

本文以富含PPP的棕櫚硬脂和油酸為原料，通過酶法催化酸解反應(yīng)制備富含OPO的人乳替代脂。結(jié)果表明，酶法酸解反應(yīng)的優(yōu)化條件為：反應(yīng)時(shí)間4 h，底物摩爾比1∶10，反應(yīng)溫度60℃，脂肪酶NS40086用量12%。在優(yōu)化條件下，所得產(chǎn)品的OPO含量可達(dá)72.53%，sn-2位棕櫚酸含量為87.03%，高于市售同類產(chǎn)品Infat的OPO含量。值得一提的是，高效液相色譜分離同分異構(gòu)體十分困難，現(xiàn)階段研究難以僅通過高效液相色譜分析出sn-OPO的含量，須用氣相色譜加以輔助判斷，耗費(fèi)時(shí)間的同時(shí)增加了工作量。如何去除這些和目標(biāo)產(chǎn)物熔沸點(diǎn)相似的甘油三酯，得到只有OPO的甘油三酯，目前仍未有有效的解決方法，需要進(jìn)一步的研究。