粳型恢復(fù)系C418轉(zhuǎn)基因再生體系的建立

張曉磊， 韋永貴， 董卓婭， 孫宏偉， 羅 龍

(文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 云南 文山 663099)

水稻(OryzasativaL.)原產(chǎn)于中國(guó)，是全球最重要的糧食作物之一。高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)及強(qiáng)抗逆性是水稻育種的主要目標(biāo)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，利用基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)抗逆新品種成為保證和提高水稻產(chǎn)量的重要技術(shù)之一。水稻基因轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵在于選擇和建立良好的植物受體系統(tǒng)。20世紀(jì)90年代初，HIEI 等[1]首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)對(duì)粳稻的高效轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)入水稻遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)用階段。由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化取決于外植體培養(yǎng)所得的愈傷組織質(zhì)量，愈傷組織的誘導(dǎo)狀態(tài)直接決定水稻遺傳轉(zhuǎn)化的效率。因此，在水稻育種中，愈傷組織誘導(dǎo)是建立水稻轉(zhuǎn)基因再生體系中最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)。郭麗[2]以水稻成熟種子為材料研究不同培養(yǎng)基、不同濃度激素及不同激素配比多種因素對(duì)水稻愈傷組織的形成及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示，常規(guī)培養(yǎng)基(N6、B5)無法滿足水稻生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，組合培養(yǎng)基(NB、MS)誘導(dǎo)的愈傷組織出愈率高，生長(zhǎng)狀態(tài)好。韋新宇等[3]研究表明，水稻基因型及培養(yǎng)基中添加的激素含量、激素類別及配比均影響水稻愈傷組織誘導(dǎo)。唐軒等[4]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)刖局?，成功獲得轉(zhuǎn)基因體系。目前，在水稻愈傷組織誘導(dǎo)的研究方面，組合培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)僅有小范圍分析，不利于水稻愈傷組織培養(yǎng)條件優(yōu)化。鑒于此，筆者等擬通過擴(kuò)大范圍比較不同培養(yǎng)基對(duì)水稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響，優(yōu)化水稻愈傷組織的培養(yǎng)，為后續(xù)水稻再生體系的建立提供有利條件。研究通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立水稻轉(zhuǎn)基因再生體系，分析不同2,4-D濃度和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)水稻成熟胚誘導(dǎo)的影響，建立粳型恢復(fù)系C418轉(zhuǎn)基因再生體系，以期為水稻轉(zhuǎn)基因育種和突變體庫的建立創(chuàng)造有利條件。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1水稻材料北方骨干粳型恢復(fù)系C418，早熟中粳類型，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供， 于-20℃冰箱保存。

1.1.2試劑及菌株2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，4℃避光存放。含目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株pCAMBIA1301，-80℃冰箱保存，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.3培養(yǎng)基7種基礎(chǔ)培養(yǎng)基(N6、MS、MSN、NMB、NB、MB和NBD)，繼代培養(yǎng)基(N6+2 mg/L 2,4-D，pH 5.8)，懸浮培養(yǎng)基(AA大量+MS微量+AA有機(jī)+鐵鹽+L-Pro+CH+suger，pH 5.2)，共培養(yǎng)基(N6大量+N6微量+N6有機(jī)+鐵鹽+CH+suger+葡萄糖+phy+2,4-D，pH 5.2)，篩選培養(yǎng)基(N6大量+B5微量+B5有機(jī)+鐵鹽+L-Pro+CH+suger+ phy+2,4-D+Cef+Amp+潮霉素，pH 5.2)，預(yù)分化培養(yǎng)基(N6大量+B5微量+B5有機(jī)+鐵鹽+ L-Pro+CH+suger+phy+2,4-D+6-BA+NAA+ABA+潮霉素，pH5.2)，分化培養(yǎng)基(N6大量+B5微量+B5有機(jī)+鐵鹽+L-Pro+CH+suger+ phy+2,4-D+6-BA+NAA+IAA+KT+潮霉素，pH 5.2)，YM培養(yǎng)基(微生物培養(yǎng)基，0.15 g/L KH2PO4+10 g/L甘露醇+Glu+NaCl+MgSO4+Yeast extract)，LB液體培養(yǎng)基(含75mg/L Kan+50mg/L Rif)。所有培養(yǎng)基均在HVE-50高壓滅菌鍋113℃滅菌20 min。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體滅菌處理將粳型恢復(fù)系C418水稻籽粒用礱谷機(jī)去除外殼，選取具完整胚的籽粒作為外植體，放入已滅菌的250 mL錐形瓶中，在超凈工作臺(tái)進(jìn)行外植體滅菌。先用75%酒精消毒1 min，無菌去離子水沖洗1遍；再分別用1.5%和2.5%次氯酸鈉處理20 min，期間3～5 min搖動(dòng)1次或封口放恒溫振蕩培養(yǎng)箱(100 r/min)。外植體用無菌去離子水沖洗5～7遍，封口前和解封后將錐形瓶瓶口在酒精燈外焰下滅菌，確保外植體滅菌過程無污染。最后將處理好的水稻成熟胚(外植體)置于已滅菌帶濾紙的培養(yǎng)皿，干燥后進(jìn)行后續(xù)接種。

1.2.2成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)接種前用75%的乙醇溶液對(duì)臺(tái)面及所需器具消毒，將消毒好的器具在酒精燈外焰下烘干。用鑷子挑取已滅菌外植體接種于不同培養(yǎng)基(7種基礎(chǔ)培養(yǎng)基)分別添加不同濃度2,4-D(1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每皿接種水稻成熟胚為25～30粒，5次重復(fù)。接種結(jié)束封口，置于相對(duì)濕度60%、溫度(28±1)℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)10～14 d。記錄出愈數(shù)及愈傷生長(zhǎng)狀況，計(jì)算愈傷誘導(dǎo)率。

1.2.3水稻愈傷組織的繼代將愈傷組織用已滅菌的鑷子挑出接種于繼代培養(yǎng)基(N6+2 mg/L 2,4-D，pH 5.8)，置于相對(duì)濕度60%、溫度(28±1)℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)10 d。

1.2.4水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化

1) 農(nóng)桿菌懸浮液的制備。參照吳仙花[5]的方法，將農(nóng)桿菌菌株pCAMBIA130劃線于農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(YM培養(yǎng)基+LB培養(yǎng)基)平板上，28℃培育2 d。選擇適度大小的白色單菌落，用已滅菌的槍頭挑菌，接種于10 mL YM液體培養(yǎng)基中，在28℃、250 r/min振蕩培育至OD600值0.5。然后吸取培養(yǎng)液1 mL接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600最佳值0.8(OD600值不可超過1.0)。搖菌后，準(zhǔn)備2個(gè)已滅菌的50 mL離心管，倒入30 mL LB液體培養(yǎng)基，室溫下4 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，加1 mL LB液體培養(yǎng)基于離心管中，用空槍吹懸浮沉淀的菌體，沖洗細(xì)菌。移入50 mL離心管中，再加30 mL LB液體培養(yǎng)基，室溫下4 000 r/min離心15 min，去掉上清液。最后加入終濃度為100 μM的As(乙酰丁香酮)，用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌體直至OD600值為0.4左右，獲得農(nóng)桿菌懸浮液。

2) 水稻愈傷組織的共培養(yǎng)。將經(jīng)繼代培養(yǎng)的愈傷組織(直徑保持0.5 cm左右)放入農(nóng)桿菌懸浮液中，搖床搖30 min，倒掉液體。將愈傷組織置于已滅菌帶濾紙的培養(yǎng)皿，干燥后接種于共培養(yǎng)基，暗培育2～3 d。

3) 抗性愈傷組織篩選。將共培養(yǎng)后的水稻愈傷組織收集于已滅菌的250 mL錐形瓶，用無菌水洗8～10遍。瓶中留100 mL無菌水，加入2 mL 500 mg/L頭孢霉素，100 r/min振蕩30 min。倒掉無菌水，將愈傷組織置于已滅菌帶濾紙培的培養(yǎng)皿，無菌工作臺(tái)靜置1～2 h，待愈傷組織表面水分完全蒸發(fā)后接種于含50 mg/L氨芐霉素與50 mg/L潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，(28±1)℃暗培養(yǎng)3周。

4) 愈傷組織的分化、生根及移植。將所得的抗性愈傷組織接種于預(yù)分化培養(yǎng)基上，置于相對(duì)濕度60%、溫度(25±1)℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3周，接種于分化培養(yǎng)基上(光照16 h/d，光強(qiáng)為2 000 lx)，待再生苗長(zhǎng)至5 cm左右轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基。當(dāng)再生苗根系強(qiáng)健時(shí)將其移栽到含有N、P、K營(yíng)養(yǎng)成分的盆中，置于溫室培養(yǎng)至植株成熟。

1.2.5相關(guān)指標(biāo)計(jì)算愈傷誘導(dǎo)率=(長(zhǎng)愈傷的成熟胚數(shù)/接種成熟胚數(shù))×100%，愈傷分化率=(出小苗的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù))×100%，外植體污染率=(被污染成熟胚數(shù)/接種成熟胚數(shù))×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1次氯酸鈉濃度對(duì)外植體污染率的影響

不同濃度次氯酸鈉對(duì)水稻成熟胚外植體的滅菌效果存在差異。2.5%次氯酸鈉處理的外植體，其污染率為11.55%，而1.5%次氯酸鈉處理外植體的污染率為24.68%。說明，高濃度次氯酸鈉對(duì)外植體的滅菌效果優(yōu)于低濃度。

2.2培養(yǎng)基與2,4-D濃度對(duì)水稻愈傷誘導(dǎo)的影響

2.2.1培養(yǎng)基單因素影響NBD、MSN和N6愈傷誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率分別為81.07%、72.70%和69.67%，三者間差異不顯著；NMB、MS愈傷誘導(dǎo)效果一般，誘導(dǎo)率分別為66.87%和66.40%，顯著低于NBD、MSN和N6；NB 和MB愈傷誘導(dǎo)效果最差，誘導(dǎo)率分別為58.40%和50.13%，顯著低于其余培養(yǎng)基。

2.2.22,4-D濃度單因素影響2,4-D濃度為2 mg/L和3 mg/L的愈傷誘導(dǎo)率分別為76.73%和69.06%，二者間誘導(dǎo)率差異不顯著；2,4-D濃為度1 mg/L的愈傷誘導(dǎo)效果效果較差，誘導(dǎo)率為53.69%，顯著低于濃度為2 mg/L和3 mg/L的處理。

2.2.3培養(yǎng)基與2,4-D濃度互作影響方差分析表明，不同培養(yǎng)基+不同濃度2,4-D對(duì)外植體愈傷誘導(dǎo)效果不同，兩者的互作效應(yīng)達(dá)顯著水平。NBD培養(yǎng)基+3 mg/L 2,4-D處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)90.38%，且愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。

2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷組織轉(zhuǎn)化效果

繼代培養(yǎng)所得的優(yōu)良愈傷組織經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化表明，共培養(yǎng)2 d時(shí)獲得的抗性愈傷組織最多(圖1)，愈傷組織轉(zhuǎn)化率達(dá)80.76%；共培養(yǎng)3 d時(shí)，多數(shù)愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，逐漸褐化死亡，僅少數(shù)愈傷組織可以獲得抗性愈傷組織，愈傷組織轉(zhuǎn)化率為42.31%。

注：a愈傷組織在共培養(yǎng)基；b、c為抗性愈傷在篩選培養(yǎng)基(b為共培養(yǎng)2 d；c為共培養(yǎng)3 d)

Note: a, calli cultured on co-medium; b and c, resistant calli on screening medium for 2 d and 3 d respectively

圖 1水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化

Fig.1 Transformation of rice calli

2.4抗性愈傷分化效果

在篩選培養(yǎng)基中使用1 000 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L潮霉素時(shí)，抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，愈傷組織分化率為53.78%，而500 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L氨芐霉素+50.0 mg/L潮霉素愈傷組織分化率為71.25%。即較高濃度頭孢霉素抑制水稻愈傷組織的分化，通過降低頭孢霉素濃度并添加適宜濃度氨芐霉素，可明顯提高愈傷組織分化率。

3結(jié)論與討論

3.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其生長(zhǎng)素2,4-D濃度的選擇

研究表明，在相同培養(yǎng)環(huán)境下，NBD誘導(dǎo)培養(yǎng)基的水稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)90.38%；MSN和NMB愈傷組織誘導(dǎo)率較好，誘導(dǎo)率分別為88.01%和84.98%；N6和MS培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)效果一般，誘導(dǎo)率分別為72.88%和64.42%；NB 和MB愈傷誘導(dǎo)效果最差，誘導(dǎo)率分別為43.91%和38.80%。劉國(guó)寶等[6]采用NMB和MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)水稻成熟胚表明，NMB培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率高于MS培養(yǎng)基，且愈傷組織質(zhì)量?jī)?yōu)于MS培養(yǎng)基，與該研究結(jié)論不一致，可能與不同水稻品種的外植體有關(guān)。在不同濃度激素條件下，2 mg/L 2,4-D濃度水稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為76.73%，3 mg/L 2,4-D和1 mg/L 2,4-D的誘導(dǎo)率分別為69.06%和53.69%。不同培養(yǎng)基和不同濃度激素配比對(duì)水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)均存在影響[3]，培養(yǎng)基與2,4-D濃度存在顯著的互作效應(yīng)，其中以NBD培養(yǎng)基添加3 mg/L 2,4-D處理的粳稻C418成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)90.38%，且愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。

3.2水稻愈傷組織轉(zhuǎn)化和分化條件的優(yōu)化

KAWATA等[7-8]研究顯示，水稻成熟胚外植體愈傷組織共培養(yǎng)2 d時(shí)獲得的抗性愈傷組織最多，之后隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)多數(shù)愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，并逐漸褐化死亡。粳稻C418成熟胚外植體愈傷組織共培養(yǎng)2 d時(shí)獲得的抗性愈傷組織最多，共培養(yǎng)3 d時(shí)接種于篩選培養(yǎng)基中的多數(shù)愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，并逐漸褐化死亡，僅少數(shù)愈傷組織可以得到抗性愈傷，與前人的研究結(jié)果一致。NISHI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在接種篩選培養(yǎng)基之前，干燥處理可抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)和繁殖，提高抗性愈傷組織的獲得率；同時(shí)，抗生素添加類別對(duì)水稻愈傷組織的分化具有較大影響。在篩選培養(yǎng)基中使用1 000 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L潮霉素時(shí)，抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，粳型恢復(fù)系C418成熟胚愈傷組織的分化率明顯低于500 mg/L頭孢霉素+50.0 mg/L氨芐霉素+50.0 mg/L潮霉素處理，說明，較高濃度頭孢霉素抑制水稻愈傷組織的分化。通過降低頭孢霉素濃度并添加適宜濃度氨芐霉素，可明顯提高愈傷組織分化率，結(jié)論與前人研究基本一致。

3.3建立粳型恢復(fù)系C418轉(zhuǎn)基因再生體系

通過培養(yǎng)基類型、激素濃度、共培養(yǎng)時(shí)間及抗生素種類的最佳組合，成功建立北方骨干粳型恢復(fù)系C418轉(zhuǎn)基因再生體系,即水稻外植體經(jīng)次氯酸鈉處理后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基NBD+3 mg/L 2,4-D，獲得愈傷組織，再用農(nóng)桿菌懸浮液(含目的基因)侵染愈傷組織，初步獲得轉(zhuǎn)基因植株。