智能微流控檢測芯片的構(gòu)建及其Pb2+檢測性能

汪偉，彭減，林碩，謝銳，巨曉潔，劉壯，褚良銀

（1四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都610065；2四川大學(xué)高分子材料工程國家重點實驗室，四川成都610065）

及時檢測對環(huán)境和人體健康有害的痕量化學(xué)物質(zhì)對于疾病診斷[1-2]和環(huán)境保護[3-4]等有著至關(guān)重要的作用。Pb2+是含量最豐富的有毒重金屬污染物之一，由于其在生物體中容易積累，即使是微量的Pb2+也會引起腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷以及腦部疾病，尤其是對處于發(fā)育期間的兒童危害極大。因此，許多國家和組織均對水環(huán)境中Pb2+的濃度具有非常嚴格的要求。例如，我國規(guī)定工業(yè)廢水中Pb2+的濃度必須小于2.42×10-6mol/L，而世界衛(wèi)生組織規(guī)定飲用水中Pb2+的濃度必須小于4.83×10-8mol/L。由于Pb2+對人體的重大危害作用，使得及時檢測水環(huán)境中的痕量Pb2+具有十分重要的意義。

目前用于Pb2+的分析檢測方法主要有電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[5]、原子吸收光譜法[6]、電化學(xué)法[7]和熒光探針[8]等，這些方法主要通過將Pb2+濃度信號轉(zhuǎn)化為光信號和電信號進行檢測。但是，通常來說這些技術(shù)所使用的檢測儀器價格昂貴、樣品制備耗時，并且其操作和分析過程繁瑣，需要專業(yè)的人員操作儀器并分析解讀檢測信號。而電化學(xué)法雖然方法簡單、成本低廉，但是易受其他金屬離子的干擾，難以實現(xiàn)高選擇性Pb2+檢測[9-10]；而熒光探針所用到的生物酶通常價格昂貴，且不易儲存[11]。此外，上述方法往往難以實現(xiàn)對于待測物的可視化定量檢測。因此，仍需開發(fā)一種能將Pb2+濃度信號有效轉(zhuǎn)換為易于檢測讀取的可視化輸出信號的新型便捷檢測方法。

環(huán)境刺激響應(yīng)性智能水凝膠材料可響應(yīng)環(huán)境中的多樣化刺激信號變化，并改變自身的化學(xué)物理特性[12-13]，這就為將分析物質(zhì)信號有效轉(zhuǎn)換為多樣化的輸出信號提供了靈活的策略[14-17]?；诖?，本文通過將具有Pb2+響應(yīng)特性的聚(N-異丙基丙烯酰胺-共聚-苯并-18 冠-6 丙烯酰胺)（PNB）智能微凝膠與H 型微通道相結(jié)合，構(gòu)建了一種能便捷、靈敏、可視化檢測水溶液中痕量Pb2+濃度的新型智能Pb2+檢測微流控芯片。該微流控檢測芯片能基于PNB智能微凝膠的Pb2+響應(yīng)性體積相變和H型微通道中的流體流動行為，將Pb2+濃度信號有效轉(zhuǎn)換為微通道中指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化信號，從而實現(xiàn)水溶液中Pb2+濃度的可視化、靈敏定量檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM，純度＞98%）、苯并-18-冠-6丙烯酰胺（B18C6Am）、偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（V50，分析純），梯希愛化城工業(yè)發(fā)展有限公司；N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA，分析純）、亞甲基藍（分析純）、羅丹明B（分析純）、硝 酸 鋰（LiNO3）、硝 酸 鈉（NaNO3）、硝 酸 鉀（KNO3）、硝酸鎂[Mg(NO3)2]、硝酸鈣[Ca(NO3)2]、硝酸鍶[Sr(NO3)2]、硝酸鋇[Ba(NO3)2]、硝酸鉻[Cr(NO3)3]、硝酸鈷[Co(NO3)2]、硝酸鎳[Ni(NO3)2]、硝酸銅[Cu(NO3)2]、硝 酸 鋅[Zn(NO3)2]、硝 酸 鎘[Cd(NO3)2]、硝酸鉛[Pb(NO3)2]，成都市科龍化工試劑廠；聚二甲基硅氧烷（PDMS，Sylgard 184）及固化劑，美國Dow Corning 公司；光刻膠（SU-8 2035）、顯影液（SU-8 Developer），美國MicroChem 公司；硅片，波蘭ITME公司；光掩膜（25400dpi），昆山明確電子有限公司；純水（＞18.2Ω），Millopore Elix-10純水系統(tǒng)。以上試劑除NIPAM 經(jīng)進一步精制再使用外，其余試劑均直接使用。

UVEC-411A 紫外點光源，深圳藍譜里克科技有限公司；G2 Pro 掃描電鏡，復(fù)納科學(xué)儀器（上海）有限公司；GE-5 愛國者顯微鏡，華旗資訊數(shù)碼科技有限公司；MFCS-FLEX 3C 微流體控制系統(tǒng)、FLU-L 流量傳感器，法國Fluigent 公司；OAI 150 型平行曝光機，美國OAI 公司；WS-650MZ-23NPP 勻膠機，美國Laurell 公司；BP-2B 型烘膠臺，北京創(chuàng)世威納科技有限公司；MK1000-24V DC-5.0A-B/TS62控溫熱臺，美國Instec公司；ZK-82BB 電熱真空干燥箱，上海市實驗儀器總廠；PDC-32G-2 等離子體清洗系統(tǒng)，美國Harrick 公司；FA2004 電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；Millipore Elix-10 純水系統(tǒng)，Millipore公司。

1.2 智能Pb2+檢測微流控芯片的構(gòu)建

基于軟光刻技術(shù)[18]，以具有良好光學(xué)透明性的PDMS 為基材[19]，構(gòu)建具有H 型微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片。其主要制作步驟包括：首先用乙醇和去離子水超聲清洗硅片；然后，在硅片表面通過勻膠機旋涂得到具有一定厚度的SU-8 膠，再利用烘膠臺進行前烘處理，使得SU-8 膠中有機物揮發(fā)和冷卻固化；接著，在紫外平行光下曝光，并且進行后烘，使得曝光區(qū)域的SU-8 膠交聯(lián)；待硅片冷卻后經(jīng)顯影得到具有H 型微通道凸起結(jié)構(gòu)的SU-8 膠圖案；最后，通過150℃硬烘、PDMS 澆鑄以及與玻片緊密鍵合，從而構(gòu)建得到具有H型微通道結(jié)構(gòu)的PDMS微流控芯片。

制得PDMS微流控芯片后，通過結(jié)合具有圓形透光微孔的光掩膜，在微流控芯片內(nèi)原位聚合制備具有Pb2+響應(yīng)特性的圓柱狀PNB智能微凝膠。具體步驟為：首先，將2mmol NIPAM、0.3mmol B18C6Am、0.04mmol MBA、0.185mmol V50 溶解到2mL 去離子水中以配制單體溶液。其次，在光學(xué)顯微鏡協(xié)助下，將光掩膜圓形透光微孔的中心與PDMS微流控芯片中的微凝膠固定柱的中心對齊，并以光掩膜在下、PDMS 微流控芯片在上的順序用UV 無影膠將兩者固定在一起。然后，將單體溶液裝入注射器中，并經(jīng)同一個注射器分流由微流控芯片的入口1和入口2 分別注入其微通道中，同時將空氣排出。使用紫外點光源由下往上經(jīng)下層光掩膜的圓形透光微孔照射上層微流控芯片中的單體溶液30s，以在微通道中進行單體溶液的原位聚合反應(yīng)。紫外光照完畢后，將微流控芯片取出，去掉光掩膜，由入口3通入去離子水沖洗微通道5min以去除未反應(yīng)完的單體，最終得到微通道中結(jié)合有PNB 智能微凝膠的智能Pb2+檢測微流控芯片。

1.3 智能Pb2+檢測微流控芯片的結(jié)構(gòu)表征

利用掃描電鏡對PDMS微流控芯片的微通道結(jié)構(gòu)進行表征，利用光學(xué)顯微鏡對微流控芯片的微通道結(jié)構(gòu)以及其中的智能微凝膠進行形貌表征，利用數(shù)碼相機對微流控芯片整體外觀進行表征。為了便于觀察智能微凝膠以及微通道結(jié)構(gòu)，在微流控芯片中通入了經(jīng)羅丹明B（0.01mol/L）染色的水溶液。

1.4 智能Pb2+檢測微流控芯片的Pb2+檢測性能表征

首先，將微流控檢測芯片置于熱臺上，并利用注射泵將一個注射器中的去離子水以2000μL/h 的流速分流由入口1 和入口2 注入微流控檢測芯片中；同時，以500μL/h 的流速由入口3 向微流控檢測芯片通入經(jīng)亞甲基藍染色的指示液。利用熱臺調(diào)控微流控檢測芯片中的溫度，在每個溫度平衡15min后，記錄該溫度條件下H型微通道中指示液所覆蓋的指示柱的數(shù)目。以1℃為間隔改變微流控檢測芯片中的溫度，并重復(fù)上述記錄過程。以溫度改變1℃后指示柱被覆蓋數(shù)目變化最大時所對應(yīng)的溫度作為最佳操作溫度。

然后，在最佳操作溫度條件下，研究Pb2+濃度對H型微通道中指示液的流形以及指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目變化的影響，以確立Pb2+濃度和指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目變化之間的對應(yīng)關(guān)系。實驗中采用微流體控制系統(tǒng)來控制入口1和入口2中通入的樣品液總流速為2000μL/h、入口3中通入的指示液流速為500μL/h，并采用數(shù)碼光學(xué)顯微鏡對H型微通道中指示液的流動情況以及指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目的變化情況進行觀察研究。實驗中采用了左、右兩邊指示柱中分別被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化的絕對值之和來指示Pb2+濃度的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 智能Pb2+檢測微流控芯片的設(shè)計原理

圖1 智能Pb2+檢測微流控芯片的檢測原理

圖2 智能Pb2+檢測微流控芯片微通道中的凝膠固定柱、緊縮段和指示柱陣列的掃描電鏡圖

該智能Pb2+檢測微流控芯片主要通過將具有Pb2+響應(yīng)性體積相變特性的PNB智能微凝膠與H型微通道結(jié)構(gòu)相結(jié)合，從而將Pb2+濃度變化信號有效轉(zhuǎn)化為簡單易讀、易可視化檢測的指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化信號。該智能Pb2+檢測微流控芯片具有的H型微通道結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示，其右下角的支路微通道中結(jié)合有Pb2+響應(yīng)性PNB智能微凝膠，其余三個支路微通道中具有一個較小尺寸的緊縮段。該智能Pb2+檢測微流控芯片可通過PNB智能微凝膠響應(yīng)Pb2+濃度信號后的體積變化，來調(diào)控其所在的支路微通道的流阻，從而調(diào)控H型微通道中指示液的流動。當PNB 智能微凝膠響應(yīng)Pb2+時，其PNIPAM 高分子鏈上懸掛的B18C6Am 基團能識別Pb2+，并與之絡(luò)合形成穩(wěn)定的帶正電荷的B18C6Am/Pb2+“主-客體”絡(luò)合物。該絡(luò)合物的形成會增加智能微凝膠的親水性和絡(luò)合物之間的靜電排斥作用，使得智能微凝膠的體積相轉(zhuǎn)變溫度向高溫遷移，從而使得PNB 智能微凝膠在等溫條件下響應(yīng)Pb2+后體積發(fā)生溶脹［圖1(c)、(d)］[16]。這種體積溶脹減小了PNB 智能微凝膠和微通道壁面之間流體流動的縫隙，從而使得流阻增大、流速減小，因此H型微通道兩端的壓力不等，使得指示液發(fā)生流動，導(dǎo)致其所覆蓋的指示柱數(shù)目發(fā)生變化［圖1(a)、(b)］。由于當Pb2+濃度不同時，可能會出現(xiàn)指示液覆蓋面積相同的情況，因此，檢測時采用了左、右兩邊被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化的絕對值之和作為指標來反映Pb2+濃度的變化。而通過方便地采用光學(xué)顯微鏡觀察測定上述指示柱數(shù)目的變化，則可以實現(xiàn)對于水中痕量Pb2+的靈敏、定量、可視化檢測。

2.2 智能Pb2+檢測微流控芯片的可控構(gòu)建

圖3 智能Pb2+檢測微流控芯片內(nèi)部微通道結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡圖及具有3個獨立H型微通道的微流控芯片數(shù)碼照片

該微流控檢測芯片主要以PDMS為基材、通過成熟的軟光刻技術(shù)來構(gòu)建。如圖2(a)所示為H型微通道[圖1(a)]右下角支路微通道中用于固定智能微凝膠的固定柱，其中，支路微通道寬度為300μm，固定柱直徑為100μm；如圖2(b)所示為H型微通道[圖1(a)]其余三個支路微通道中所具有的緊縮段結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖，其中緊縮段結(jié)構(gòu)的寬度為50μm；而圖2(c)所示則為H 型微通道[圖1(a)]中間指示柱陣列的掃描電鏡圖，其中指示柱直徑為100μm。從以上圖中可以看出，通過軟光刻技術(shù)成功構(gòu)建出了所需的微流控檢測芯片中的微尺度結(jié)構(gòu)。通過結(jié)合光掩膜以在微通道中微凝膠固定柱的位置原位聚合單體溶液，可以進一步在微通道中制備得到圓柱形的PNB智能微凝膠。如圖3(a)所示為結(jié)合有圓柱形智能PNB 微凝膠的H 型微通道的光學(xué)顯微鏡圖，該微通道中充滿了經(jīng)羅丹明B染色的水溶液。從圖3(a)中可以明顯看出，該微流控檢測芯片具有H型微通道結(jié)構(gòu)，且H型微通道右下角的微凝膠固定柱上結(jié)合有一個圓柱形的智能微凝膠，而其余三個支路微通道中則具有一個較小尺寸的緊縮段結(jié)構(gòu)；此外，該H型微通道中間還具有左、右兩部分的指示柱陣列。如圖3(b)所示為包含有3 個獨立的H型微通道的智能Pb2+檢測微流控芯片的數(shù)碼照片，從該圖中可以看出，即使該微流控芯片內(nèi)部具有3個獨立的H型微通道，其整體尺寸仍僅相當于一枚硬幣大小，展現(xiàn)出了該微流控芯片的小巧和便攜性。

圖4 不同溫度下指示液覆蓋指示柱情況的光學(xué)顯微鏡圖

2.3 智能Pb2+檢測微流控芯片的最佳操作溫度

該微流控芯片對Pb2+的靈敏檢測主要基于PNB智能微凝膠絡(luò)合Pb2+后發(fā)生的體積溶脹所導(dǎo)致的流體流動行為變化。為了確定該智能Pb2+檢測微流控芯片的最佳操作溫度，實驗中測定了不同溫度條件下H 型微通道中被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化。如圖4所示為不同溫度條件下H型微通道中指示液流形的變化以及指示液對指示柱的覆蓋情況的變化。從圖4中可以看出，當溫度逐漸由29℃升高至34℃的過程中，由于PNB 智能微凝膠不斷收縮，從而導(dǎo)致右下角支路微通道中供樣品液流動的橫截面積增大、流阻減小，使得H型微通道中分布在右側(cè)流動的指示液逐漸向左側(cè)流動，從而流形發(fā)生變化。而在指示液流形變化的過程中，指示液所覆蓋的指示柱的數(shù)目亦發(fā)生變化。如圖5所示，與其他溫度相比，當操作溫度為32℃時，該微流控芯片展現(xiàn)出了最大的指示柱被覆蓋數(shù)目的變化；因此，選定了32℃作為該微流控芯片的最佳操作溫度。

2.4 智能Pb2+檢測微流控芯片的Pb2+檢測性能

圖5 不同溫度下指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化（ΔN）情況

為了研究該微流控檢測芯片的Pb2+檢測性能，分別向該微流控檢測芯片中通入去離子水及不同濃度的Pb2+溶液，并記錄Pb2+濃度與H 型微通道中指示液流形以及指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目之間的關(guān)系。如圖6 所示為不同Pb2+濃度下H 型微通道中指示液流形以及指示液覆蓋指示柱情況的光學(xué)顯微鏡圖。從該圖中可以看出，當Pb2+濃度由0mol/L（純水）逐漸增大為10-5mol/L 時，由于PNB 智能微凝膠不斷發(fā)生體積溶脹，從而導(dǎo)致右下角微通道橫截面積減小、流阻增大，使得H型微通道中分布在左側(cè)流動的指示液逐漸向右側(cè)流動，進而指示液流形發(fā)生變化。在此過程中，H型微通道中被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目亦隨之發(fā)生改變。并且，從圖6(a)和圖6(b)中可以看出，即使通入濃度低至10-10mol/L的Pb2+溶液，被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目與通入去離子水（0mol/L）時相比仍然變化了6 個，說明該微流控檢測芯片具有很高的靈敏度。進一步地，基于圖7 所示的Pb2+濃度與被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化之間的關(guān)系曲線以及公式，通過方便地觀察H 型微通道中被指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化，則可定量、靈敏地分析出樣品液中的Pb2+濃度，其檢測限可低至10-10mol/L。該方法可以精確檢測出樣品液中Pb2+濃度所處的數(shù)量級，而通過進一步增加指示柱數(shù)量、減小指示柱尺寸，還可以進一步提高該檢測芯片對上述Pb2+濃度范圍內(nèi)，因微小Pb2+濃度變化所引起的微小指示液流形變化，從而提高檢測芯片的靈敏度和準確性。此外，對于樣品液中存在顆粒等雜質(zhì)的情況，可通過在檢測芯片上游設(shè)置一過濾裝置先除去顆粒等雜質(zhì)后，再進行樣品液中Pb2+濃度的檢測。

圖6 不同Pb2+濃度下指示液覆蓋的指示柱情況的光學(xué)顯微鏡圖

圖7 指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化與Pb2+濃度之間的關(guān)系

2.5 智能Pb2+檢測微流控芯片的抗干擾性能

圖8 干擾離子對指示液覆蓋的指示柱數(shù)目變化的影響

為了探明該微流控芯片對Pb2+檢測的高選擇性，研究了當樣品液中加入不同干擾離子時對H型微通道中被指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目的影響。如圖8所示，與通入去離子水時指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目相比，當通入的樣品液中含有濃度為10-6mol/L的Ba2+時，指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目僅變化了1個；而當通入樣品液中含如圖8所示的其余12種干擾離子中的任一種干擾離子（濃度均為10-6mol/L）時，指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目并不會發(fā)生變化。相比之下，當通入樣品液中含有10-6mol/L的Pb2+時，指示液所覆蓋的指示柱數(shù)目變化了16 個，遠高于通入干擾離子時的指示柱數(shù)目變化。上述結(jié)果表明，基于PNB智能微凝膠對Pb2+的高選擇性，該微流控檢測芯片亦展示出了對Pb2+檢測的高選擇性。

3 結(jié)論

本文通過將PNB 智能微凝膠與具有H 型微通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片相結(jié)合，有效地將水溶液中的Pb2+濃度信號轉(zhuǎn)換為易于可視化檢測和讀取的指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化，從而構(gòu)建了一種能便捷、靈敏檢測痕量Pb2+濃度的微流控檢測芯片。系統(tǒng)研究了該微流控檢測芯片的形貌結(jié)構(gòu)和H型微通道中的流體流動行為，以及Pb2+濃度與指示液覆蓋的指示柱數(shù)目之間的關(guān)系。通過光學(xué)顯微鏡便捷觀察測量指示液覆蓋的指示柱數(shù)目的變化，成功實現(xiàn)了水溶液中Pb2+濃度的超靈敏檢測。此外，通過在該檢測芯片中結(jié)合能響應(yīng)其他刺激信號（如葡糖糖、K+等）而發(fā)生體積相變的智能凝膠，還可以方便地實現(xiàn)對于不同物質(zhì)的檢測。因此，該微流控芯片為水環(huán)境中痕量Pb2+的超靈敏可視化檢測提供了新的策略。