殼聚糖對骨組織工程中組織修復(fù)的影響

焦延鵬，李立華，羅丙紅，周長忍

(暨南大學(xué)材料科學(xué)與工程系，廣東 廣州510632)

殼聚糖對骨組織工程中組織修復(fù)的影響

焦延鵬，李立華，羅丙紅，周長忍

(暨南大學(xué)材料科學(xué)與工程系，廣東 廣州510632)

材料植入體內(nèi)必然引起宿主體的應(yīng)答，促進(jìn)或抑制組織愈合。由于降解材料在體內(nèi)的降解產(chǎn)物會隨時(shí)間而變，產(chǎn)生的宿主體應(yīng)答就會不同，進(jìn)而會影響組織的愈合。而促進(jìn)或抑制組織愈合的機(jī)制就成為新型醫(yī)用高分子材料設(shè)計(jì)和制備的理論基礎(chǔ)。殼聚糖是理想的骨組織修復(fù)材料之一，但至今還不清楚殼聚糖體內(nèi)不同降解過程對組織修復(fù)的影響機(jī)制，也就無法設(shè)計(jì)出性能優(yōu)良的殼聚糖基新材料。文章沒有羅列殼聚糖基生物材料在骨組織工程中應(yīng)用所取得的進(jìn)展，而是重點(diǎn)闡述了殼聚糖在骨組織工程中應(yīng)用的復(fù)雜性和對組織修復(fù)的影響，探討了殼聚糖進(jìn)一步用于骨組織工程所需要解決的問題。

殼聚糖;骨組織工程;組織修復(fù)

1 前言

自20世紀(jì)80年代提出應(yīng)用組織工程學(xué)概念對組織修復(fù)和替換以來，其各項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，包括種子細(xì)胞、支架材料以及細(xì)胞/支架復(fù)合體的功能實(shí)現(xiàn)等研究，一直是國際上生物學(xué)、材料科學(xué)、醫(yī)學(xué)等眾多學(xué)科領(lǐng)域的前沿研究內(nèi)容。隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展和臨床治療技術(shù)的不斷進(jìn)步，組織再生與構(gòu)建的研究與應(yīng)用如雨后春筍，有些結(jié)構(gòu)簡單的組織再生與構(gòu)建已經(jīng)進(jìn)入臨床試用階段。盡管這些簡單的組織替代物已經(jīng)在臨床治療上發(fā)揮了重要作用，但還遠(yuǎn)未達(dá)到天然器官或組織的臨床要求，無論在功能還是性能上都相差甚遠(yuǎn)。究其原因，既有種子細(xì)胞來源及其大規(guī)模培養(yǎng)的問題，也有組織構(gòu)建和臨床實(shí)施的技術(shù)問題，但合適的支架材料更是一個(gè)至關(guān)重要的因素，因?yàn)榻M織的構(gòu)建或再生以及細(xì)胞的功能，都必須依賴于理想的細(xì)胞外基質(zhì)。

骨組織工程是目前生命科學(xué)研究最活躍的領(lǐng)域之一，近20年來的研究成果為整形外科、口腔頜面外科、手外科醫(yī)師和廣大患者提供了治療骨缺損的新希望。其基本原理是將體外培養(yǎng)的活組織細(xì)胞擴(kuò)增，種植于生物相容性良好、生物可降解的支架材料上，然后移植到所需部位，在機(jī)體內(nèi)細(xì)胞繼續(xù)增殖，隨著支架材料逐漸被降解、吸收，形成新的有功能的組織器官，從而達(dá)到修復(fù)結(jié)構(gòu)、恢復(fù)功能的目的，由此可見支架材料是組織工程成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。圖1給出組織工程各要素的相互關(guān)系。

圖1 組織工程各要素的相互關(guān)系Fig.1 Relationship among key elements of tissue engineering

在骨組織工程的研究中，原位組織再生與構(gòu)建的方法很多，但其中最重要的一種方法是將具有生物活性的材料植入缺損位點(diǎn)，利用材料對機(jī)體的刺激，促使機(jī)體自愈合機(jī)制的建立，誘導(dǎo)損傷組織自身分泌特異性細(xì)胞因子，并通過系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)途徑來激活相應(yīng)的細(xì)胞，借助細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯功能，依照生物化學(xué)和生物物理學(xué)的原理，在缺損部位自身“生物合成”形成新的組織。材料在這一過程中不僅僅是扮演了支架的角色，更重要的是作為一種具有生物活性的刺激物來發(fā)揮作用。

2 殼聚糖及其衍生物在骨組織中的應(yīng)用

2.1 殼聚糖及其衍生物

圖2 殼聚糖的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of chitosan molecular structure

殼聚糖是由甲殼素脫乙酰后產(chǎn)生的一種可體內(nèi)降解吸收的天然生物多糖，是自然界唯一的帶正電的多糖類高分子材料，分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。殼聚糖在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用，已經(jīng)受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，每年有關(guān)殼聚糖或甲殼素的論文研究和專利很多［1－3］。國內(nèi)外的研究已經(jīng)表明，殼聚糖作為人工皮膚具有促進(jìn)創(chuàng)傷上皮化，形成肉芽組織，加速傷口愈合的功能［4－5］;作為眼科材料，殼聚糖抑制纖維結(jié)締組織，減少疤痕組織形成和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用［6］，可以用作角膜接觸鏡、粘彈劑、人工淚液、結(jié)膜緩釋藥膜等;作為神經(jīng)導(dǎo)管材料，殼聚糖可以有選擇地抑制成纖維細(xì)胞的生長和促進(jìn)神經(jīng)膜細(xì)胞生長的功能［7－8］;作為骨科材料的研究更是日新月異。自然界中甲殼素的生理功能經(jīng)常與纖維素相比較，兩者均是在生物復(fù)合材料中形成纖維束的胞外多糖。自然界中的甲殼素纖維是包埋在蛋白基質(zhì)中，蛋白與多糖的結(jié)合多以共價(jià)鍵形式存在，雖然與多糖結(jié)合的蛋白已經(jīng)能分離和表征，但其中的蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度及多糖－多肽鍵的化學(xué)結(jié)構(gòu)還不清楚［9］。

2.2 在骨組織工程中的應(yīng)用

我國每年由各種原因引起骨損傷、脊柱融合、骨缺損的患者高達(dá)一千萬余，其中需使用骨修復(fù)材料的約占100萬例，而缺乏理想的骨再生材料一直懸而未決。僅對骨科而言，骨誘導(dǎo)型骨組織修復(fù)材料的發(fā)展，將大大推動(dòng)骨修復(fù)材料的應(yīng)用。骨科臨床上有很多疑難病癥，藥物和其他傳統(tǒng)方法都無能為力，需要應(yīng)用骨移植、修復(fù)或再生。殼聚糖植入體內(nèi)會引起受主機(jī)體各種類型的應(yīng)答，更重要的是殼聚糖在體內(nèi)的降解產(chǎn)物又隨植入時(shí)間的不同而發(fā)生變化，恰恰就是這些不同時(shí)期降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、分布和分子量，會影響細(xì)胞功能，甚至?xí)蜣D(zhuǎn)錄、翻譯，進(jìn)而對組織愈合有較大地促進(jìn)或抑制作用。

在損傷骨組織的修復(fù)和再生過程中，材料的性能和形態(tài)會影響細(xì)胞外基質(zhì)的性能，進(jìn)而影響骨組織的修復(fù)和再生。骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)主要是膠原蛋白、蛋白多糖聚集體、非膠原糖蛋白如骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨粘連蛋白等。鑒于甲殼素在自然界中的存在形式多是與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，人體內(nèi)的許多糖蛋白也含有氨基葡聚糖結(jié)構(gòu)，所以，殼聚糖植入人體后的各種降解產(chǎn)物均會與蛋白發(fā)生作用，進(jìn)而與細(xì)胞作用后影響骨組織的再生和修復(fù)［10－11］。

雖然國際上許多國家已經(jīng)批準(zhǔn)殼聚糖作為植入人體的生物材料，但國內(nèi)外臨床使用的殼聚糖類植入材料經(jīng)常出現(xiàn)一些不良現(xiàn)象，其原因有材料的制備加工問題，應(yīng)用問題以及臨床問題，但最關(guān)鍵的是目前的研究主要多集中在對其改性、復(fù)合、加工及其一般的生物相容性研究，而對其在體內(nèi)不同時(shí)期的降解產(chǎn)物的組成及其對組織修復(fù)過程的影響關(guān)注不多，尤其是忽略了降解產(chǎn)物(殼寡糖)及其與蛋白質(zhì)結(jié)合后對細(xì)胞功能和性能的影響［12－13］。雖然國內(nèi)外大量的研究表明:殼聚糖對骨組織修復(fù)有一定的促進(jìn)作用，但殼聚糖體內(nèi)降解的不同產(chǎn)物對細(xì)胞乃至對人體生命的潛在影響尚未研討清晰。

作為骨科修復(fù)材料，殼聚糖具有防止組織粘連，預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨退變，并有促進(jìn)傷口愈合［14］，控制傷口水分損失，抑制外源微生物感染等作用［15］。有研究報(bào)道殼聚糖降解生成的單糖被體液磷酸化后，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞外基質(zhì)的一部分，參與損傷組織的修復(fù)［16］。問題是殼聚糖在體內(nèi)的降解產(chǎn)物不僅僅是單糖參與作用，而是降解過程中產(chǎn)生的各種低聚糖或寡糖都能與蛋白結(jié)合或磷酸化，這些不同性能的殼聚糖及其衍生物在體內(nèi)的作用機(jī)制應(yīng)該系統(tǒng)分析研究，為殼聚糖在體內(nèi)的廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

3 殼聚糖在骨組織中應(yīng)用存在的問題

3.1 殼聚糖在組織構(gòu)建與再生過程的作用復(fù)雜

殼聚糖是由氨基葡聚糖和乙?；被暇厶?種結(jié)構(gòu)單元通過β-1，4糖苷鍵構(gòu)成，是一種纖維增強(qiáng)素，負(fù)責(zé)細(xì)胞壁的堅(jiān)固性，因而作為組織再生或構(gòu)建的材料，是否會與人體內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生作用而影響細(xì)胞的功能或活性，尚有待進(jìn)一步探討。殼聚糖在體內(nèi)的降解主要是在廣泛存在于人體各種組織和體液中的溶菌酶的作用下完成的，主要的降解產(chǎn)物是(GlcN-GlcNAc)，GlcN和GlcNAc。盡管殼聚糖及其降解產(chǎn)物無抗原性，不會產(chǎn)生抗體，但殼聚糖植入人體后會激活其他免疫系統(tǒng)(如免疫細(xì)胞、免疫球蛋白或補(bǔ)體分子等 )而有“異物”反應(yīng)［17］。

人體內(nèi)含有許多氨基聚糖，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸角質(zhì)素含有N-乙酰氨基葡萄糖等。這些氨基聚糖的糖鏈可通過糖苷鍵共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)，從而形成蛋白聚糖。蛋白聚糖單體又可借非共價(jià)鍵與透明質(zhì)酸結(jié)合形成多聚體。氨基糖在體內(nèi)可與膠原、彈性蛋白、粘連蛋白結(jié)合。骨骺中的硫酸軟骨素蛋白聚糖可結(jié)合Ca2+，促進(jìn)鈣化。氨基聚糖(肝素)可與血漿蛋白中的凝血因子結(jié)合，具有抗凝作用，肝素還可與脂蛋白脂肪酶結(jié)合。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖可與FGF(成纖維細(xì)胞因子)結(jié)合，嵌入質(zhì)膜中成為跨膜結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞－細(xì)胞，細(xì)胞－基質(zhì)之間的信息交換等等。

綜上所述，殼聚糖與人體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)的性能都有一定的差別。因此，殼聚糖作為骨組織再生與構(gòu)建時(shí)都有“異物”表現(xiàn)也不足為奇，而產(chǎn)生“異物”的原因及其更深層的問題應(yīng)該探明［18］。

3.2 殼聚糖對細(xì)胞功能的影響及對細(xì)胞內(nèi)通路作用的機(jī)制尚不清楚

組織的再生與修復(fù)是細(xì)胞分裂、分化和自組裝的系統(tǒng)工程，而細(xì)胞對胞外環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答是通過感知某種化學(xué)信號和物理刺激，并將其傳遞到細(xì)胞核，觸發(fā)或阻遏基因的表達(dá)，生產(chǎn)的基因產(chǎn)物最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、遷移、分化和凋亡。細(xì)胞的功能不僅受到胞外基質(zhì)的影響，也受到機(jī)械力的制約，因?yàn)闄C(jī)械力會影響細(xì)胞的形狀，進(jìn)而影響細(xì)胞對它的信號刺激所做的應(yīng)答，結(jié)果細(xì)胞不是生長就是凋亡。對骨組織修復(fù)而言，力學(xué)刺激對骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)等增殖分化的影響就更加明顯。利用力學(xué)裝置加載應(yīng)力于成骨細(xì)胞或MSC，模擬在人體正常生理狀態(tài)時(shí)力學(xué)環(huán)境，觀察細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)之一［19－20］。

在骨組織修復(fù)或再生的過程中，材料可通過系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)途徑來激活相應(yīng)的細(xì)胞，在缺損部位自身“生物合成”形成新的組織。目前認(rèn)為力學(xué)耦聯(lián)、生化耦聯(lián)、信號傳遞和效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)，將作用在骨組織的應(yīng)力信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為生物化學(xué)信號。細(xì)胞外間質(zhì)、整合素、局部粘著蛋白和細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)相互聯(lián)系，構(gòu)成了一個(gè)完善的張力整合系統(tǒng)［21－22］。在力學(xué)載荷的作用下，由于骨組織細(xì)胞的變形，通過細(xì)胞外基質(zhì)和整合素，可導(dǎo)致細(xì)胞骨架成分的重組，啟動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［23］。其中涉及多條信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，多種蛋白的參與，包括鈣離子通道復(fù)合體、G蛋白耦聯(lián)通路、一氧化氮合酶(NOS)、PEG2、磷酸酰肌醇信使系統(tǒng)、MAPK通路等。NF-κB也是參與力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路之一，不同材料對NF-κB影響的結(jié)果不同，即使是相同的材料如殼聚糖，由于其糖基不同，分子量不同，乙?；潭炔煌?，引起NF-κB激活和炎癥發(fā)生的結(jié)果也不同。材料的化學(xué)性能是否因其所具有的某些特殊的化學(xué)基因，使得其可作用于免疫系統(tǒng)，激活細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號通路，現(xiàn)在還不清楚。

成骨細(xì)胞是重要的感受與效應(yīng)細(xì)胞，可通過力敏感離子通道、G蛋白與酪氨酸激酶、整合素受體與細(xì)胞骨架等多種途徑，感受體內(nèi)外力學(xué)刺激，并將力學(xué)刺激信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物化學(xué)信號，介導(dǎo)力相關(guān)敏感基因表達(dá)，合成各種酶類等活性物質(zhì)，激活信號網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)反應(yīng)，參與一系列復(fù)雜的生理病理活動(dòng)，因此力學(xué)環(huán)境在維持骨組織正常形態(tài)和功能活動(dòng)中發(fā)揮著重要的影響。目前研究發(fā)現(xiàn):成骨細(xì)胞對不同類型的力學(xué)刺激有不同的感受和應(yīng)答機(jī)制。成骨細(xì)胞在骨的生長發(fā)育及形成過程中起重要作用。成骨細(xì)胞的分化時(shí)機(jī)、分化方向受嚴(yán)格控制。這種調(diào)控方式是由極其復(fù)雜的信號分子與其相連的信號通路實(shí)現(xiàn)的。完整、全面地研究和認(rèn)識成骨細(xì)胞分化過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，是深入研究成骨細(xì)胞分化的條件，同時(shí)也是實(shí)現(xiàn)骨組織工程化培養(yǎng)的重要基礎(chǔ)。

研究表明，BMP/Smads信號通路及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與成骨細(xì)胞分化并在其中發(fā)揮著重要作用［24］。如Rochet等研究表明［25］，在 Cemented中滲加2%的殼聚糖后，破骨細(xì)胞對復(fù)合生物材料的吸收能力降低，殼聚糖對破骨細(xì)胞重吸收活性的抑制作用提示材料植入后的骨形成及骨重塑，說明殼聚糖有利于骨的重建。有研究顯示在骨缺損后各個(gè)時(shí)段增加殼聚糖降解產(chǎn)物殼寡糖的給藥，BMP-2和TGF-beta的表達(dá)明顯高于對照組，使BMP峰值提前，且持續(xù)時(shí)間明顯延長。上述結(jié)果提示殼寡糖可能通過某種機(jī)制使得BMP和TGF-beta在骨折后的修復(fù)過程中表達(dá)增強(qiáng)，從而使骨折端BMP和TGF-beta的含量增加，增加了間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)了骨折愈合過程中生長因子與成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的正反饋調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨折端骨質(zhì)形成，從而加快了骨折的修復(fù)及愈合過程。研究表明，殼寡糖能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，500 mg/L為最適質(zhì)量濃度，且殼寡糖的效果優(yōu)于氨基葡萄糖和羧甲基殼寡糖。殼寡糖對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨組織微觀結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用也有報(bào)道，殼寡糖可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的體外增殖，通過增加Ca，Mg等礦物元素在骨骼中的沉積率提高去除卵巢大鼠股骨的骨強(qiáng)度，從而顯著提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型動(dòng)物股骨干骺端的骨礦物質(zhì)密度［26］。

最近有報(bào)道指出，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在殼寡糖膜上生長良好且可在外界誘導(dǎo)下向骨細(xì)胞分化［21］。殼聚糖及其降解產(chǎn)物促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制可能有以下幾點(diǎn):①可能是通過某種機(jī)制使得一些細(xì)胞因子如BMP表達(dá)上調(diào)，從而使得BMP/Smads信號通路激活，增加間充質(zhì)細(xì)胞向骨組織細(xì)胞的分化;②殼寡糖可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入到細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)物質(zhì)作用，通過直接或間接作用影響B(tài)MP/Smads通路;③殼寡糖通過與胞膜受體結(jié)合，啟動(dòng)BMP/Smads信號通路，從而影響了下游基因表達(dá)。

4 結(jié)語

殼聚糖除了能夠較好地調(diào)節(jié)合成材料的降解產(chǎn)物的酸性之外，在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)殼聚糖與成骨細(xì)胞具有良好的相容性，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，是一類有著巨大應(yīng)用前景的骨組織修復(fù)材料，但問題是，尚未探明其骨細(xì)胞增殖分化的機(jī)制，尤其是殼聚糖的作用是在細(xì)胞外還是在細(xì)胞內(nèi)，具體的作用點(diǎn)是什么，尚未探明。用殼聚糖及其衍生物對骨組織進(jìn)行修復(fù)研究，在研究中發(fā)現(xiàn)骨組織修復(fù)本身是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，不但需要多種蛋白生長因子的參與和協(xié)同作用，而且一些物理化學(xué)因素，也對其產(chǎn)生重要的影響。關(guān)鍵是殼聚糖及其降解產(chǎn)物參與的協(xié)同作用尚不清晰，有待進(jìn)一步探索。初步研究表明，殼聚糖類材料不但可以促進(jìn)細(xì)胞的分化，加速組織的形成，而且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的表型表達(dá)，其中生長因子的加入，對于骨組織的形成具有重要的影響，尤其是對于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的定向分化，具有重要的調(diào)節(jié)作用，但需要更深入的機(jī)理性研究。

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Effect of Chitosan on Tissue Repair in Bone Tissue Engineering

JIAO Yanpeng，LI Lihua，LUO Binghong，ZHOU Changren
(Department of Materials Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Materials implanted in the body would inevitably lead to host response，promoting or inhibiting tissue healing.The degradation products of biodegradable materials in the body will change with time，resulting in different host responses and further affecting tissue healing.Therefore，the mechanism of promoting or inhibiting tissue healing becomes the theoretical basis for the design and preparation of novel biomedical polymer materials.Chitosan is one of the ideal medical polymer materials，but we still do not know the effect mechanism of chitosan degradation process on tissue repair in vivo.So it will not be able to design chitosan-based materials with excellent performance.This review does not lay out the progress of the chitosan-based biomaterials applied in bone tissue engineering，but focuses on the complexity of chitosan applications for bone tissue engineering，furthermore investigates the problems needed to be solved for chitosan used in bone tissue engineering.

chitosan;bone tissue engineering;tissue repair

R318.08

A

1674－3962(2012)09－0035－05

2012－04－18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171459，50903039)

焦延鵬，男，1975年生，副研究員

周長忍，男，1956年生，教授，博士生導(dǎo)師

10.7502/j.issn.1674－3962.2012.09.05