污泥厭氧消化功能微生物群落結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展

唐濤濤，李江，2，楊釗，向福亮，王躍虎，李彥澄

（1貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2貴州大學(xué)環(huán)境工程規(guī)劃設(shè)計(jì)研究所，貴州貴陽550025）

污泥作為污水處理廠的主要副產(chǎn)物，其產(chǎn)量在2017 年已達(dá)4.328×107t（含水率80%計(jì)）[1]。如何實(shí)現(xiàn)污泥的處理處置是當(dāng)前污水處理廠面臨的一大難題。目前，有多種技術(shù)可對(duì)污泥進(jìn)行資源化利用，如燃燒、熱解和厭氧消化[2]。但污泥在厭氧消化過程中僅有40%～50%的有機(jī)物質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)化為甲烷，這不僅使污泥的厭氧消化效率較低，還會(huì)影響產(chǎn)氣量[3]。因?yàn)槲勰嘀械陌饩酆衔铮╡xtracellular polymeric substances，EPS）會(huì)把微生物細(xì)胞聚合成網(wǎng)狀物，使得EPS和微生物分別以物理、化學(xué)阻擋層的方式限制污泥的水解速率[4]。從而使得污泥厭氧消化反應(yīng)器具有水力停留時(shí)間（hydraulic retention time，HRT）長（20～50 天）和占地面積大等缺點(diǎn)[4-5]。在厭氧消化過程中，營養(yǎng)物質(zhì)、pH、溫度、C/N及微生物群落結(jié)構(gòu)等因素均會(huì)對(duì)厭氧消化效率產(chǎn)生影響。其中，營養(yǎng)物質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)提高消化效率起重要作用[6]。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，使得人們對(duì)厭氧體系中微生物的功能解析成為可能。本文綜述了污泥在厭氧消化過程中常見的微生物群落，以及它們?cè)趨捬躞w系中發(fā)揮的作用；并分析溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、pH、氨氮（NH4+-N）等影響因素對(duì)厭氧微生物的影響，以期為提高厭氧消化效率提供參考借鑒。

1 常見的厭氧微生物群落分布

厭氧微生物目前尚無公認(rèn)的準(zhǔn)確定義，但通常認(rèn)為厭氧微生物是只能在低氧分壓條件下生長，而不能在空氣中（18%氧氣）和（或）在10%二氧化碳下的固體培養(yǎng)基表面生長的一類微生物的總稱[7]。

1.1 細(xì)菌

污泥在厭氧消化過程中主要涉及水解酸化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌。其中，水解酸化細(xì)菌在污泥厭氧消化過程中發(fā)揮重要作用。因?yàn)樗饧?xì)菌能將污泥中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為簡單的溶解性單體物質(zhì)，而酸化細(xì)菌能將水解產(chǎn)物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為酸性產(chǎn)物（揮發(fā)性脂肪酸），從而為微生物的生長提供碳源。顯然，細(xì)菌不僅對(duì)污泥中有機(jī)物的水解和酸化起關(guān)鍵作用，而且還會(huì)影響厭氧消化的效率。以往的研究發(fā)現(xiàn)，古菌在厭氧體系中約占微生物總量的10%[8]?？梢?，細(xì)菌在微生物總量中所占比例高于古菌，所以細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響古菌群落[9-10]。根據(jù)Ahring[11]的報(bào)道，厭氧微生物至少涵蓋了20 個(gè)門的細(xì)菌， 包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、螺旋體門（Spirochaetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等。在上述菌群中，Bacteroidetes和Firmicutes是水解過程中主要的菌群；Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes是酸化過程中主要的菌群[12]。 可 見 ，Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes群落的變化會(huì)對(duì)厭氧消化體系產(chǎn)生影響，這是因?yàn)樗鼈兪菂捬跸^程中的主要門分類[13-14]。

Bacteroidetes不僅是厭氧消化體系中的常見細(xì)菌類群，也是一種主要的產(chǎn)酸菌[15-16]。這是因?yàn)閷儆贐acteroidetes的細(xì)菌在有機(jī)物降解過程中會(huì)產(chǎn)生各種裂解酶[13]，所以Bacteroidetes對(duì)復(fù)雜碳化合物具有降解作用[17]，如纖維素和半纖維素。而以往的研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroidetes可將纖維素轉(zhuǎn)化為單糖(主要是葡萄糖)[18]及有機(jī)酸[19]，半纖維素轉(zhuǎn)化為D-木聚糖和葡萄糖[20]。且Bacteroidetes將半纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖后會(huì)進(jìn)一步對(duì)葡萄糖進(jìn)行分解，這是因?yàn)锽acteroidetes是降解糖類的主要菌群[20]。因此，Bacteroidetes中大部分細(xì)菌能產(chǎn)生乙酸、丙酸、甲酸及丁二酸[21]，這也表明Bacteroidetes的分布與揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）的濃度有關(guān)[21]。顯然，厭氧消化過程中Bacteroidetes豐度的變化會(huì)導(dǎo)致體系中的VFAs 濃度發(fā)生變化，從而對(duì)體系的pH 產(chǎn)生影響。

Proteobacteria和Chloroflexi作為厭氧消化體系中主要的細(xì)菌類群，在厭氧消化中也發(fā)揮著重要的代謝功能作用。由于Proteobacteria的類型比較復(fù)雜，因此Proteobacteria在環(huán)境中可作為不同角色參與物質(zhì)代謝，并作為微生物群落的重要組成部分參與群落演替過程[22]。 以往的研究發(fā)現(xiàn)，Proteobacteria中的許多菌群不僅能利用葡萄糖、丙酸鹽、丁酸鹽等小分子化合物[23]；而且Proteobacteria在酸化過程中會(huì)產(chǎn)生乙酸作為主要的酸化產(chǎn)物[14]。同時(shí)，近年的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境中存在有毒有害物質(zhì)時(shí)會(huì)促進(jìn)Proteobacteria的生長，如Luo 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體系中存在菲時(shí)，Proteobacteria的豐度會(huì)從9.3%增加到13.0%。可見，當(dāng)環(huán)境中存在有毒有害物質(zhì)時(shí)，Proteobacteria仍具有較高的生存能力。Chloroflexi作為一種在污泥厭氧消化過程中常見的菌群不僅豐度較高，而且對(duì)單糖和多糖均具有降解能力，并產(chǎn)生乙酸[13]。同時(shí)，Chloroflexi對(duì)有機(jī)負(fù)荷具有較高的承受能力[25]。

在厭氧環(huán)境下，F(xiàn)irmicutes分布較廣，包含眾多重要的功能微生物，如梭菌綱、芽孢桿菌綱等[26]。在厭氧消化過程中，F(xiàn)irmicutes對(duì)有機(jī)物的水解和酸化具有重要作用[27]，這是因?yàn)镕irmicutes能產(chǎn)生胞外酶，如纖維素酶、脂酶、蛋白酶及其他胞外酶，而這些酶在纖維素、蛋白質(zhì)、半纖維素、脂質(zhì)、糖類及氨基酸等有機(jī)物的分解代謝中扮演重要作用[28]，從而實(shí)現(xiàn)有機(jī)物的降解；且Firmicutes還能利用乙酸[29]。Lim 等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，在厭氧消化過程中，細(xì)菌群落會(huì)由Proteobacteria轉(zhuǎn)變?yōu)镕irmicutes。在眾多Firmicutes中的菌落中，梭菌屬（Clostridium）是一類嚴(yán)格的厭氧菌，在降解碳水化合物的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生乙酸、丁酸等產(chǎn)物[31]?？梢姡珻lostridium豐度的變化會(huì)對(duì)厭氧消化系統(tǒng)的pH 產(chǎn)生影響。而以往的研究也發(fā)現(xiàn)，Clostridium豐度的增加與pH的增加有關(guān)[32]。此外，Clostridium也能與氫型產(chǎn)甲烷菌互相作用以實(shí)現(xiàn)有機(jī)酸的降解[33]。與Clostridium相似，芽孢桿菌（Clostridia）在厭氧條件下也能利用溶解性有機(jī)物產(chǎn)生VFAs[34]。但Clostridia不僅能有效降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)物，而且還能使乳酸或乙酸發(fā)酵為氫氣（H2）和二氧化碳（CO2）[8,14,35]，為氫型產(chǎn)甲烷菌的生長提供能源。

除Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes外，厭氧消化體系中還存在部分豐度較低的門，如Cloacimonetes、Spirochaetes、酸桿菌門（Acidobacteria） 和 放 線 菌 門（Actinobacteria）、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Ignavibacterium等菌群。其中，Cloacimonetes對(duì)有機(jī)物具有水解和酸化能力[36]；Acidobacteria在厭氧條件下可將纖維素降解并產(chǎn)生乙酸[37]；Actinobacteria中的部分菌屬會(huì)產(chǎn)生丙酸[14]；而Spirochaetes能將碳水化合物或氨基酸轉(zhuǎn)化為乙酸、氫氣（H2）和二氧化碳（CO2）等[38]。此外，有研究也指出Spirochaetes、Planctomycetes、Lentisphaerae、Deferribacteres和Verrucomicrobia等菌落對(duì)有毒有害物質(zhì)具有一定的促進(jìn)作用，如多環(huán)芳烴（PAHs）、二氯甲烷、原油中污染物和含氯乙烯[39-40]。同時(shí)，嗜溫化學(xué)異養(yǎng)的細(xì)菌Ignavibacteriumsp.可以提高厭氧污泥的降解性能，是推動(dòng)厭氧降解的主要參與者[41-42]。

1.2 古菌

在厭氧消化過程中，水解和酸化階段均有細(xì)菌參與，而產(chǎn)甲烷階段完全由古菌參與。產(chǎn)甲烷代謝途徑的本質(zhì)是產(chǎn)甲烷菌利用細(xì)胞內(nèi)一系列特殊的酶和輔酶將CO2或甲基化合物中的甲基通過一系列的生物化學(xué)反應(yīng)還原成甲烷[43]。產(chǎn)甲烷菌根據(jù)產(chǎn)甲烷途徑主要分為三種類型，即乙酸型、氫型和甲基型產(chǎn)甲烷菌。其中，大多數(shù)的甲烷主要是通過乙酸型和氫型產(chǎn)甲烷菌作用所產(chǎn)生[44]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷絲菌屬（Methanosaeta）和Methanomicrobium是主要的產(chǎn)甲烷微生物[45-47]。除上述菌屬外，在厭氧反應(yīng)器中還會(huì)檢出Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae、甲 烷 嗜熱桿菌屬（Methanothermobacter）、甲烷螺菌屬（Methanospirllum）、Methanoculleus和Methanomassilliicoccus。其中，Methanosarcina和Methanosaeta均屬于乙酸型產(chǎn)甲烷菌。Methanosarcina屬于多功能的產(chǎn)甲烷菌，即具有乙酸型產(chǎn)甲烷菌的能力，又具有氫型和甲基型產(chǎn)甲烷菌的能力；故Methanosarcina能利用乙酸、甲醇、甲胺、二甲胺和H2/CO2產(chǎn)生甲烷[48]；且Methanosarcina也是唯一一種能通過上述三種途徑產(chǎn)生甲烷的菌種[49]。同時(shí)，Methanosarcina對(duì)揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）和有機(jī)承載率（OLR）具有較高的承受能力[50]。在厭氧環(huán)境下，隨著乙酸濃度的變化會(huì)使得Methanosarcina和Methanosaeta豐度發(fā)生變化。以往的研究表明，高濃度的乙酸環(huán)境適于Methanosarcina生長， 而低濃度乙酸適于Methanosaeta生長[51-52]。近年的研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙酸濃度在250～500mg COD/L 時(shí)，Methanosarcina為主要菌種[48]。

除Methanosarcina和Methanosaeta屬于乙酸型產(chǎn)甲烷菌外， 在已檢出的產(chǎn)甲烷菌中，Methanothermobacter、Methanoculleus、Methanospirllum、Methanobacterium、Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae和Methanobrevibacter為 氫 型 產(chǎn)甲烷菌，主要利用H2/CO2或甲酸生成CH4氣體[53-58]。而Methanomassiliicoccus為甲基型產(chǎn)甲烷菌，主要利用甲醇（或甲胺）與氫作為電子供體產(chǎn)生CH4氣體[59-60]?？梢姡瑓捬跸磻?yīng)器中的優(yōu)勢(shì)古菌主要集中在乙酸型和氫型產(chǎn)甲烷菌，它們的共同特點(diǎn)是能夠利用細(xì)菌的分解產(chǎn)物（乙酸、氫氣等）產(chǎn)生甲烷。

2 微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響因素

在不同條件下，微生物的群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異。其中，溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、pH、氨氮(-N)及物質(zhì)中含有的有毒有害物質(zhì)等因素均會(huì)對(duì)厭氧消化過程中的微生物群落產(chǎn)生影響。

2.1 溫度

目前，對(duì)厭氧消化的研究主要集中在中溫（30～40℃）和高溫（50～60℃）條件。與中溫厭氧消化相比，高溫厭氧消化具有一些優(yōu)勢(shì)，如具有較高的代謝速率、使病原體失去活性以及更高的產(chǎn)氣量[61]。但在高溫條件下進(jìn)行厭氧消化會(huì)使得體系中的揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）（尤其是丙酸）濃度較高，而中溫厭氧消化則能夠維持較高的有機(jī)負(fù)荷率（OLR）[62]。同時(shí)，由于VFAs的逐漸積累又會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[63]，從而影響厭氧消化的進(jìn)行。Guo 等[64]研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)微生物群落多樣性的影響明顯強(qiáng)于OLR。當(dāng)溫度為35℃時(shí)，厭氧體系中的微生物多樣性高于45℃和55℃時(shí)。Wu等[65]研究了餐廚垃圾在高溫（55℃）厭氧消化啟動(dòng)階段微生物群落的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)Firmicutes的相對(duì)豐度逐漸增加，而Proteobacteria和Thermotogae的相對(duì)豐度則降低，Methanosarcina菌群增加。同時(shí)，有研究也發(fā)現(xiàn)，溫度的變化也會(huì)對(duì)產(chǎn)甲烷菌的生長產(chǎn)生影響。如Methanobrevibacter和Methanosarcina最適溫度范圍分別為37～39℃和35～40℃，而Methanothermobacter thermoautotrophicum（嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌）為65～70℃。Methanobacterium和Methanosaeta種屬在中溫和高溫條件下都能生長[66]。

2.2 營養(yǎng)物質(zhì)

營養(yǎng)物質(zhì)的差異對(duì)厭氧微生物群落結(jié)構(gòu)的形成具有重要的影響。由于部分廢棄物的碳氮比(C/N)較低不利于厭氧消化的進(jìn)行，因此會(huì)向體系中添加營養(yǎng)物質(zhì)提高消化性能。Tang等[67]研究發(fā)現(xiàn)，向污泥中添加不同類型秸稈會(huì)對(duì)污泥厭氧消化體系中的微生物產(chǎn)生影響。 其中，Bacteroidetes、Proteobacteria、Firmicutes、Chloroflexi、Cloacimonetes（細(xì)菌）和Bathyarchaeota（古菌）菌群的變化最為顯著。無論何種類型秸稈的添加均會(huì)促進(jìn)Bacteroidetes、Cloacimonetes和Bathyarchaeota的 生長，但秸稈類型的變化會(huì)對(duì)不同菌群產(chǎn)生不同的促進(jìn)作用，如小麥秸稈對(duì)Bacteroidetes的促進(jìn)能力較強(qiáng)，玉米秸稈對(duì)Cloacimonetes的促進(jìn)能力較強(qiáng)，水稻秸稈對(duì)Bathyarchaeota的促進(jìn)能力較強(qiáng)。與此同時(shí)，小麥秸稈對(duì)Proteobacteria的抑制作用較強(qiáng)，水稻秸稈對(duì)Firmicutes的抑制作用較強(qiáng)，玉米秸稈對(duì)Chloroflexi的抑制作用較強(qiáng)。李新[68]的研究也發(fā)現(xiàn)，向污泥中添加纖維素也會(huì)對(duì)微生物群落產(chǎn)生影響。其中，Aminicenantes的變化最為顯著，并隨著纖維素添加量的增加而減少。由此可見，營養(yǎng)物質(zhì)類型的不同會(huì)對(duì)厭氧體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。Mata-Alvarez等[69]通過對(duì)共消化的分析也發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)容易受到原料比例的影響，而甲烷菌更易受到環(huán)境條件（如VFAs和氨氮濃度）的影響。

2.3 pH

厭氧微生物的生長、物質(zhì)代謝與pH 有密切的聯(lián)系，因此pH 的變化直接影響著厭氧消化的進(jìn)程和產(chǎn)物，不同微生物對(duì)pH 的要求不同，過高或過低的pH 均會(huì)導(dǎo)致水解菌和產(chǎn)甲烷菌的活性產(chǎn)生變化，從而影響厭氧消化的穩(wěn)定運(yùn)行。在pH 迅速調(diào)至5.5 的酸化厭氧消化反應(yīng)器中，細(xì)菌和古菌群落發(fā)生了顯著演替。在開始的13 天內(nèi)，產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量從34%降至8%，71 天時(shí)降至2%～5%[70]。在酸化的反應(yīng)器中，細(xì)菌的數(shù)量也會(huì)明顯減少[71]。酸堿的急劇變化能引起厭氧消化反應(yīng)器運(yùn)行效率的顯著下降，其內(nèi)在原因是對(duì)酸堿耐受性差的微生物種群數(shù)量和活性受到抑制，相關(guān)的代謝功能出現(xiàn)衰退。Romsaiyud等[72]研究表明，水解菌的最適pH范圍在5.3～8.3 之間，過低pH 會(huì)對(duì)水解菌產(chǎn)生離子毒性，從而影響水解酶的活性[73]。此外，產(chǎn)甲烷菌對(duì)pH 也極其敏感；以往的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌的最佳生長pH 應(yīng)在6.5～8.2 之間[74]；若pH 低于該范圍，會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌活性，當(dāng)pH低于6.2時(shí)會(huì)對(duì)產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生毒害作用[75]。

2.4 氨氮（ - N）

2.5 有毒有害物質(zhì)

2.6 攪拌

攪拌技術(shù)作為一種改善傳質(zhì)效果、解決物化及生化反應(yīng)過程中物料混合效果不均勻等問題的手段，攪拌在厭氧消化過程中發(fā)揮著重要的作用[86]。李志華和張亞婷[87]研究發(fā)現(xiàn)，攪拌系統(tǒng)中RNA/DNA（以熒光的相對(duì)面積表征）和脫氫酶活性均高于無攪拌系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明適度攪拌可以提高污泥厭氧消化系統(tǒng)中微生物活性。段小睿等[88]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)攪拌速率為60～80r/min 時(shí)有利于污泥的水解酸化；可見，在該攪拌速率下有利于水解酸化細(xì)菌的生長。而Cubas 等[89]研究結(jié)果表明，當(dāng)攪拌速率為800r/min 時(shí)可達(dá)到最佳的厭氧消化效果。顯然，攪拌技術(shù)有利于促進(jìn)厭氧體系中微生物的活性，從而提高厭氧消化效率。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在攪拌過程中會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)器中物料濃度存在分布不均的現(xiàn)象，使得反應(yīng)器中局部地區(qū)物料濃度過高，最終抑制細(xì)菌的活性[90]。

3 分子生物技術(shù)在微生物研究中的運(yùn)用

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，使分子生物學(xué)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于分析活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)。其中，使用非傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法進(jìn)行直接分析活性污泥微生物的多樣性，可以較為真實(shí)地反映環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)。當(dāng)前，常用的分子生物技術(shù)主要包括：末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析技術(shù)、克隆文庫技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)等。

3.1 末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(T-RFLP)

T-RFLP 技術(shù)是由RFLP 發(fā)展而來的方法，又稱16S rRNA 基因的末端限制性片段，它是將聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物中的一條加以熒光標(biāo)記，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割并電泳，根據(jù)片斷的大小不同以及標(biāo)記片斷種類和數(shù)量的不同來分析群落的結(jié)構(gòu)及組成[91]。T-RFLP 技術(shù)不僅具有快速、高度的可重復(fù)性、良好的可操作性等優(yōu)點(diǎn)，而且還能與適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)庫建立直接聯(lián)系，快速準(zhǔn)確地得到有關(guān)微生物的重要信息和評(píng)估菌株間微妙的基因差別，便于揭示微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能[92]。雖然T-RFLP 技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在部分缺點(diǎn)。如對(duì)短片斷分析能力較弱、步驟較多和酶切條件難以控制[93]，因此使整個(gè)種群的多樣性被大大低估，從而影響計(jì)算結(jié)果和分析指數(shù)的準(zhǔn)確度[94]。同時(shí)，由于數(shù)據(jù)庫中功能基因庫的不完善，使得某些出現(xiàn)在T-RFLP中的RTF可能找不到匹配的對(duì)象[95]。

3.2 克隆文庫技術(shù)

克隆文庫技術(shù)不僅能用于分析樣品中微生物的種類及所占比例，而且還能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無法培養(yǎng)的微生物，再對(duì)文庫中的基因序列進(jìn)行測(cè)定，最終獲得樣品中所含基因的種類和相對(duì)數(shù)量[96]。目前克隆文庫技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微生物的研究，常用的是核糖體RNA 基因克隆文庫的構(gòu)建，主要包括16S rDNA基因克隆文庫、真菌18S rDNA基因克隆文庫及真菌ITS 基因克隆文庫。其中，16S rDNA 克隆建庫技術(shù)較成熟；但該技術(shù)具有成本較高、操作復(fù)雜、耗時(shí)較長的缺點(diǎn)，而且克隆數(shù)目對(duì)于環(huán)境中的微生物多樣性有較大影響[96]。

3.3 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)被稱為下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）[97]，不僅能一次并行測(cè)定幾十萬到幾百萬條DNA 分子的序列，而且還能深入、細(xì)致分析一個(gè)物種的基因組。雖然高通量測(cè)序技術(shù)已發(fā)展到第三代，但由于第二代測(cè)序技術(shù)具有重復(fù)性好、精確性高、不需構(gòu)建文庫、無克隆誤差等優(yōu)點(diǎn)，因此第二代測(cè)序技術(shù)仍然被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微生物多樣性的檢測(cè)。此外，二代測(cè)序的測(cè)序廣度和深度也較克隆文庫技術(shù)大大提高，尤其是提高了數(shù)量上占少數(shù)的微生物群落的覆蓋，這不僅能揭示微生物群落的組成變化，還能從更細(xì)的微生物分類水平上顯示微生物群落的具體變化[98-101]。當(dāng)前，第二代測(cè)序技術(shù)主要是應(yīng)用羅氏454公司的GSFLX測(cè)序平臺(tái)[102]、ABI公司的SOLID測(cè)序平臺(tái)[103]和Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer 測(cè)序平臺(tái)[104]。與第二代測(cè)序技術(shù)相比，雖然第三代測(cè)序技術(shù)能縮短運(yùn)行時(shí)間和提高數(shù)據(jù)讀取速度，而且在測(cè)序過程也無需進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[105]。但該技術(shù)尚未成熟，因此在國內(nèi)外測(cè)序公司中運(yùn)用較少。

4 展望

通過了解厭氧消化體系中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替，不僅有助于保證厭氧消化體系的穩(wěn)定和高效運(yùn)行，而且還對(duì)進(jìn)一步提高厭氧消化體系的性能具有重要的理論意義。同時(shí)，對(duì)厭氧體系中功能微生物特性的挖掘，還能夠發(fā)現(xiàn)具有降解有毒有害物質(zhì)功能的新型微生物；從而促進(jìn)微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用。近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、宏基因技術(shù)和穩(wěn)定同位素探針技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)部分有毒有害物質(zhì)具有降解能力的厭氧功能微生物逐漸被發(fā)掘。雖然厭氧消化體系中功能微生物的研究取得了不同程度的進(jìn)展，但仍有大量菌群尚未確定，尤其是細(xì)菌中含有大量尚未分類的菌種；這極大地限制了關(guān)于功能微生物的研究。目前研究熱點(diǎn)主要集中在重要功能微生物種群隨環(huán)境條件的變化趨勢(shì)、群落結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)、營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)厭氧微生物種群結(jié)構(gòu)影響以及主要門類微生物的功能等方面。就未來發(fā)展趨勢(shì)而言，今后的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：①采用蛋白質(zhì)組學(xué)、宏基因技術(shù)和穩(wěn)定同位素探針技術(shù)來深入了解厭氧體系中對(duì)有毒有害物質(zhì)具有降解效能的功能微生物，并完善功能微生物的培養(yǎng)技術(shù)，以便于揭示微生物的生理生化特性；②可通過篩選和培養(yǎng)厭氧體系中出現(xiàn)的新型微生物，并將其進(jìn)行分離培養(yǎng)以分析該菌屬在厭氧體系中的功能；③深入分析現(xiàn)有厭氧消化體系中已檢出豐度較低的菌屬，揭示該菌屬在體系中的功能。