核酸探針和PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用

席少華 浮山縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山西臨汾 042600

核酸探針生物技術(shù)和新型多聚核酸酶鏈催化反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)兩種技術(shù)分別是近年來迅速發(fā)展應(yīng)用起來的兩種高新層次生物技術(shù)。自其產(chǎn)品問世以來，已在許多專業(yè)領(lǐng)域中得到了廣泛的研究應(yīng)用。本文將對(duì)這兩種檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)食品安全檢驗(yàn)行業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用前景作一定的綜述。

1 核酸探針檢測(cè)技術(shù)的基本原理

堿基配對(duì)是核酸檢測(cè)的基本原理之一?；パa(bǔ)鏈?zhǔn)莾蓚€(gè)線性核酸退火形成的雙鏈，也稱為線性核酸雙鏈雜交。核酸基因探針一般是指具有已知核酸序列的特定核酸基因片段與核酸標(biāo)記物。它通常能和與其序列互補(bǔ)的特定核酸基因序列雜交形成雙鏈。因此，該探針可應(yīng)用于待檢測(cè)的多種特異性核酸基因樣品中特異性核酸基因已知序列的核酸檢測(cè)。每種病原體都可能有一個(gè)獨(dú)特的核酸分離片段。通過核酸分離和復(fù)制標(biāo)記，這些核酸片段可用于制備用于疾病早期診斷和其他醫(yī)學(xué)研究的放射醫(yī)學(xué)探針。

2 核酸探針檢測(cè)技術(shù)在各類食品細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)中的廣泛應(yīng)用

2.1 以cnDNA為靶點(diǎn)和目標(biāo)的食品檢驗(yàn)

中國(guó)近期開展的各類食品細(xì)菌微生物化學(xué)檢驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目主要內(nèi)容包括食品細(xì)菌個(gè)體總數(shù)、大腸菌群、沙門菌、霉菌和各種酵母以及生物毒素等。設(shè)計(jì)序列探針時(shí)還需要依照當(dāng)前待測(cè)的檢測(cè)物中微生物特異的參數(shù)DNA設(shè)計(jì)序列。比如我們?cè)谠O(shè)計(jì)用來檢測(cè)一個(gè)產(chǎn)毒導(dǎo)氣梭菌莢質(zhì)黏膜芽孢梭菌的克隆探針時(shí)，克隆的探針是基于產(chǎn)氣梭菌莢質(zhì)黏膜芽孢梭菌的一個(gè)產(chǎn)毒反應(yīng)基因。

致腸道疾病的大腸桿菌則針對(duì)其可能致病于腸道疾病的細(xì)菌基因進(jìn)行序列模型來進(jìn)行設(shè)計(jì)。這種病毒檢驗(yàn)在我國(guó)食品細(xì)菌微生物病毒檢測(cè)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用使其研究十分活躍，例如：如檢測(cè)食品細(xì)菌中的大腸桿菌、沙門菌、志賀氏桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森、產(chǎn)單純結(jié)核的白細(xì)胞李斯特菌、金黃色球形葡萄球菌的病毒檢測(cè)等[1]。

2.2 以aerrna為靶點(diǎn)和目標(biāo)的基因檢驗(yàn)

該種基因檢驗(yàn)熒光方法常見于使用例如accuprobe等基因標(biāo)記作為熒光探針，其工作原理主要是通過利用一個(gè)acridiniumesterna作為實(shí)驗(yàn)熒光中的發(fā)光檢測(cè)物質(zhì)，標(biāo)記特異性質(zhì)的單鏈基因作為熒光探針，與一個(gè)待檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)菌基因中的核糖體rna進(jìn)行互補(bǔ)，形成穩(wěn)定的例如DNA，RNA等的雜交體。選擇一種試劑再將未完全結(jié)合的多余電子探針進(jìn)行破壞去除掉，最后通過電子發(fā)光儀就能檢測(cè)出有標(biāo)記的各種雜交體。

3 PCR技術(shù)的工作應(yīng)用原理

光合應(yīng)用PCR技術(shù)的原理類似于多種DNA天然糖苷復(fù)制技術(shù)。光合反應(yīng)機(jī)制的直接發(fā)生與寡核苷酸復(fù)制密切相關(guān)。應(yīng)用這種PCR技術(shù)時(shí)，我們會(huì)直接經(jīng)歷變性、退火、延伸等變性反應(yīng)，用變性材料模板上的DNA，先加熱到93℃，這樣就會(huì)直接使變性模板上與DNA的雙鏈分子出現(xiàn)直接解離，并且發(fā)生轉(zhuǎn)變而成為引物單鏈的結(jié)合形式，這樣就會(huì)直接導(dǎo)致這些引物單鏈與其他引物直接結(jié)合，會(huì)直接發(fā)生另一種變性反應(yīng)。

當(dāng)舊的模板退火DNA與引物的變性退火模板DNA通過加熱發(fā)生反應(yīng)，變性模板形成一個(gè)單鏈后，溫度通常會(huì)逐漸地下降到55℃，引物與新的模板退火DNA又在單鏈形成互補(bǔ)后，會(huì)重新通過配對(duì)進(jìn)行結(jié)合。

當(dāng)引物連續(xù)延伸原料DNA與原料模板引物延伸結(jié)合后，在兩種聚合反應(yīng)酶的相互作用下，原料之間會(huì)再次發(fā)生聚合反應(yīng)，根據(jù)堿基配對(duì)法的原理，會(huì)再次形成一種半線性保留型的復(fù)制鏈，這也就是完成了一個(gè)原料PCRDNA的循環(huán)，并且原料形成的新的復(fù)制鏈會(huì)將其作為原料下一次聚合反應(yīng)的主要模板，在不斷重復(fù)的增加過程中，會(huì)最終達(dá)到不斷擴(kuò)增數(shù)量產(chǎn)物的增加目的，并且采用指數(shù)增加級(jí)數(shù)的方式也因此得到了同樣的數(shù)量增加。

4 PCR技術(shù)在我國(guó)食品安全檢驗(yàn)技術(shù)中的重要應(yīng)用

目前PCR技術(shù)仍然有著自身的重大特點(diǎn)，隨著這項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)的不斷改進(jìn)發(fā)展與逐步完善，其在我國(guó)食品安全檢驗(yàn)中可以發(fā)揮的重要作用越來越大。在飲用水產(chǎn)品感染檢測(cè)、飲用水生物致病性環(huán)境因素感染檢測(cè)以及動(dòng)物食源性各類病原體和微生物的感染檢測(cè)、食物中毒性沙門氏菌的感染檢測(cè)中，PCR檢測(cè)技術(shù)都一直發(fā)揮著重要的主導(dǎo)作用。下面就是筆者根據(jù)自身實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)具體的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)展情況進(jìn)行一一詳細(xì)介紹，以供參考。

4.1 水產(chǎn)品的安全檢測(cè)

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷進(jìn)步，我國(guó)現(xiàn)代科學(xué)信息技術(shù)以及現(xiàn)代信息電子技術(shù)越來越發(fā)達(dá)，在移動(dòng)信息時(shí)代的這個(gè)大環(huán)境下，相關(guān)食品產(chǎn)業(yè)都已經(jīng)得到了良好的健康發(fā)展，有的食品產(chǎn)業(yè)在結(jié)構(gòu)上還已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)型重組，這為該產(chǎn)品行業(yè)的持續(xù)發(fā)展提供了新的發(fā)展機(jī)會(huì)，也為企業(yè)形成良好的行業(yè)發(fā)展環(huán)境提供了重要技術(shù)保障。

當(dāng)前我國(guó)社會(huì)，經(jīng)濟(jì)管理體系優(yōu)化建設(shè)越來越快，經(jīng)濟(jì)管理體系檢測(cè)開發(fā)也越來越多，內(nèi)陸地區(qū)的海洋資源利用出現(xiàn)了不斷減少的發(fā)展趨勢(shì)。相關(guān)事業(yè)單位正在加強(qiáng)對(duì)內(nèi)陸河流以及海洋資源領(lǐng)域的檢測(cè)開發(fā)，繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)飲用水產(chǎn)品的檢測(cè)開發(fā)后，還可能需要加強(qiáng)對(duì)飲用水產(chǎn)品的安全檢測(cè)，保證飲用水產(chǎn)品的安全[2]。當(dāng)前經(jīng)濟(jì)社會(huì)，水產(chǎn)魚類養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)得到了充分的發(fā)展，水產(chǎn)魚類養(yǎng)殖的覆蓋面積越來越大，水產(chǎn)品的主要種類也越來越多。

隨著我國(guó)海產(chǎn)品出口比重的不斷增大，一些事業(yè)單位加強(qiáng)了對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的項(xiàng)目投資，水產(chǎn)經(jīng)銷商更加注重水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，能夠促進(jìn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的建設(shè)，所以大部分的海產(chǎn)品和各種其他魚類食物產(chǎn)品被制成魚類食品銷往各地，但是這些海產(chǎn)品和魚類體內(nèi)還是寄生著許多不為人們所覺察的動(dòng)物寄生蟲等生理有害物質(zhì)，在很大程度上會(huì)對(duì)我們?nèi)梭w健康成長(zhǎng)構(gòu)成一定的威脅。因此就要在之前實(shí)施以一些相關(guān)的生物檢測(cè)技術(shù)，從而保證這些水產(chǎn)品和動(dòng)植物的合理、健康。而pcPCR安全技術(shù)檢測(cè)作為一種較為先進(jìn)的安全檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生鮮食品質(zhì)量安全檢測(cè)，進(jìn)而有效保證生鮮水產(chǎn)品的食用質(zhì)量安全[3]。

4.2 對(duì)肉類食物中菌種沙門氏菌的化學(xué)檢測(cè)

實(shí)際上，動(dòng)物沙門氏菌是肉類食品中常見的一種細(xì)菌，動(dòng)物疾病的化學(xué)毒理學(xué)比較特殊。它們有的使人和動(dòng)物直接生病，或者使其他動(dòng)物直接生病，而這些動(dòng)物是致病菌化學(xué)的總稱是動(dòng)物沙門氏菌。沙門氏菌對(duì)人體組織有很強(qiáng)的致病作用，同時(shí)表現(xiàn)為各種食物細(xì)菌中毒。這種食物中毒是一種全身性疾病，也就是說，我們身體幾乎每個(gè)重要部位都會(huì)直接感染一種沙門氏菌。同時(shí)，這類沙門氏菌常在人群中傳播，并逐漸發(fā)展為流行性腸道傳染病等疾病，其健康危害十分巨大，危害涉及面廣，必須及時(shí)進(jìn)行科學(xué)技術(shù)檢測(cè)，才能在萌芽階段徹底消除。

因此，我們開始積極研究pppcrs等技術(shù)用于檢測(cè)沙門氏菌的各種方法，而這種檢測(cè)方法在我國(guó)近年來隨著醫(yī)學(xué)科技的不斷發(fā)展逐漸成熟和簡(jiǎn)化。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)速度快。同時(shí)可檢測(cè)到0.05pg的細(xì)菌DNA，普遍一天即可完成檢測(cè)[4]。

結(jié)語

食品安全會(huì)對(duì)人們的日常生活工作帶來巨大影響，將生物核酸元素探針檢測(cè)技術(shù)和核酸PCRn等技術(shù)結(jié)合應(yīng)用到生產(chǎn)食品安全檢驗(yàn)中，能夠有效借助于微生物技術(shù)的提高反應(yīng)靈敏性，檢驗(yàn)和找出生產(chǎn)食品過程中的不安全影響因素。在本文的研究中，將采用核酸在線探針技術(shù)作為基因特異性檢測(cè)目的，而在基因監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中，核酸在線探針檢測(cè)技術(shù)的研究應(yīng)用較廣泛，將核酸PCR探針技術(shù)廣泛應(yīng)用到了食品基因檢驗(yàn)中，主要理由是采用PCR探針技術(shù)的生物反應(yīng)迅速，具有較強(qiáng)的特異性，生物學(xué)的靈敏性也比較強(qiáng)。