褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達(dá)特性和功能

潘磊 王利華 朱鳳 韓陽(yáng)春 王培 方繼朝1, , 4,*

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達(dá)特性和功能

潘磊1, 2, #王利華2, #朱鳳3韓陽(yáng)春2王培2方繼朝1, 2, 4,*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 南京 210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所, 南京 210014;3江蘇省植物保護(hù)植物檢疫站, 南京 210036;4江蘇省區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 淮安 223300;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: fangjc126@126.com)

【目的】研究褐飛虱小分子量熱激蛋白的表達(dá)特性和功能，明確其在褐飛虱溫度脅迫適應(yīng)中的作用?！痉椒ā坎捎肂LAST從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選褐飛虱小分子量熱激蛋白基因序列；利用Bioedit、Mega等分子生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析；利用qPCR技術(shù)分析目的基因在不同處理下的表達(dá)特性；利用原核表達(dá)技術(shù)研究其功能。【結(jié)果】篩選到6個(gè)含有α-晶體結(jié)構(gòu)的小分子量熱激蛋白基因、、、、、，其ORF長(zhǎng)度依次為561、531、570、570、588和735 bp，理論等電點(diǎn)為5.96、5.77、6.32、5.01、5.74和7.74。在3齡若蟲(chóng)中的表達(dá)量最高，而和在雌成蟲(chóng)中的表達(dá)量最高。雌蟲(chóng)在低溫脅迫后所有小分量熱激蛋白基因的表達(dá)量均下降，高溫脅迫后除外的其他5個(gè)基因表達(dá)量不同程度上調(diào)；3齡若蟲(chóng)在低溫脅迫后一半表達(dá)量下降，另一半上升，高溫脅迫后全部上調(diào)。轉(zhuǎn)化褐飛虱的重組大腸桿菌熱激存活率顯著上升?！窘Y(jié)論】褐飛虱小分子量熱激蛋白具有齡期和誘導(dǎo)表達(dá)特性及熱脅迫保護(hù)功能，可能在其高溫脅迫應(yīng)激中具有重要作用，在低溫脅迫應(yīng)激中的作用與蟲(chóng)態(tài)有關(guān)。

褐飛虱；小分子量熱激蛋白；溫度；表達(dá)

褐飛虱（）是我國(guó)主要水稻害蟲(chóng)之一，從19世紀(jì)開(kāi)始，在我國(guó)頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)[1]。褐飛虱種群數(shù)量受溫度的影響，溫度過(guò)高或過(guò)低均抑制其種群發(fā)展[2]。在高溫脅迫下，褐飛虱成蟲(chóng)存活率下降、產(chǎn)卵量顯著降低[3-4]；低溫脅迫導(dǎo)致褐飛虱若蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)，存活率下降，卵孵化率降低甚至不孵化[5]。此外，溫度過(guò)高或過(guò)低還影響褐飛虱成蟲(chóng)翅的振動(dòng)頻率，削弱雄蟲(chóng)對(duì)雌蟲(chóng)翅振動(dòng)信號(hào)的接收，從而影響其種群發(fā)展[6]。

熱激蛋白是生物體內(nèi)廣泛存在的蛋白質(zhì)之一，在原核生物至高等動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)和調(diào)控是生物應(yīng)對(duì)多種內(nèi)外環(huán)境脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)其分子量大小可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量熱激蛋白(sHSPs)。小分子量熱激蛋白是分子量在12~43 kD之間的熱激蛋白，包含一個(gè)約95個(gè)保守氨基酸序列的α-晶體結(jié)構(gòu)，與生物正常生理狀態(tài)的維持、脅迫應(yīng)激等有關(guān)[7]；其主要功能為維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)定，保證膜的完整性和穩(wěn)定性，保護(hù)信使RNA，穩(wěn)定細(xì)胞骨架等[8-14]。

褐飛虱對(duì)熱脅迫的適應(yīng)與熱激蛋白有關(guān)。Lu等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱熱激蛋白HSP70和HSP90在其高溫脅迫保護(hù)中起重要作用，抑制其熱激蛋白基因和的表達(dá)使熱激后褐飛虱存活率顯著降低。Huang等[17]發(fā)現(xiàn)在37℃高溫脅迫后褐飛虱熱激蛋白上調(diào)表達(dá)；而5℃低溫處理后熱激蛋白基因表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。小分子量熱激蛋白作為熱激蛋白家族的重要成員，在昆蟲(chóng)抗逆性中起重要作用，如熱激顯著誘導(dǎo)小菜蛾()、中華蜜蜂()小分子量熱激蛋白基因的表達(dá)[18-19]。抑制灰飛虱()小分子量熱激蛋白基因的表達(dá)導(dǎo)致其對(duì)高溫的抗逆性下降[20]。因此，為了明確小分子量熱激蛋白在褐飛虱溫度脅迫適應(yīng)中的作用，解析褐飛虱適應(yīng)溫度脅迫的機(jī)制，從而為其種群數(shù)量預(yù)測(cè)及生態(tài)防控策略的制定提供理論依據(jù)，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出褐飛虱小分子量熱激蛋白基因，然后采用qPCR法研究不同齡期褐飛虱表達(dá)譜和溫度脅迫對(duì)雌成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)表達(dá)的影響，利用原核表達(dá)技術(shù)研究對(duì)熱脅迫的保護(hù)功能。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

褐飛虱種群2006年采自南京，室內(nèi)采用武運(yùn)粳7號(hào)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度27℃±1℃，相對(duì)濕度為65%±10%，光周期為光照14 h/黑暗10 h。不同齡期褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達(dá)差異性檢測(cè)時(shí)，收集同一天的初孵若蟲(chóng)置于30 cm×20 cm×18 cm的塑料筐中飼養(yǎng)，然后選擇發(fā)育一致的試蟲(chóng)，分別收集1、2、3、4、5齡若蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)，液氮速凍后貯存于?80℃冰箱，用于總RNA的提取。每個(gè)重復(fù)1齡若蟲(chóng)取40頭，2齡30頭，3齡20頭，4齡15頭，5齡10頭，雌成蟲(chóng)6頭，雄成蟲(chóng)10頭；每處理重復(fù)3次。

溫度誘導(dǎo)褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達(dá)特異性分析時(shí)，設(shè)置的溫度處理分別為0℃、6℃、10℃、14℃、18℃、22℃、30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、44℃，取羽化1 d的雌成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至12 cm×2.5 cm的指形管中，除0℃在冰水混合物中孵育外，其余均在臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器THZ-C-1中孵育1 h，26℃下恢復(fù)1 h，收集存活試蟲(chóng)，液氮速凍后貯存于?80℃。3次重復(fù)，以不進(jìn)行溫度脅迫的試蟲(chóng)為對(duì)照，用于總RNA提取。

1.2 褐飛虱小分子量熱激蛋白序列分析

褐飛虱小分子量熱激蛋白序列分析采用分子生物學(xué)軟件Bioedit、Mega等進(jìn)行。首先根據(jù)基因同源性采用離線BLAST從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出小分子量熱激蛋白基因，然后利用NCBI ORF Finder在線工具查找這些基因的開(kāi)放閱讀框，再設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證開(kāi)放閱讀框序列。利用ExPASy Translate Tool翻譯驗(yàn)證后的序列，Computer pI/Mw Tool計(jì)算等電點(diǎn)和理論分子量，Prosite預(yù)測(cè)小分子量熱激蛋白特征區(qū)域，Pfam預(yù)測(cè)小分子量熱激蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，Bioedit進(jìn)行序列比對(duì)，Mega 7.0.26構(gòu)建開(kāi)放閱讀框DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

1.3.1 總RNA的提取

總RNA的提取參照Promega公司的總RNA提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA分別使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整度，微量分光光度計(jì)(Eppendorf BioPhotometer Plus) 檢測(cè)其濃度，－80℃下貯存，用于qPCR模板的合成。

1.3.2 cDNA第1鏈的合成

cDNA第1鏈的合成參考TaKaRa的cDNA第一鏈合成試劑盒[PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)]說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以500 ng總 RNA為模板，加入2 μL 5×反轉(zhuǎn)錄預(yù)混緩沖液(PrimeScript RT Master Mix)，然后以去RNA酶水補(bǔ)至10 μL，37℃下溫育30 min，85℃下10 s滅活反轉(zhuǎn)錄酶后即得到第1鏈cDNA。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

qPCR參考單丹等[21]的方法，以β-actin（EU179846）為內(nèi)參[22]，取1 μL稀釋20倍的cDNA為模板，分別加入10 μL酶預(yù)混液（SYBR?Premix Ex Taq?）、0.4 μL Rox?參比染料（ROX Reference Dye）(50×)和0.4 μL 10 μmol/L上游和下游引物（引物序列見(jiàn)表1），以水補(bǔ)至20 μL。先95℃下預(yù)變性30 s，然后95℃下5 s，60℃下31 s，共40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行溶解曲線的擴(kuò)增。

1.4 小分子量熱激蛋白基因原核表達(dá)及BL21(DE3)耐熱性測(cè)定

根據(jù)Transgen公司pEASY-Blunt E1表達(dá)載體設(shè)計(jì)引物（引物序列見(jiàn)表1），擴(kuò)增小分子量熱激蛋白基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)，然后將目標(biāo)序列連接到載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。選擇正確表達(dá)方向的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）即獲得含小分子量熱激蛋白的重組細(xì)菌。重組細(xì)菌耐熱性測(cè)定參考Crack等[23]的方法。具體步驟為取50 μL菌液加入5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min下培養(yǎng)至OD值約0.6，然后加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，30℃、200 r/min下培養(yǎng)過(guò)夜，以含空載體的大腸桿菌為對(duì)照。取1 mL菌液置于50℃水浴鍋中分別溫育0.5 h和1 h，冰浴后稀釋104倍，取100 μL熱激處理前和處理后樣品分別涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后記錄平板菌落數(shù)，每處理4個(gè)重復(fù)。大腸桿菌熱激存活率=（熱激處理前菌落數(shù)?熱激處理后菌落數(shù)）÷熱激處理前菌落數(shù)×100%。

表1 qPCR和原核表達(dá)引物

表2 褐飛虱小分子量熱激蛋白序列特征

1.5 數(shù)據(jù)處理

小分子量熱激蛋白基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2法[24]。不同齡期小分子熱激蛋白基因表達(dá)差異以1齡若蟲(chóng)表達(dá)量為參照物計(jì)算其他齡期的相對(duì)表達(dá)量；不同溫度脅迫下小分子量熱激蛋白基因表達(dá)量的計(jì)算以不處理試蟲(chóng)為對(duì)照。結(jié)果均采用SPSS 19.0，ANOVA最小顯著性差異法在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

重組大腸桿菌耐熱性實(shí)驗(yàn)在相同處理時(shí)間水平比較表達(dá)小分子量熱激蛋白對(duì)大腸桿菌耐熱性的影響。轉(zhuǎn)化不同小分子量熱激蛋白基因后大腸桿菌存活率差異顯著性分析采用SPSS 19.0，ANOVA最小顯著性差異法在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

表3 褐飛虱小分子量熱激蛋白氨基酸序列間的一致性

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的序列特征

褐飛虱6個(gè)小分子量熱激蛋白基因開(kāi)放閱讀框堿基序列長(zhǎng)531~735 bp，預(yù)測(cè)氨基酸序列等電點(diǎn)為5.01~7.74，理論分子量為20.9~28.7 kD，均含有HSP20保守結(jié)構(gòu)域PF00011，即約95個(gè)氨基酸序列的α-晶體結(jié)構(gòu)（表2）。這些基因彼此間氨基酸序列同源性差異較大，同源性最高的是和，為68.2%；最低的是和NlHSP28.7，僅有6.9%（表3）。利用鄰接法構(gòu)建褐飛虱、黑腹果蠅（）和人類(lèi)（）小分子量熱激蛋白的開(kāi)放閱讀框序列進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自人類(lèi)的基因聚為一支，來(lái)自褐飛虱和黑腹果蠅的小分子量熱激蛋白雖然也表現(xiàn)出同一物種聚為一支的趨勢(shì)，但有些基因如褐飛虱與黑腹果蠅同源性更高（圖1）。

2.2 不同齡期褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的表達(dá)特異性

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在不同齡期中的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異。在3齡若蟲(chóng)中的表達(dá)量最高，和在5齡若蟲(chóng)中的表達(dá)量最高，和在雌成蟲(chóng)中的表達(dá)量最高，而在雄成蟲(chóng)中表達(dá)量最高。在1~5齡若蟲(chóng)中，除和外，其余基因的表達(dá)量在高齡若蟲(chóng)中略高于或者與低齡若蟲(chóng)相當(dāng)。在雌雄成蟲(chóng)之間，除和在雌蟲(chóng)中的表達(dá)量顯著高于雄蟲(chóng)外，其余無(wú)顯著差異（圖2）。

2.3 褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的誘導(dǎo)表達(dá)

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在高溫和低溫脅迫下的表達(dá)譜存在顯著差異。高溫脅迫下，雌成蟲(chóng)除表達(dá)無(wú)明顯變化外，其余小分子量熱激蛋白基因表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)(圖3-A)；若蟲(chóng)所有基因表達(dá)量均顯著上調(diào)(圖3-B)。其中和表達(dá)量在雌成蟲(chóng)和若蟲(chóng)中變化均非常顯著，最大誘導(dǎo)倍數(shù)在雌成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)中分別為61.8和181.4；最大上調(diào)倍數(shù)分別為525.5和306.0。、和最大誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)若蟲(chóng)大于成蟲(chóng)。最佳誘導(dǎo)溫度在不同基因間也存在顯著差異。雌成蟲(chóng)、、在42℃下處理后表達(dá)量最高，但在36℃熱激后表達(dá)量最高，而最高誘導(dǎo)表達(dá)量出現(xiàn)在33℃處理后(圖3-A)。3齡若蟲(chóng)、、在44℃下處理后表達(dá)量最高，其余基因在33℃下處理后表達(dá)量最高(圖3-B)。

低溫處理后，褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的表達(dá)量在雌成蟲(chóng)中均出現(xiàn)不同程度下降(圖4-A)，在3齡若蟲(chóng)中、和表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，但、和在18℃和0℃處理后表達(dá)量顯著增加(圖4-B)。不同基因最佳誘導(dǎo)溫度也存在顯著差異。如雌成蟲(chóng)在10℃處理后表達(dá)量最低，而在0℃處理后表達(dá)量最低(圖4-A)；3齡若蟲(chóng)在14℃處理后表達(dá)量最低，、、在0℃處理后表達(dá)量最高（圖4-B）。

HSPB開(kāi)頭的基因來(lái)自人類(lèi)，Dm前綴的基因來(lái)自于黑腹果蠅，Nl前綴的基因來(lái)自褐飛虱。

Fig. 1. Molecular Phylogenetictree of ORF DNA sequences offrom,andby Neighbor-Joining method.

柱上標(biāo)相同小寫(xiě)字母者表示材料間差異未達(dá)0.05顯著水平。

The same lowercase letters above the bars indicate no significant difference among the materials at the 0.05 level.

圖2 褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在不同齡期間的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 2. Relative expression level ofin different stage of

>A?雌成蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量; B?3齡若蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量。柱上標(biāo)相同小寫(xiě)字母者表示處理間差異未達(dá)0.05顯著水平。

A, Relative expression level ofof female; B, Relative expression level ofof the 3rd larvae. The same lowercase letters above the bars indicate no significant difference among the treatments at the 0.05 level.

圖3 高溫?zé)峒ず蠛诛w虱雌成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)小分子量熱激蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 3. The diagram showed the relative expression level ofofafter heat treatment.

A?雌成蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量; B?3齡若蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量。柱上標(biāo)相同小寫(xiě)字母者表示處理間差異未達(dá)0.05顯著水平。

A, Relative expression level ofof female after cold shock; B, Relative expression level ofof the 3rd larvae after cold shock. The same lowercase letters above the bars indicate no significant difference among the treatments at the 0.05 level.

圖4 低溫處理后褐飛虱雌成蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)小分子量熱激蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 4. Relative expression levels ofofafter cold treatment.

2.4 小分子量熱激蛋白重組大腸桿菌的耐熱性

表達(dá)褐飛虱小分子量熱激蛋白顯著提高大腸桿菌的耐熱性。含重組褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的大腸桿菌在高溫處理后，其30 min和60 min的存活率均顯著增加；但高溫?zé)峒?duì)大腸桿菌的傷害可能具有累加效應(yīng)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸桿菌存活率逐漸下降，60 min時(shí)其最高存活率僅為30 min的一半左右（圖5）。

3 討論

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因間序列一致性不高。小分子量熱激蛋白與其他熱激蛋白家族成員如HSP70等不同，其α-晶體結(jié)構(gòu)和N-、C-端經(jīng)歷了不同的進(jìn)化過(guò)程，導(dǎo)致sHSP在α-晶體結(jié)構(gòu)域部分非常保守，但是在N-、C-端變異較大[25]，使其氨基酸序列間差異也較大。褐飛虱小分子量熱激蛋白相互間氨基酸序列一致性最高的僅有68.2%，最低的為6.9%。盡管如此，小分子量熱激蛋白在昆蟲(chóng)間的同源性仍然高于昆蟲(chóng)與其他物種，而同一物種間的同源性也常高于不同物種[20]。褐飛虱與黑腹果蠅小分子量熱激蛋白開(kāi)放閱讀框DNA序列間遺傳距離小于其與人類(lèi)相關(guān)序列間的遺傳距離與此結(jié)果一致。

褐飛虱小分子量熱激蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)具有明顯的發(fā)育階段特異性，如和表達(dá)峰值出現(xiàn)在雌成蟲(chóng)中，表達(dá)峰值出現(xiàn)在3齡若蟲(chóng)中。這種發(fā)育階段相關(guān)的特異性表達(dá)可能與小分子量熱激蛋白在生物中的廣泛功能有關(guān)。小分子量熱激蛋白參與了昆蟲(chóng)變態(tài)、滯育、繁殖等多個(gè)生理過(guò)程，如桔小實(shí)蠅化蛹后小分子量熱激蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)可能與其變態(tài)有關(guān)[26]；而云杉卷葉蛾（）滯育前后小分子量熱激蛋白的差異表達(dá)則可能與滯育狀態(tài)有關(guān)[27]。褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在不同齡期的差異表達(dá)說(shuō)明這些基因在褐飛虱的發(fā)育中可能具有重要作用。

柱上標(biāo)相同小寫(xiě)字母者表示材料間差異未達(dá)0.05顯著水平。

Fig. 5. Survival of recombinant BL21(DE3)transformedafter heat treatment.

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因具有不同的誘導(dǎo)表達(dá)特異性。超過(guò)半數(shù)的基因受高溫?zé)峒ふT導(dǎo)，但仍有部分基因不被誘導(dǎo)或僅被輕微誘導(dǎo)。誘導(dǎo)表達(dá)的小分子量熱激蛋白在生物熱脅迫損傷保護(hù)中具有重要作用。小分子量熱激蛋白能阻止底物蛋白的聚集或失活，幫助底物蛋白重新折疊。高溫?zé)峒ず蠛诛w虱小分子量熱激蛋白轉(zhuǎn)錄水平增加可提高褐飛虱對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)力，但不同小分子量熱激蛋白可能應(yīng)對(duì)不同的高溫脅迫。、、等三個(gè)基因的誘導(dǎo)峰值出現(xiàn)在42℃~44℃，而在33℃，說(shuō)明可能應(yīng)對(duì)溫和高溫脅迫，而其余三個(gè)基因應(yīng)對(duì)極端高溫脅迫。二化螟也是如此，Lu等[28]發(fā)現(xiàn)該害蟲(chóng)有兩個(gè)小分子量熱激蛋白基因在42℃熱激后表達(dá)量最高，而另一個(gè)小分子量熱激蛋白基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在35℃。

褐飛虱組成型表達(dá)的小分子量熱激蛋白可能在其基礎(chǔ)抗性中起重要作用。與HSP70相似，部分小分子量熱激蛋白基因的表達(dá)幾乎不受熱激影響。Daugaard等[29]認(rèn)為誘導(dǎo)表達(dá)的HSP70主要應(yīng)對(duì)脅迫損傷，而組成型熱激蛋白HSC70在生物的組成型抗性和正常生理活動(dòng)中起重要作用。Jagla等[30]則認(rèn)為在非應(yīng)激狀態(tài)下，小分子量熱激蛋白表達(dá)的可能原因是保護(hù)重要的發(fā)育器官免受環(huán)境損害。褐飛虱和雖然在熱激后表達(dá)量變化不顯著，但轉(zhuǎn)化這兩個(gè)基因的大腸桿菌對(duì)高溫?zé)峒さ目鼓嫘燥@著增加，說(shuō)明這兩個(gè)基因在褐飛虱的基礎(chǔ)抗性中可能起重要作用。

與高溫脅迫不同，褐飛虱小分子量熱激蛋白在其低溫脅迫適應(yīng)中的作用與齡期有關(guān)。低溫處理后，褐飛虱雌成蟲(chóng)小分子量熱激蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著變化或呈現(xiàn)不同程度的下降，這與熱激蛋白HSP70相似，低溫脅迫后褐飛虱Hsp70s僅有1個(gè)基因的表達(dá)量略微上調(diào)[17, 21]。與雌成蟲(chóng)不同的是小分子量熱激蛋白在褐飛虱若蟲(chóng)的低溫抗性中可能具有一定的作用，其3齡若蟲(chóng)和在0℃處理后表達(dá)量顯著上升。但有趣的是褐飛虱3齡若蟲(chóng)小分子量熱激蛋白在低溫脅迫后的上調(diào)倍數(shù)遠(yuǎn)低于高溫?zé)峒?，其最大上調(diào)倍數(shù)在低溫脅迫后僅有10倍左右，但高溫?zé)峒ず蟾哌_(dá)300倍以上，在雌成蟲(chóng)中更是達(dá)到500倍以上。這一現(xiàn)象可能與褐飛虱的生物學(xué)特性有關(guān)。褐飛虱是一種遷飛性害蟲(chóng)，其越冬北界冬季日均最低氣溫在15℃左右，所以褐飛虱野外生存中一般不會(huì)遭遇極端低溫，而熱激蛋白是一類(lèi)主要的脅迫應(yīng)激蛋白，因此褐飛虱在進(jìn)化上可能較少保留上調(diào)熱激蛋白應(yīng)對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱小分子量熱激蛋白基因均含有Hsp20保守結(jié)構(gòu)域，其開(kāi)放閱讀框DNA序列與黑腹果蠅間的同源性高于人類(lèi)，彼此間氨基酸序列一致性不高。不同齡期褐飛虱小分子量熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異；高溫誘導(dǎo)后大多數(shù)基因的表達(dá)量顯著增加，而且表達(dá)這些基因的大腸桿菌的耐熱性也顯著提高。但低溫脅迫后的轉(zhuǎn)錄水平與齡期有關(guān)，在雌成蟲(chóng)中表達(dá)量不同程度下降，在3齡若蟲(chóng)中，一半表達(dá)量下降，一半上調(diào)。以上結(jié)果說(shuō)明褐飛虱小分子量熱激蛋白在其高溫抗逆性中可能具有重要作用，但其在低溫脅迫應(yīng)激中的作用受齡期影響。雌成蟲(chóng)對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制以及組成型表達(dá)的小分子量熱激蛋白在高溫脅迫保護(hù)之外的功能尚需進(jìn)一步研究。

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Expression Profiles and Functions of Small Heat Shock Proteins in

PAN Lei1, 2, #, WANG Lihua2, #, ZHU Feng3, HAN Yangchun2, WANG Pei2, FANG Jichao1, 2, 4, *

(1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;3Jiangsu Plant Protection and Plant Quarantine Station, Nanjing 210036, China;4Jiangsu Collaborative Innovation Center for Regional Modern Agriculture & Environmental Protection, Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: fangjc126@126.com)

【Objective】To explore the adaptation mechanisms of brown planthoppers(BPH) to temperature stress, the expression profiles and functions of small heat shock proteins (sHSPs) inwas studied. 【Method】The nucleotide sequence of small heat shock proteins inwas screened from transcriptome database by BLAST; The sequence analysis was carried out by molecular biological software such as Bioedit and Mega; the expression profiles were analyzed by qPCR; and the prokaryotic expression technology was used for functional research. 【Result】Six(,,,,and) with conserved alpha crystal structure were screened. The ORF length of these genes was 561, 531, 570, 570, 588 and 735 bp, and the theoretical isoelectric point was 5.96, 5.77, 6.32, 5.01, 5.74 and 7.74, respectively. The peak expression ofwas found in the third larvae and the peak ofandin females. The expression of these genes decreased in females after exposure to low temperature, while increased after exposure to high temperature except. To the 3rd instar nymphs, the expression of about half ofdecreased after low temperature stress and half ofincreased, while all increased after high temperature stress. Moreover, the survival of transformed BL21 (DE3) was significantly increased after heat treatment. 【Conclusion】The small heat shock protein ofhas stage-specific and inducible expression characteristics and show protection against heat stress. It may play an important role in response to high temperature stress, but its role in response to low temperature stress is related to insect developmental stages.

; small heat shock proteins; temperature; expression

Q755; S435.112+.3

A

1001-72169(2020)01-0037-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9034

2019-03-27;

2019-06-14。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2016YFD0300706）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31572004）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20170072）；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2017366)。