偶聯(lián)尿苷二磷酸循環(huán)體系的天然產(chǎn)物體外糖基化修飾

劉瀟斐，張良，馮旭東，李春

（北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京100081）

天然產(chǎn)物作為生物體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的內(nèi)源性 化合物，因其種類繁多、結(jié)構(gòu)多樣以及具備豐富的生理藥理活性而引起越來(lái)越多的關(guān)注，并且被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。而在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，很多天然產(chǎn)物存在著一些固有缺陷，如大部分黃酮苷元及部分黃酮苷類在水中溶解度低，而部分五環(huán)三萜類化合物如甘草次酸在臨床上長(zhǎng)期使用易引起低鉀血癥、高血壓和醛固酮增多癥等副作用，這都限制了天然產(chǎn)物的進(jìn)一步應(yīng)用。為了更好地滿足人們的需求，通過(guò)對(duì)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到性狀優(yōu)良的衍生物已經(jīng)成為天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)應(yīng)用過(guò)程中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

天然產(chǎn)物的改性策略中通常會(huì)涉及一些重要的修飾反應(yīng)，比如羥化、糖基化、甲基化、氨基化以及乙?；刃揎?，其中糖基化修飾尤為引人注目。本文主要以糖基化修飾的功能、體外糖基化的優(yōu)勢(shì)、糖苷化合物的合成方法入手，重點(diǎn)介紹了尿苷二磷酸（UDP）循環(huán)再生體系對(duì)于天然產(chǎn)物如萜類化合物、黃酮類化合物和其他天然產(chǎn)物的糖基化修飾應(yīng)用，并就UDP 循環(huán)體系對(duì)于天然產(chǎn)物糖基化修飾的應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

1 天然產(chǎn)物糖基化修飾

糖基化修飾在自然界中廣泛存在，并且?guī)缀跎婕八兄匾姆磻?yīng)過(guò)程[1]。糖基化修飾是由糖聚合物或糖與其他生物分子之間以糖苷鍵進(jìn)行連接，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和天然的次級(jí)代謝物。在原核生物中，大多數(shù)糖基化修飾發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和周質(zhì)中，而在真核生物中，糖基化修飾通常發(fā)生在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[2]。糖基化修飾通常是天然化合物生物合成的最后一步，與羥化、?；图谆磻?yīng)相協(xié)調(diào)[3]，有助于提高天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性。在功能上，這些糖組分通常參與靶細(xì)胞的分子識(shí)別，直接或間接影響到化合物的生物學(xué)活性[4]。

1.1 糖基化修飾的功能

天然產(chǎn)物的糖基化修飾大大提高了天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性，從而使天然產(chǎn)物的生物學(xué)特性有了明顯提高。從化學(xué)角度來(lái)看，糖基化修飾提高了天然產(chǎn)物的穩(wěn)定性和水溶性?；ㄇ嗨厥亲匀唤缰袕V泛存在于植物中的水溶性天然色素，對(duì)其3號(hào)位的羥基進(jìn)行糖基化修飾可以加固其芳香環(huán)，從而使花青素具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性[5]。糖基化不僅在修飾花色方面發(fā)揮重要作用，還通過(guò)糖基與周圍水分子的外部氫鍵結(jié)合而增加疏水性，從而提高類黃酮的溶解度和穩(wěn)定性[6]。糖基化修飾還會(huì)影響天然產(chǎn)物相關(guān)的膳食化合物的生物利用度，使其表現(xiàn)出抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗癌活性[7]。

糖基化修飾除了能夠提高天然產(chǎn)物的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度，還能提高天然產(chǎn)物的藥理學(xué)活性，通過(guò)增強(qiáng)靶向性并降低毒副作用。香葉醇和芳樟醇對(duì)植物本身有毒并且是化學(xué)疏水性的，因此影響它們?cè)谥参锝M織中的遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)糖基化修飾形成的單萜醇葡糖苷可以使其毒性變小、穩(wěn)定性增強(qiáng)、并且改變香味的揮發(fā)性[8]。對(duì)人參皂甙和齊墩果酸進(jìn)行糖基化修飾后提高了其抗病毒、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等多種藥理學(xué)特性[9]。通過(guò)口腔給藥，發(fā)現(xiàn)經(jīng)糖基化修飾后的大豆苷比大豆苷元具有更好的生物利用度[10]。除此之外，通過(guò)糖基化修飾所得的糖苷化合物還具有信息轉(zhuǎn)移、能量?jī)?chǔ)存、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、分子識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和化學(xué)防御等多種功能[11]。

1.2 糖苷化合物的合成方法

天然產(chǎn)物的體外糖基化修飾在食品、醫(yī)藥、化妝品行業(yè)都表現(xiàn)出來(lái)諸多優(yōu)良特性[12]，所以獲得糖基化修飾的天然產(chǎn)物成為研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，目前天然產(chǎn)物糖苷化合物的合成有體內(nèi)和體外兩種方式[13]。相比于依賴活細(xì)胞系統(tǒng)、反應(yīng)不可控的體內(nèi)合成方式，體外合成天然產(chǎn)物糖苷化合物組分明確、更易控制，近年來(lái)引起了廣泛關(guān)注[14]。目前體外糖基化修飾主要存在著化學(xué)法和酶法兩種方法。

1.2.1 化學(xué)法

化學(xué)法合成糖苷是基于異頭中心離去基團(tuán)的活化進(jìn)行的，糖基供體和受體的選擇性高度依賴于它們的端基異構(gòu)活化和糖環(huán)攜帶的保護(hù)基團(tuán)[15]?，F(xiàn)在有許多巧妙的方法可用于調(diào)整糖基供體的選擇性，包括激活或抑制保護(hù)基團(tuán)、正交異頭活化基團(tuán)或選擇活化試劑，使得將結(jié)構(gòu)單元直接引入寡糖的合成當(dāng)中。糖苷合成中的一個(gè)非常重要的問(wèn)題是形成所需的α-或β-異頭連接，它在很大程度上取決于連接的類型，幾乎每種類型都必須利用相鄰群體參與立體電子效應(yīng)的組合來(lái)自行解決，目前已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，在形成糖苷鍵之前通過(guò)束縛糖基供體和受體來(lái)形成有利的連接[16]。目前化學(xué)法合成糖苷已經(jīng)取得了一些成就和進(jìn)展，如劉志輝等[17]利用乙酸水解三七總皂苷制備人參皂苷Rg3并優(yōu)化其工藝，Lee等[18]通過(guò)酸催化處理人參皂苷Rf,用核磁共振和質(zhì)譜法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新的人參皂苷。

雖然化學(xué)法在一定程度上可以對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾，然而包括經(jīng)典的Koenigs-Knorr 反應(yīng)在內(nèi),化學(xué)法都存在產(chǎn)率低、選擇性差、高毒性、環(huán)境不友好、需要復(fù)雜的保護(hù)及脫保護(hù)過(guò)程等缺陷[19]，導(dǎo)致化學(xué)法的應(yīng)用受到廣泛限制，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中存在局限。

1.2.2 酶法

酶法主要是指是利用糖合酶、水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾的方法。依賴于酶的生物法操作條件比較溫和，操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)便，選擇性高，而且在有些條件下，一些化學(xué)法難以或無(wú)法進(jìn)行的反應(yīng)可以用生物法完成。

糖合酶是一類新的糖苷酶突變體，它可以在不水解產(chǎn)物的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，從而為多糖和聚糖合成提供有價(jià)值的資源[20]。Withers等[21]通過(guò)將農(nóng)桿菌屬的β-糖苷酶的親核試劑殘基E358突變?yōu)榉怯H核殘基，發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)可以進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)糖苷合成酶。Yang 等[22]報(bào)道了Humicola insolens纖維素酶Cel7B 的糖苷合酶突變體E197S的新特性，表明該Cel7B-E197S突變體能夠高效地直接糖基化黃酮類化合物，從而提高它的生物學(xué)活性。

水解酶是能夠?qū)⒒衔锏奶擒真I進(jìn)行水解的一類酶，張丹等[23]篩選到一株葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株，以人參皂苷Rg3為底物水解掉一個(gè)葡萄糖后得到藥理學(xué)活性更高的人參皂苷Rh2。Choi 等[24]利用一株乳酸菌產(chǎn)的糖苷酶水解糖苷型異黃酮得到了具有更高生物活性的異黃酮苷元。

糖基轉(zhuǎn)移酶是自然界存在最廣泛的轉(zhuǎn)糖基酶，是一類將單個(gè)活化的單糖單元轉(zhuǎn)移到特定受體的生物合成酶，它以活化的尿苷二磷酸糖為糖基供體來(lái)對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行修飾，以達(dá)到改性的目的。

甘草次酸是來(lái)源于甘草的五環(huán)三萜類化合物，其水溶性較差且應(yīng)用于臨床易引起毒副作用。在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C11的催化作用下，尿苷二磷酸葡萄糖可以將一分子葡萄糖轉(zhuǎn)移至甘草次酸的三號(hào)位上形成3-O-葡萄糖基甘草次酸，提高了化合物的水溶性和生物利用度[25]。從茶樹中分離出的多酚糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT72AM1 可以在體外對(duì)黃酮醇或松柏醛進(jìn)行糖基化，分別形成3-O-葡糖苷和4-O-葡糖苷，以降低茶葉中的苦味和澀味[26]。Luo 等[27]從枯草芽孢桿菌CCTCC AB 2012913 中克隆了三個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，它們可以使用人參皂苷Rh1 作為底物，以產(chǎn)生3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參三醇，提高了化合物的水溶性和生物利用度。

利用糖基轉(zhuǎn)移酶的酶法在催化過(guò)程中具有較高的區(qū)域選擇性和立體選擇性，反應(yīng)條件溫和、過(guò)程簡(jiǎn)單、環(huán)境友好且安全性高，因此受到廣泛關(guān)注。

體外無(wú)細(xì)胞催化體系自身存在著很大的優(yōu)勢(shì)，因此被認(rèn)為是一種新的生物制造平臺(tái)[28]。首先，它可以在沒(méi)有細(xì)胞膜控制的情況下，更容易地使各種物質(zhì)在體外進(jìn)行反應(yīng)。其次，它可以在不形成副產(chǎn)物或細(xì)胞集團(tuán)的情況下實(shí)現(xiàn)非常高的產(chǎn)物收率。例如，每葡萄糖單元的多糖和水可以產(chǎn)生近12個(gè)H2，其產(chǎn)氫量是厭氧產(chǎn)氫微生物的三倍[29]。第三，沒(méi)有細(xì)胞膜屏障的酶系統(tǒng)通常具有比微生物系統(tǒng)更快的反應(yīng)速率，比如酶促燃料電池具有比微生物燃料電池更高的輸出功率[30]。第四，無(wú)細(xì)胞體外反應(yīng)體系的酶混合物比微生物細(xì)胞系統(tǒng)更好地耐受有毒化合物[31]。最后，酶混合物能夠在較為寬松的條件下進(jìn)行反應(yīng)，例如高溫、低pH 以及有機(jī)溶劑或者離子液體存在的情況下都可以進(jìn)行體外無(wú)細(xì)胞酶的催化反應(yīng)[32]。

盡管體外合成生物學(xué)存在著諸多優(yōu)點(diǎn)，但是在體外無(wú)細(xì)胞催化反應(yīng)時(shí)通常需要制備純化酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這都提高了實(shí)驗(yàn)成本。隨著對(duì)天然產(chǎn)物深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在代謝途徑中引入含有級(jí)聯(lián)酶的酶復(fù)合物來(lái)修飾天然代謝物是具有吸引力的。因?yàn)檫@不僅顯著降低了蛋白質(zhì)純化成本和勞動(dòng)力，而且可能提高天然產(chǎn)物修飾的產(chǎn)率。

2 UDP循環(huán)體系的概述

2.1 糖基供體的合成途徑

糖基轉(zhuǎn)移酶通常以活化的UDP-糖為糖基供體，當(dāng)它以天然產(chǎn)物為糖基受體時(shí)，可以將糖基供體的高能磷酸鍵通過(guò)能量轉(zhuǎn)移至糖基受體上，在天然產(chǎn)物和糖基供體間形成糖苷鍵。

常見(jiàn)的UDP-糖主要有兩種類型，一種為五碳糖，包括UDP-阿拉伯糖、UDP-木糖和UDP-芹菜糖等；一種為六碳糖，包括UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸和UDP-鼠李糖等。

UDP-葡萄糖是合成其他UDP-單糖的起始化合物。UDP-葡萄糖可以經(jīng)過(guò)脫氫、脫羧、差向異構(gòu)三步反應(yīng)形成UDP-阿拉伯糖。具體步驟為UDP-葡萄糖在UDP-葡萄糖脫氫酶（UGDH）的作用下形成UDP-葡萄糖醛酸，UDP-葡萄糖醛酸在UDP-木糖合酶的催化下形成UDP-木糖，UDP-木糖在UDP-木糖差向異構(gòu)酶（UXE）的作用下形成UDP-阿拉伯糖。與此同時(shí)，UDP-葡萄糖在UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶（UGE）的作用下形成UDP-半乳糖，UDP-葡萄糖醛酸在UDP-葡萄糖醛酸差向異構(gòu)酶（UGlcAE）的作用下形成UDP-半乳糖醛酸，UDP-葡萄糖醛酸在UDP-芹菜糖合酶（UAXS） 的作用下形成UDP-芹菜糖。此外，UDP-葡萄糖為底物還可以生成UDP-鼠李糖，具體步驟為UDP-葡萄糖在4,6-脫水酶（rmlB）和NAD+的作用下生成UDP-4-酮基-6-去氧葡萄糖，然后在3,5-異構(gòu)酶（rmlC）的催化下生成UDP-4-酮基-鼠李糖，最后在4-還原酶（rmlD） 和NADPH的作用下生成UDP-鼠李糖（見(jiàn)圖1）[33]。

2.2 偶聯(lián)蔗糖合酶的UDP循環(huán)體系的概述及應(yīng)用

糖基轉(zhuǎn)移酶能夠以高立體選擇性和區(qū)域選擇性對(duì)大量的天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾，應(yīng)用前景十分廣泛，但是到現(xiàn)在為止依然存在著一些問(wèn)題。像UDP-葡萄糖之類的糖基供體價(jià)格昂貴，這限制了它們?cè)诠I(yè)過(guò)程中的應(yīng)用，在體外反應(yīng)時(shí)不足以用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)[34-35]，因此，UDP-糖的有效原位再生是規(guī)?；a(chǎn)的天然產(chǎn)物糖苷化合物的必要條件。

為了解決這一問(wèn)題，在反應(yīng)體系中引入蔗糖合酶（SuSy）。由于蔗糖成本低、易獲得，因此可大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[36]。使用蔗糖合酶將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，以尿苷二磷酸為糖基受體，生成活化的尿苷二磷酸糖，實(shí)現(xiàn)了從經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的蔗糖和UDP向昂貴的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)過(guò)程（見(jiàn)圖2）[37]。

圖1 UDP-糖的生物合成途徑

圖2 蔗糖合酶的催化反應(yīng)

近年來(lái)，將蔗糖合酶與糖基轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)起來(lái)，建立多酶偶聯(lián)的原位UDP-葡萄糖循環(huán)體系成為趨勢(shì)。該系統(tǒng)利用相對(duì)廉價(jià)、易獲得含有高能糖苷鍵的蔗糖，在蔗糖合酶的催化作用下，水解生成的一分子葡萄糖被UDP 活化，生成活化的尿苷二磷酸糖供糖基轉(zhuǎn)移酶使用，合成糖苷化合物后，生成的游離UDP 又可再次被循環(huán)利用，合成UDP-葡萄糖。這樣周而復(fù)始，從而為糖苷化合物的合成提供了大量的糖基供體，也解除了UDP 對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用，大大提高了催化效率（見(jiàn)圖3）[38]。

圖3 多酶偶聯(lián)催化的原位UDP-糖循環(huán)體系

偶聯(lián)蔗糖合酶和糖基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)建尿苷二磷酸糖再生系統(tǒng)，高效合成具有高附加值的天然產(chǎn)物糖苷化合物，目前是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

2.3 偶聯(lián)海藻糖合成酶的UDP 循環(huán)體系的概述及應(yīng)用

與蔗糖合酶的可逆催化類似，近年來(lái)，研究人員鑒定了來(lái)源于掘越氏熱球菌（Pyrococcus horikoshii）的海藻糖合成酶。一方面它能夠以UDP-葡萄糖為糖基供體將葡萄糖轉(zhuǎn)移到D-葡萄糖受體上，直接形成海藻糖；另一方面，它能夠水解海藻糖成兩分子葡萄糖，其中一分子葡萄糖被UDP 活化形成UDP-葡萄糖（見(jiàn)圖4）[39]。表明了海藻糖合成酶具有將海藻糖的葡糖基部分轉(zhuǎn)移至UDP 的能力，從而有效地合成相應(yīng)的UDP-葡萄糖。

通常，除了UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖也是較常用的尿苷二磷酸糖，它可以作為哺乳動(dòng)物在內(nèi)的各種物種的糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基供體。研究人員鑒定了來(lái)源于掘越氏熱球菌（Pyrococcus horikoshii）的海藻糖合成酶（TreT）和UDP-半乳糖4'-差向異構(gòu)酶（pGALE），在僅添加起始原料海藻糖和UDP的情況下，TreT 可以將海藻糖水解并活化一分子葡萄糖形成UDP-葡萄糖，而pGALE 可以使UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖相互轉(zhuǎn)化[40]。這為UDP-半乳糖的再生提供了一種新的有效和實(shí)用的方法，并為糖基轉(zhuǎn)移酶提供了更多樣的糖基供體。

偶聯(lián)海藻糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的尿苷二磷酸糖再生系統(tǒng)，在一定程度上豐富了UDP 循環(huán)體系的多樣性，同時(shí)可以對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾合成具有高附加值的糖苷化合物。但是由于海藻糖價(jià)格高于蔗糖，且pGALE 也可以在蔗糖合酶的循環(huán)體系中將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-半乳糖。因此相對(duì)于偶聯(lián)蔗糖合酶的UDP 循環(huán)體系來(lái)說(shuō)，偶聯(lián)海藻糖合成酶的UDP 循環(huán)體系目前在國(guó)內(nèi)外研究中沒(méi)有成為首要選擇。

3 偶聯(lián)UDP 再生的天然產(chǎn)物糖基化修飾

圖4 海藻糖合成酶的催化反應(yīng)

蔗糖合酶于1955 年在植物中被發(fā)現(xiàn)，它較高的熱穩(wěn)定性對(duì)于工業(yè)的發(fā)展有重要作用[41]。而在1994 年就有報(bào)道指出，通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶可以建立尿苷二磷酸糖的再生系統(tǒng)，并且已經(jīng)可以對(duì)UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP 葡糖醛酸實(shí)現(xiàn)再生。隨著人們對(duì)于天然產(chǎn)物關(guān)注度的提升，研究人員逐漸將蔗糖循環(huán)體系應(yīng)用于天然產(chǎn)物以對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾，并取得了豐碩成果。本文將針對(duì)萜類、黃酮類、及其他重要的植物天然產(chǎn)物的體外糖基化修飾進(jìn)行綜述。

3.1 萜類化合物的體外糖基化修飾及UDP再生

3.1.1 萜類化合物

萜類化合物是自然界中天然產(chǎn)物最多樣化的家族之一。它是由異戊二烯單元（C5H8）縮合產(chǎn)生的衍生物，可以看成是由異戊二烯或異戊烷以各種方式連結(jié)而成的一類天然化合物，在高等植物、真菌、微生物中廣泛存在。萜類化合物在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，如用作香料或調(diào)味劑，并且還是用于工業(yè)生產(chǎn)維生素和其他基礎(chǔ)化學(xué)品的重要起始材料。許多特定的萜類化合物作為抗病毒、抗瘧疾和抗癌藥物而被應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)[42]，而法呢烯和異戊二烯分別作為生物燃料和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)橡膠的前體受到關(guān)注[43-44]。它在植物細(xì)胞生理學(xué)中也具有重要作用，例如通過(guò)光合作用收獲光能、維持膜完整性、通過(guò)氧化還原化學(xué)轉(zhuǎn)移電子，以及通過(guò)植物激素進(jìn)行生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。根據(jù)用于構(gòu)建不飽和烴類固體分子的異戊二烯C5 單元的數(shù)量來(lái)分類，可以將萜類化合物分為單萜、倍半萜、二萜類、三萜類和四萜類化合物。到目前為止，已知有超過(guò)40000種不同的萜類化合物結(jié)構(gòu)[45]。

3.1.2 萜類糖苷化合物的體外合成

所有類別的萜類化合物在植物系統(tǒng)中都被糖基化，從而影響它們的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性[46]。由于萜類化合物具有廣泛的生理活性，大量的萜類糖苷已經(jīng)被分離出來(lái)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其中有些萜類化合物由于其高附加值的性能已被用于高額的商業(yè)化生產(chǎn)。由于其廣泛且有前途的生理效應(yīng)，已經(jīng)分離出大量的萜類糖苷并在結(jié)構(gòu)上被鑒定。糖基化的萜類化合物在自然界中廣泛分布，并且由于多種糖苷配基和碳水化合物的組合而包含多種多樣的結(jié)構(gòu)。

隨著人們對(duì)于天然產(chǎn)物關(guān)注度的提升，研究人員逐漸將蔗糖循環(huán)體系應(yīng)用于天然產(chǎn)物以對(duì)其進(jìn)行糖基化修飾，并取得了豐碩成果。人參皂甙是人參主要的有效成分，表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性，UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）介導(dǎo)的糖基化是人參皂甙的最后一個(gè)生物合成步驟。Dai 等[47]將來(lái)自枯草芽孢桿菌168 的糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-YjiC 與蔗糖合酶偶聯(lián)進(jìn)行one-pot 反應(yīng)，以原人參二醇（PPD）作為糖苷配基,用蔗糖和UDP 再生UDP-葡萄糖，將葡糖基部分轉(zhuǎn)移至原人參二醇（PPD）游離的C3-OH和C12-OH以形成人參皂苷（見(jiàn)圖5）。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，最終獲得3.98g/L F12（3-O-β-d-吡喃葡萄糖基-12-O-β-d-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參二醇）和0.20g/L Rh2。同時(shí)，該課題組使用來(lái)自枯草芽孢桿菌168 的糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-YjiC 對(duì)原人參三醇（PPT）的C3-OH、C6-OH和C12-OH進(jìn)行糖基化修飾，這有助于提高PPT型人參皂苷的結(jié)構(gòu)和功能多樣性[48]。

圖5 偶聯(lián)UDP再生的原人參二醇糖基化修飾［47］

甜菊糖和萊鮑迪甙A是甜葉菊葉中存在的主要二萜糖苷。萊鮑迪甙A具有甜味，而甜菊糖會(huì)產(chǎn)生殘留的苦味。以甜菊糖為底物酶促合成萊鮑迪甙A可以提高甜菊糖苷產(chǎn)品中萊鮑迪甙A與甜菊糖甙的比例，從而提供一種理想的策略來(lái)改善甜菊糖苷產(chǎn)品的感官特性。Wang 等[49]通過(guò)偶聯(lián)來(lái)自甜葉菊的重組UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和來(lái)自擬南芥的蔗糖合成酶AtSUS1，證明了甜菊糖能有效轉(zhuǎn)化為萊鮑迪甙A。通過(guò)AtSUS1再生UDP-葡萄糖，可以使得UDP用作UDP-葡萄糖再循環(huán)的初始材料，而不需要大量添加昂貴的UDP-葡萄糖（見(jiàn)圖6）。研究表明，萊鮑迪甙A在30h內(nèi)用2.4mmol/L甜菊糖、7.2mmol/L 蔗糖和0.006mmmol/L UDP 可以達(dá)到78%的產(chǎn)率。萊鮑迪甙D是來(lái)源于甜葉菊的天然零卡路里甜味劑，甜度為蔗糖的350倍，具有比萊鮑迪甙A更低的苦味和相當(dāng)?shù)奶鹞?。Chen等[50]通過(guò)耦合番茄的重組UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2 和來(lái)自馬鈴薯的蔗糖合成酶StSuSy 開(kāi)發(fā)了萊鮑迪甙D 合成和UDP-葡萄糖再循環(huán)的途徑。經(jīng)過(guò)優(yōu)化從20g/L萊鮑迪甙A 獲得了17.4g/L 的萊鮑迪甙D，產(chǎn)率達(dá)到了74.6%。

香葉醇是存在于植物中的一種單萜類化合物，具有抗菌、驅(qū)蟲等功效，但是它自身的毒性不僅限制了其應(yīng)用，而且對(duì)于植物組織的遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)都有影響。Huang 等[38]克隆得到了三株植物來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT2、VvGT14a、VvGT15c以及真菌來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶SbUGTA1，將它們與大豆來(lái)源的蔗糖合酶GmSuSy 在大腸桿菌中共表達(dá)。當(dāng)VvGT15c與GmSUS 和UDP 一起反應(yīng)時(shí)，香葉醇形成香葉基葡糖苷。用單酶（GT）系統(tǒng)和一鍋二酶（GT 和SUS）系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)比，研究了VvGT15c 對(duì)香葉醇的葡糖基化的影響。當(dāng)在單酶系統(tǒng)中進(jìn)行香葉醇的葡糖基化時(shí)，即使在0.2mmol/L UDP-葡萄糖得添加量下，萜烯醇也未完全轉(zhuǎn)化，然而，香葉醇在0.05mmol/L UDP-葡萄糖的一鍋雙酶系統(tǒng)中被完全消耗，證明了偶聯(lián)蔗糖合酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的UDP循環(huán)體系的高效性。

萜類糖苷化合物的合成依賴于高效的糖基轉(zhuǎn)移酶，然而目前為止，對(duì)萜烯類糖基轉(zhuǎn)移酶的報(bào)道較少。這種偶聯(lián)蔗糖合酶和糖基轉(zhuǎn)移酶用于UDP-糖原位再生的方法，將為結(jié)構(gòu)上更為復(fù)雜的萜類糖苷化合物的合成打開(kāi)大門。

3.2 黃酮化合物的體外糖基化修飾UDP再生

3.2.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物是植物產(chǎn)生的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物，是自然界中多種藥用植物的有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌和抗病毒活性[51]，并且在花和果實(shí)生長(zhǎng)、UV-B保護(hù)劑和信號(hào)分子傳遞中起重要作用[52]。黃酮類化合物主要是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物，目前泛指兩個(gè)具有酚羥基的芳香環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）通過(guò)中央三碳鏈相互作用連接而成的一系列化合物。基于它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，已經(jīng)鑒定了上千種黃酮類化合物，其中許多是造成花、果實(shí)和葉子誘人色彩的原因[53]。自1930 年起，黃酮類化合物開(kāi)始根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)分為不同的類別，如黃酮和黃酮醇、二氫黃酮和二氫黃酮醇、異黃酮和二氫異黃酮、查耳酮和二氫查耳酮類、花色素和黃烷醇類等。黃酮類化合物的藥理活性因其結(jié)構(gòu)而異，在自然界中，糖基化黃酮類化合物是黃酮類化合物的主要衍生物。糖基化不僅改善了黃酮類化合物的溶解性和穩(wěn)定性，而且賦予這些化合物特殊的活性，改善了其選擇性和藥理學(xué)性質(zhì)[54-55]。

3.2.2 黃酮類糖苷化合物的體外合成

絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要的作用。但是大部分黃酮苷元及部分黃酮苷類在水中溶解度低，限制其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。由于黃酮類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使用化學(xué)合成方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾具有巨大挑戰(zhàn)，因此利用糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行糖基化修飾成為更有利的選擇。

圖6 偶聯(lián)UDP再生的甜菊糖糖基化修飾［49］

糖基化修飾可以提高黃酮類化合物的水溶性和穩(wěn)定性，但是需要添加昂貴的UDP-葡萄糖作為糖基供體，國(guó)內(nèi)外科研人員利用偶聯(lián)UDP 循壞再生體系解決了這一問(wèn)題。根皮素的糖苷化合物具有比根皮素更廣泛的藥理學(xué)活性和穩(wěn)定性。其糖苷鍵不易被水解，因此具有很高的穩(wěn)定性[56-57]。此外，它還具備多種藥理學(xué)活性，如抗氧化和抗血栓，以及對(duì)糖尿病治療有積極的效果[58-59]。當(dāng)提供二氫查爾酮根皮素作為受體時(shí)，來(lái)自水稻的C-糖基轉(zhuǎn)移酶（OsCGT）與尿苷5'-二磷酸葡萄糖（UDPG）反應(yīng)，蔗糖經(jīng)蔗糖合酶水解后產(chǎn)生的一分子葡萄糖被UDP 活化成為糖基供體，對(duì)根皮素進(jìn)行糖基化修飾形成了根皮素二氫查耳酮-β-D-葡糖苷，這是一種獨(dú)特的類黃酮糖苷，具有罕見(jiàn)的C-糖苷結(jié)構(gòu)，UDP在該過(guò)程中循環(huán)45次[60]。Son等[61]將黃酮類O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（OsUGT-3） 和蔗糖合酶（AtSuSy）的基因進(jìn)行融合，當(dāng)提供蔗糖和UDP時(shí)，SUS-UGT 能夠?qū)㈤纹に剞D(zhuǎn)化為槲皮素O-葡萄糖苷。此外，將蔗糖加入反應(yīng)混合物中時(shí)，UDP-葡萄糖被再循環(huán)，該融合蛋白可用于酶促生產(chǎn)類黃酮O-葡糖苷。Gutmann 等[62]將來(lái)源于西洋梨中的O-糖基轉(zhuǎn)移酶（PcOGT）與來(lái)源于大豆的蔗糖合酶SuSy 的UDP 依賴性蔗糖轉(zhuǎn)化偶聯(lián)，建立平行生物催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將葡萄糖轉(zhuǎn)移至根皮素2'-OH 上形成根皮苷（2'-O-β-D-根皮素葡糖苷）。為了尋找具有不同區(qū)域選擇性的糖基轉(zhuǎn)移酶，他們將來(lái)源于水稻的糖基轉(zhuǎn)移酶OsCGT的121位異亮氨酸突變成天冬氨酸，從而在催化時(shí)得到了兩種新的O-β-D-葡萄糖基化產(chǎn)物。SuSy不僅使得UDP-葡萄糖供體的再生率高達(dá)9倍，而且還克服對(duì)二氫查爾酮的熱力學(xué)限制。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件得到了根皮素2'-O-或4'-O-β-D-葡糖苷高于88%的收率。

金絲桃苷具有抗炎、抗抑郁和抗真菌等許多生物學(xué)特性，且比槲皮素更易溶于水，Pei 等[63]建立了UDP-半乳糖再生系統(tǒng)的一鍋法合成金絲桃苷。使用大腸桿菌UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶（GalE）可以將UDP-葡萄糖生成更為昂貴的UDP-半乳糖作為糖基供體，在來(lái)源于矮牽牛的糖基轉(zhuǎn)移酶PhUGT 的作用下，以槲皮素為糖基受體，生成具有多種生物學(xué)活性的金絲桃苷。大豆蔗糖合成酶（GmSUS）與GalE 偶聯(lián)，使用蔗糖作為合成UDP-半乳糖的廉價(jià)和可持續(xù)的碳源實(shí)現(xiàn)UDP-半乳糖的再生。這種用于從UDP和蔗糖再生UDP-半乳糖的方法可廣泛用于類黃酮和其他生物活性物質(zhì)的糖基化（見(jiàn)圖7），且使得UDP-半乳糖的再生循環(huán)次數(shù)達(dá)到18.4。早期能夠催化黃芩素糖基化以形成黃芩素7-O-葡糖苷的糖基轉(zhuǎn)移酶F7GT，被證明對(duì)其他類黃酮也顯示廣泛的底物特異性[64]。Masada等[65]為了證實(shí)目前將UDP-葡萄糖再生與糖基轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)的一鍋二酶系統(tǒng)適用于親脂性小分子的酶促糖基化，將F7GT和AtSUS1偶聯(lián)起來(lái)對(duì)芹菜素進(jìn)行糖基化修飾，結(jié)果芹菜素7-O-葡糖苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，而不添加AtSUS1時(shí)，約50%的芹菜素未被葡萄糖基化，以此證明了UDP 循環(huán)體系的高效性。

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、類型多樣，但是限制其最廣泛應(yīng)用的便是它較低的水溶性和穩(wěn)定性。通過(guò)偶聯(lián)蔗糖合酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的UDP 循環(huán)體系，不僅實(shí)現(xiàn)了黃酮類化合物的體外糖基化修飾，提高了它的藥理學(xué)活性和生物利用度，而且實(shí)現(xiàn)了UDP-糖的有效原位再生，為黃酮類糖苷化合物的大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

3.3 其他化合物的體外糖基化修飾UDP再生

圖7 偶聯(lián)UDP再生的槲皮素糖基化修飾［63］

紫檀芪是白藜蘆醇的天然二甲氧基化衍生物，主要存在于藍(lán)莓和葡萄中，具有多種顯著的藥理學(xué)特性，如抗氧化、抗癌、抗焦慮和抗炎等。此外，紫檀芪被認(rèn)為是衰老和阿爾茨海默病的有效神經(jīng)調(diào)節(jié)劑。然而，由于其水溶性差和口服給藥后吸收差，因此需要獲得紫檀芪的糖苷化合物以提高其溶解度、穩(wěn)定性和生理藥理學(xué)活性。Dai 等[66]從擬南芥中克隆得到了蔗糖合酶AtSuSy，通過(guò)將來(lái)自枯草芽孢桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-YjiC 與AtSuSy 偶聯(lián)，使用一鍋法反應(yīng)進(jìn)行紫檀芪的糖基化，得到紫檀芪的糖苷化合物紫檀芪4'-O-β-葡萄糖苷（見(jiàn)圖8），水溶性得到顯著提高。反應(yīng)中摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%，且無(wú)需添加昂貴的UDPG。

脫氧雪腐鐮刀菌烯-3-β-D-葡萄糖苷（D3G）是霉菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）的Ⅱ期植物代謝產(chǎn)物，存在于天然的鐮刀菌污染的谷物中，是最重要的掩蔽的霉菌毒素。然而，D3G的毒理學(xué)意義尚不完全清楚，因此獲得純化和足量的D3G化合物以進(jìn)行毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和用作分析標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。Michlmayr 等[67]將來(lái)源于水稻的糖基轉(zhuǎn)移酶OsUGT79與來(lái)源于擬南芥的蔗糖合酶AtSUS1偶聯(lián)，使得蔗糖合成酶AtSUS1 用于在葡糖基化反應(yīng)期間再生UDP-葡萄糖，在糖基轉(zhuǎn)移酶OsUGT79的作用下對(duì)DON 進(jìn)行糖基化修飾形成D3G。通過(guò)這種方法，可以在昂貴的輔因子UDP-葡萄糖的有限濃度下獲得最佳轉(zhuǎn)化率，得到足夠的數(shù)量和純度的D3G用于研究。

姜黃素（二烯?；淄椋┦且环N從姜科植物姜黃等的根莖中提取得到的黃色色素，為酸性多酚類物質(zhì)。目前除了被用作食品的著色劑外，還有抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等多種活性。Kaminaga等[68]早先證明了長(zhǎng)春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物可以將姜黃素主動(dòng)轉(zhuǎn)化為一系列葡萄糖苷，使其水溶性提高2×107倍。隨后，Masada 等[65]構(gòu)建了一鍋雙酶反應(yīng)系統(tǒng)，用于有效生產(chǎn)姜黃素葡萄糖苷。其中來(lái)源于長(zhǎng)春花的糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT2 催化UDP-葡萄糖向姜黃素的葡糖基轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生其單葡糖苷和二葡萄糖苷。來(lái)源于擬南芥的蔗糖合酶AtSUS1 以UDP 為受體催化UDP-葡萄糖的再生。實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)添加AtSUS1 和蔗糖顯著提高了反應(yīng)效率，但總體葡糖基化產(chǎn)率在2h 內(nèi)僅達(dá)到約55%的轉(zhuǎn)化率。此外，該策略適用于利用UDP-葡萄糖作為糖供體的各種天然產(chǎn)物的糖基化。

大豆低聚糖（SBOS）因其在制藥、化妝品和食品工業(yè)中的潛在應(yīng)用而引起了相當(dāng)大的關(guān)注，而棉子糖和水蘇糖是大豆低聚糖的主要生物活性成分。這些低聚糖傳統(tǒng)上是從植物中提取的，但這種提取過(guò)程通常會(huì)導(dǎo)致低產(chǎn)量和高生產(chǎn)成本。Tian等[69]提出了一種生物催化方法，使用五種酶開(kāi)發(fā)了體外多酶系統(tǒng)，即蔗糖合成酶（SuSy）、UDP-葡萄糖4-差向異構(gòu)酶（GalE）、肌醇半乳糖苷合成酶（GS）、棉子糖合成酶（RS） 和水蘇糖合成酶（STS），以蔗糖為底物生產(chǎn)棉子糖和水蘇糖，同時(shí)達(dá)到了UDP 和肌醇的回收利用。具體步驟為蔗糖和UDP 在蔗糖合酶的催化作用下可逆轉(zhuǎn)化為果糖和UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖4-差向異構(gòu)酶可以容易地將UDP-葡萄糖異構(gòu)化成所需的UDP-半乳糖，隨后以肌醇和UDP-半乳糖為底物經(jīng)過(guò)肌醇半乳糖苷合成酶催化形成肌醇半乳糖苷作為糖基供體，棉子糖合酶和水蘇糖合成酶催化肌醇半乳糖轉(zhuǎn)移分別產(chǎn)生棉子糖和水蘇糖，其中UDP 轉(zhuǎn)換數(shù)達(dá)到337 次，將反應(yīng)體系中的肌醇再循環(huán)5次，得到128.9g/L棉子糖。

目前多種天然產(chǎn)物的糖基化修飾揭示了蔗糖合酶對(duì)UDP-葡萄糖再生的效率以及GT-SuSy 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的整體性能是多么重要。UDP-葡萄糖的再循環(huán)是優(yōu)化轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)的有效策略，并且對(duì)于減少昂貴的輔因子UDP-葡萄糖的添加量具有經(jīng)濟(jì)意義。

圖8 偶聯(lián)UDP再生的紫檀芪糖基化修飾［66］

4 結(jié)語(yǔ)

多年來(lái)，天然產(chǎn)物的糖基化修飾對(duì)于其自身的生理藥理活性有重要影響，尤其在醫(yī)藥上具有重大意義，因此糖基轉(zhuǎn)移酶因其在天然產(chǎn)物糖基化修飾中的多種作用而引起了相當(dāng)大的興趣。越來(lái)越多的糖基轉(zhuǎn)移酶已被公認(rèn)為植物和動(dòng)物界中細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵組分。糖基化是影響植物激素和次級(jí)代謝物活性的主要機(jī)制，并且是植物處理環(huán)境毒素的保障。然而由于UDP-糖高昂的價(jià)格不適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，因此通過(guò)偶聯(lián)蔗糖合酶和UDP 糖基轉(zhuǎn)移酶的UDP循環(huán)體系實(shí)現(xiàn)UDP-糖的有效原位再生成為一種最經(jīng)濟(jì)并高效的方法。而UDP-糖再生循環(huán)次數(shù)的最大化更是直接影響了工廠效益，一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)降低添加的UDP 濃度可以降低UDP 導(dǎo)致的產(chǎn)物抑制，從而實(shí)現(xiàn)最大的循環(huán)效率。此外，建議應(yīng)用低UDP 的Michaelis-Menten常數(shù)的蔗糖合酶來(lái)進(jìn)行UDP-糖的原位再生，而蔗糖濃度與循環(huán)次數(shù)無(wú)關(guān)，通常不在考慮范圍[70]。