PIKK調控DNA雙鏈斷裂修復的研究進展*

姚德山，張振剛，龔開政

（揚州大學附屬醫(yī)院，江蘇揚州225001）

生物體細胞基因組完整性受到諸多因素的威脅，包括DNA復制過程中DNA堿基錯配、化學物質產生的堿基加合物（adduct formation）和交叉鏈（cross-links）、紫外線誘導的堿基損傷、電離輻射導致的DNA單鏈或雙鏈斷裂等。DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）被認為是細胞毒性最強的DNA損傷。為了維持生物體各種生理性分子生物學穩(wěn)態(tài)，并將基因組信息完整精確的傳遞給子代，生物體進化出精密的DNA損傷修復途徑，統(tǒng)稱為DNA損傷反應（DNA damage response，DDR），大多數(shù)情況下可以正確的修復這些損傷［1］。目前已知的DDR過程中，首先由磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）相關激酶（PI3K-related kinase，PIKK）蛋白家族的3個成員——DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）、ATM（ataxia-telangiectasia mutated）、ATR （ATM and RAD3-related）識別DNA損傷，通過激活細胞周期檢查點減緩或阻滯細胞周期以保證細胞有足夠的時間進行DNA損傷修復，并且啟動細胞信號級聯(lián)促進DNA修復。值得注意的是，許多損傷DNA進行復制時遇到DNA復制叉，損傷將更加嚴重，需要額外的DDR來修復才能使基因組精確復制傳遞給子代。而在多細胞生物中，為了防止?jié)撛谕蛔兗毎脑鲋?，具有廣泛DNA損傷的細胞會退出細胞周期，停止增殖或進入凋亡程序，從而減少腫瘤和年齡相關性疾病的發(fā)生。

1 DNA-PK、ATM和ATR的相似性

1.1 結構相似性 ATM、ATR和DNA-PK都是大分子多肽鏈，具有相似的結構域和結構特征。它們的激酶結構域都定位在多肽鏈的C末端，上游連接一段FRAP-ATM-TRRAP（FAT）結構域，下游連接一段PIKK調節(jié)結構域（PIKK regulatory domain，PRD）和FAT C末端（FAT C-terminal，F(xiàn)ATC）模體［2］。在FAT結構域的N端，3種PIKKs形成不同長度的巨大的螺線管形的HEAT-repeat結構域，調節(jié)蛋白質之間的相互作用［3］。

1.2 功能相似性 在ATM、ATR和DNA-PK的多肽鏈中具有相似的S/T-Q模體，這3種PIKKs都可以發(fā)生自身磷酸化。目前已證實DNA-PK具有多個自身磷酸化位點，大多都聚集在HEAT-repeat結構域［4］。在人類細胞中，DNA-PK的自身磷酸化位點S2056和T2609特異性用來評價其激酶活性。雖然DNA-PK激酶的活化并不需要S2056和T2609，但是最近的研究表明這2個自身磷酸化位點的激活可以引起DNAPK構象的改變，促進其從DSB位點脫離，從而使DNA末端連接，促進DNA損傷修復［4］；第3個已知的自身磷酸化位點是T3950，當DNA-PK完成磷酸化功能后，T3950位點磷酸化可以滅活DNA-PK的激酶活性［5］。而對于ATM和ATR的自身磷酸化位點目前有很大的爭議。之前S1981位點被認為是ATM的自身磷酸化位點，在機體發(fā)生DDR時，該位點的磷酸化可以使ATM從不活躍的二聚體轉型成為活躍的單體而參與反應［6］，但最近研究認為S1981位點并不參與ATM的活化［7］，因此關于S1981位點的功能及其他ATM自身磷酸化位點的研究仍然有待進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)T1989是ATR的自身磷酸化位點［8］，但T1989是否在ATR的功能中起主要作用仍然存在爭議。

正常細胞內，PIKKs受到嚴格監(jiān)管調控，防止其異常激活導致毒性DNA修復、細胞周期停滯、衰老或凋亡。發(fā)生DNA損傷時，為確保這些激酶被準確穩(wěn)定地募集到損傷位點，每種激酶都需要一種輔助因子協(xié)助，形成ATM-Nijmegen斷裂綜合征蛋白1（Nijmegen breakage syndrome protein 1，NBS1）［9］、ATR-ATR相互作用蛋白（ATR-interacting protein，ATRIP）［10］和DNA-PK-Ku80［11］。雖然每種激酶的輔助因子都不相同，但NBS1、ATRIP和Ku80都具有相似的C末端模體，與PIKKs上的HEAT-repeat結構域相互作用［9］，確保每種激酶可以被穩(wěn)定地募集到損傷位點。

2 ATM——細胞內DSB反應調節(jié)器

2.1 ATM在DSB中作用機制 當細胞內發(fā)生DNA雙鏈斷裂時，首先激活ATM，使多種底物蛋白磷酸化啟動細胞內修復機制，包括細胞周期檢查點活化、DNA修復、凋亡、衰老、染色質結構改變等［12］。ATM也可以通過磷酸化激活其他蛋白激酶使更多的底物磷酸化，如ATM可以使細胞周期檢查點激酶2（checkpoint kinase 2，CHK2）的T68位點磷酸化而激活這條信號通路［13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)，敲減胸腺細胞中CHK2基因表達后，細胞對紫外線誘導的細胞凋亡抗性明顯增強；外源性轉入野生型CHK2基因可以恢復細胞對紫外線的敏感性，細胞凋亡增加；當外源性轉入依賴ATM/ATR的CHK2磷酸化位點突變的基因后，細胞對紫外線的敏感性不能恢復，損傷的DNA不能被識別，導致腫瘤的發(fā)生［9］。

發(fā)生DSB時，活化的ATM通過與染色體上的MRE11-RAD50-NBS1（MRN）復合物中NBS1的C末端結合，被募集到DNA損傷位點［15］。研究發(fā)現(xiàn)，在體外MRN復合物可以直接激活ATM激酶活性，參與ATM信號傳遞［16］。因此我們可以認為MRN復合物既可以募集ATM到DNA損傷位點，又可以在該位點激活ATM激酶活性。但是MRN激活ATM的具體機制目前仍不清楚。

ATM主要參與同源重組（homologous recombination，HR）修復過程。發(fā)生DSB后，MRN復合物被迅速募集到損傷DNA位點，啟動DNA末端切除，形成不穩(wěn)定的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），不穩(wěn)定的ssDNA迅速與復制蛋白A（replication protein A，RPA）結合，穩(wěn)定ssDNA片段。在BRCA2-DSS1復合物輔助下募集重組酶RAD51與RPA-ssDNA結合，在重組酶RAD51的幫助下進行同源搜尋，然后侵入同源染色體，以此為模板加工產生位移環(huán)（displacement loop，D-loop）重組中間體，以侵入鏈的3′端作為引物，通過增殖細胞核抗原鉗位和DNA聚合酶延伸D-loop，直到DSB的另外一端［17］。

DNA末端切除是DSB選擇HR修復方式的關鍵。而與MRN相互作用的蛋白CtIP是這個過程啟動的關鍵因素，ATM通過直接磷酸化CtIP蛋白而啟動DNA末端切除［18］。當斷裂DNA處形成折疊復制叉時，ATM介導的CtIP磷酸化可以及時將輔助因子Ku從DSB末端切除，使D-loop繼續(xù)延伸，從而使HR的后續(xù)階段繼續(xù)進行［19］。雖然如此，但是ATM對HR并不是不可缺少的，HR在其缺乏的情況下也可以進行。

2.2 ATM啟動并維持基于染色質的DDR信號傳遞 活化的ATM使組蛋白H2AX的C末端S139位點磷酸化形成γH2AX，啟動基于染色質的信號傳遞修飾，包括磷酸化、泛素化和其他轉錄后修飾［20］。MDC1（mediator of DNA damage checkpoint 1）可以特異性識別γH2AX，通過C末端兩個串聯(lián)的BRCT（BRCA1 C-terminal）結構域特異性的使γH2AX結合到DSB位點［21］。ATM可以使MDC1的T4位點磷酸化，使MDC1穩(wěn)定結合在染色質上［22］。CHK2可以使MDC1的S964位點磷酸化，通過與NBS1上FHA（forkhead-associated）-BRCT結構域識別，促進MDC1-MRN保留在染色質上，使γH2AX持續(xù)聚集在損傷位點［23］。MDC1通過與MRN上NBS1結合被募集到損傷位點，MRN又可以募集更多的ATM，使更多的γH2AX聚集在損傷位點，形成MDC1-MRN-ATM循環(huán)，使DSB的信號沿染色質擴散，增強DDR信號傳遞。

在DSB位點，ATM使MDC1上T-Q-X-F模體發(fā)生磷酸化，而這個位點可以被FHA結構域上的泛素連接酶RNF8識別，因此可以促進RNF8聚集到損傷位點［24-25］。在泛素結合酶UBC13的作用下，RNF8使連接組蛋白H1發(fā)生泛素化修飾，泛素化修飾的組蛋白H1可以被另外一種泛素連接酶RNF168識別［26］。RNF168可以使組蛋白H2A的K15位點發(fā)生泛素化修飾形成H2AK15Ub，而DDR因子p53結合蛋白1（p53 binding protein 1，53BP1）借助其泛素化依賴的招募識別序列與H2AK15Ub結合，使機體選擇非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）進行DSB修復［27］。ATM可以使53BP1的N端不同位點發(fā)生磷酸化，募集更多的蛋白質，如PTIP和RIF1，形成包含PTIP、RIF1、REV7/MAD2L2等分子的53BP1復合物，促進機體選擇NHEJ進行DSB修復，但是具體的機制仍不清楚［28］。而53BP1也能誘導ATM信號下游分子CHK2的T68位點磷酸化激活DDR信號通路。

乳腺癌1型易感蛋白（breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1）由乳腺癌和卵巢癌抑癌基因編碼，可以抑制53BP1的某些功能。發(fā)生DNA損傷時，ATM可以使BRCA1多個位點發(fā)生磷酸化，ATM突變會導致乳腺癌的發(fā)生［29］。BRCA1通過組成不同的蛋白復合物參與維持基因組穩(wěn)定的不同過程，但是它主要的功能是在53BP1調節(jié)NHEJ功能缺失時促進同源重組修復［30］。但是53BP1和BRCA1在機體中維持基因組穩(wěn)定過程中功能相互拮抗，而ATM如何調控這些過程及之后的細胞周期調控目前仍不清楚。

3 ATR與DNA復制應激

3.1 ATR調節(jié)細胞周期信號 ATR是DNA復制應激反應信號通路的頂端激酶，可以使多種底物蛋白磷酸化，參與損傷修復。但是與ATM和DNA-PK不同，ATR在正常的細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，這就阻礙了ATR在癌癥治療中的開發(fā)研究。正常細胞具有完整的G1和S/G2細胞周期檢查點，細胞受到遺傳毒性刺激后，通過ATM激活G1和S/G2細胞周期檢查點［31］。而 ATR/細胞周期檢查點激酶 1（checkpoint kinase 1，CHK1）可以獨立激活 P38，活化的 P38與CHK1聯(lián)合防止復制叉失速后的進一步分裂［32］。但是腫瘤細胞缺乏依賴ATM/P53的G1細胞周期檢查點的激活，僅能依賴ATR/CHK激活的S/G2細胞周期檢查點修復DNA損傷［31］。因此，抑制腫瘤細胞中ATR表達可以加重腫瘤細胞基因毒性損傷和致死性分裂的累積，而具有功能性G1細胞周期檢查點的正常細胞可以不受基因毒性的影響。

在細胞周期中，ATR可以激活CHK1，磷酸化的CHK1促進CDC25A蛋白酶體降解。而CDC25A的主要功能是解除細胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的抑制性修飾，使細胞周期正常運行［33］。當發(fā)生遺傳毒性應激時，ATR激活CHK1，使CDC25A蛋白酶體降解，減弱CDK的活性，減緩或阻止細胞周期進展，使細胞有充足的時間進行DNA修復，不會過早進入有絲分裂；若損傷嚴重，可以激活細胞衰老或凋亡途徑。因此ATR-CHK1-CDC25A通路對細胞存活至關重要［34］。

除了防止細胞過早進入有絲分裂，ATR可以通過多種機制參與調節(jié)DNA復制體的穩(wěn)定性。首先，ATR通過抑制CDK活性，抑制復制起點啟動，有效避免修復因子的過度消耗，尤其是RPA［35］；其次，SMARCAL1參與形成的復制叉可以被SLX4/MUS81核酸酶復合物識別切割，破壞復制叉的穩(wěn)定，而ATR可以直接靶向SMARCAL1，限制它的螺旋酶的活性，防止復制叉的破壞［36］；再者，發(fā)生DNA損傷后，ATR通過上調核糖核苷酸還原酶亞基RRM2的表達，調節(jié)哺乳動物細胞脫氧核糖核苷酸的可利用性［37］。

3.2 ATR的活化機制 ATM和DNA-PK是由DSB激活，但是細胞中只要發(fā)生遺傳毒性應激就可以激活ATR。這是因為損傷DNA的各種核溶解產物和未結合在停滯復制叉上的解旋酶-聚合酶都可以產生大量的RPA，RPA包裹ssDNA形成RPA-ssDNA復合物，使ssDNA趨于穩(wěn)定［38］。而ATR通過與其伴侶蛋白ATRIP結合，可以延伸RPA包裹ssDNA，促進修復過程［10］。

僅靠RPA-ssDNA募集ATR并不能完全激活ATR的激酶活性，還需要輔助因子和ssDNA-雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）連接結構輔助。DNA拓撲異構酶結合蛋白1（DNA topoisomerasebinding protein 1，TopBP1）是最主要的輔助因子，通過與ATRIP及ATR上PRD結構域的C端連接，特異性激活ATR激酶活性［39］。與ATR功能相似，在哺乳動物細胞中，TopBP1缺失或其激活ATR激酶活性的結構域突變時都是致死性的［40］。TopBP1可以與環(huán)狀三聚體RAD9-RAD1-HUS1（9-1-1）復合物上RAD9亞基C末端結合，該復合物通過與RAD17-RFC結合定位到RPA-ssDNA/dsDNA連接處［10］。與此相似，MRN和BLM也參與 TopBP1的募集［41］。因此，TopBP1被募集到DNA損傷位點的機制是復雜的，在細胞周期不同階段需要大量不同的蛋白直接相互作用。

ETAA1是新近發(fā)現(xiàn)的另一種ATR激活蛋白，它含有與TopBP1相似的ATR激活結構域［42］。與TopBP1不同的是，ETAA1可以直接與RPA結合，被募集到RPA-ssDNA處，激活ATR。因此可以推測，TopBP1和ETAA1可以被募集到不同類型的損傷DNA位點，激活ATR激酶活性。

4 DNA-PK啟動NHEJ促進DNA損傷修復

在哺乳動物細胞中，DNA雙鏈斷裂損傷主要通過NHEJ進行修復，只有遇到DNA復制叉時才優(yōu)先選擇HR修復。在淋巴系統(tǒng)發(fā)育過程中，免疫球蛋白和T細胞受體位點會發(fā)生DSB，以便于產生免疫受體多樣性，這些DSB數(shù)量多，因此選擇修復效率高的NHEJ進行修復［43］。NHEJ進行損傷 DNA修復時不需要模板，所以被認為錯誤率高，易導致突變，但實際上NHEJ也是一種精確且高效的修復方式［44］。

當發(fā)生DSB時，DNA-PK在Ku80的輔助下被募集到DSB處，啟動并促進非同源末端連接［4］。但是DNA-PK是通過自身磷酸化參與NHEJ過程，還是通過使其他蛋白質發(fā)生磷酸化激活信號通路，目前仍不確定。有研究發(fā)現(xiàn)抑制DNA-PK活性雖然并不能阻止其下游分子如LIG4的募集，但是會阻斷損傷DNA末端的連接［45］。

5 ATM、ATR和DNA-PK之間的聯(lián)系

DNA損傷誘導的G1/S、S期和G2/M的檢查點信號相似，這3個檢查點的目的都是抑制CDK的活性，延緩或阻止細胞周期進行。而DSB在G1期沒有被切除，不會產生大量的RPA-ssDNA，不能被ATR激活，因此認為G1/S檢查點主要由ATM調控；而S期、G2/M期，ATM可以切除DNA末端，形成RPA-ssDNA復合物，募集激活ATR［46］。這種依賴ATM的ATR的激活是PIKK家族成員之間功能相輔相成的一個重要例子。之前討論到ATM和ATR可以激活DNA-PK，參與DNA損傷修復，最近研究表明DNA-PK是非同源末端連接途徑的組成部分，通過ATM的磷酸化負性調節(jié)ATM的活性［47］。

6 小分子抑制劑

在腫瘤發(fā)生早期，致癌基因誘導的復制應激或端?？s短等DNA損傷可以激活DDR，表明PIKK信號激活導致的細胞周期停滯或細胞死亡可以作為腫瘤發(fā)生的屏障［48］。人ATM基因突變導致基因組不穩(wěn)定，細胞逃避正常的凋亡程序，腫瘤的發(fā)生率明顯增加［49］。腫瘤細胞具有迅速無限增殖、基因組不穩(wěn)定的特性，更加容易受到復制應激、外源性DNA損傷的影響，這很大程度上解釋了放射治療和各種DNA損傷化療對腫瘤治療的療效，并解釋了新出現(xiàn)的DDR酶抑制劑的抗腫瘤特性［50］。目前已有多種小分子抑制劑作用于PIKK家族成員，并已作為單藥或與放療/化療聯(lián)合進行Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗［51］。ATR是一個理想的抗癌治療靶標，因為癌細胞復制頻率高，更加依賴ATR的激酶活性促進癌細胞存活，這為ATR抑制劑在多種類型的癌癥中的應用提供了理論依據(jù)，也解釋了ATR本身雖然能夠維持基因組穩(wěn)定性，但并不是一個強的腫瘤抑制劑，不能抑制癌細胞的生存［52］。許多腫瘤基因組不穩(wěn)定是由某些DNA修復途徑（如HR）缺陷引起的，這為抗腫瘤治療提供了一個新的思路。當細胞中某條信號通路被阻斷，細胞就會更加依賴另一個信號通路。在HR功能缺陷的腫瘤細胞中，腫瘤細胞對多腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制劑的敏感性明顯增加［53］。值得注意的是，當ATM和其他DDR因子缺失時，腫瘤細胞對PARP抑制劑的敏感性明顯增加［54］。

7 展望

雖然發(fā)現(xiàn)ATM、ATR和DNA-PK已有20多年，我們對他們的認識有了長足的長進，但是仍然有許多問題并不清楚，其中最關鍵的是對DDR-PIKK的精密結構仍不清楚。新興技術，如超分辨率顯微鏡、低溫電子顯微鏡、CRISPR-Cas9和高通量測序等，無疑將幫助我們解決這些問題。隨著PIKK抑制劑的發(fā)現(xiàn)，我們將進一步的了解正常細胞和患病細胞中PIKK的功能，從而尋找更好的方法治療癌癥、基因組不穩(wěn)定或PIKK功能異常的疾病。