細(xì)胞自噬在急性肺損傷發(fā)展進(jìn)程中的雙刃劍作用*

張 紅，趙自剛△，牛春雨，2△

（1河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，河北張家口075000；2河北醫(yī)科大學(xué)，河北石家莊050000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急危重癥患者常見的一種器官損傷，肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡是ALI的基礎(chǔ)，明確細(xì)胞死亡的發(fā)生機(jī)制將為防治ALI提供重要的理論支撐［1］。細(xì)胞自噬（autophagy）是細(xì)胞代謝過程中的衰老細(xì)胞器和異常蛋白質(zhì)等成分降解的過程，受多條信號通路與多種信號分子的調(diào)節(jié)，有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；病理狀態(tài)下，自噬被激活或抑制，從而在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著保護(hù)和損害的雙重作用；調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬對于相關(guān)疾病或病理過程的防治有積極作用［2］。研究顯示，多種原因?qū)е路谓M織細(xì)胞的過低自噬、自噬不足和過度自噬均可引起或加重肺損傷，將細(xì)胞自噬恢復(fù)至正常范圍內(nèi)的治療措施能夠減輕ALI?？梢?，細(xì)胞自噬在ALI的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了雙刃劍作用，以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬為靶點(diǎn)的一系列治療措施，取得了防治ALI的新進(jìn)展。本文對細(xì)胞自噬在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、膿毒癥（sepsis）、病原體感染以及非感染性因素引起的ALI發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行了總結(jié)，可更好地為尋找以恢復(fù)細(xì)胞自噬正?；癁榉较虻腁LI防治策略提供新思路。

1 細(xì)胞自噬在LPS引起的ALI中的作用

革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁成分LPS可激活固有免疫系統(tǒng)，引起炎癥瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)失控，發(fā)生ALI。由于LPS攻擊模型方法比較簡單，且與臨床發(fā)病過程相似，故LPS常用于ALI動物或細(xì)胞模型的制備。

1.1 細(xì)胞自噬不足參與LPS引起的ALI 研究顯示，在腹腔注射LPS引起小鼠ALI的同時，增加了肺組織細(xì)胞自噬；自噬相關(guān)基因4b（autophagy-related gene 4b，ATG4b）缺陷小鼠肺組織細(xì)胞自噬明顯減少，轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）活性增加，機(jī)體對LPS介導(dǎo)ALI的易感性增加［3］；具有抗炎、抗腫瘤作用的京尼平（genipin），在減輕LPS所致ALI的同時，降低了肺組織的炎癥因子水平和細(xì)胞凋亡數(shù)量，增加了A549細(xì)胞自噬與相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)；自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）無論是作用于LPS處理的大鼠還是A549細(xì)胞，在抑制細(xì)胞自噬的同時，也顯著抑制了京尼平減輕炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡的作用，加重了ALI［4］。這些結(jié)果提示在LPS攻擊后，盡管細(xì)胞自噬在一定程度上有所增加，但依然引起了ALI；在此基礎(chǔ)上，適當(dāng)增加細(xì)胞自噬可減輕ALI，降低細(xì)胞自噬則加重ALI，說明LPS攻擊后，自噬不足是LPS引起ALI的發(fā)病機(jī)制之一。

過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic-reticulum stress，ERS）參與了細(xì)胞損傷過程。研究顯示，在氣管內(nèi)滴注LPS引起小鼠ALI的同時，ERS及自噬均被激活；ERS抑制劑 4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）降低了小鼠肺組織和A549細(xì)胞ERS和自噬水平，小鼠ALI減輕，A549細(xì)胞活力增強(qiáng)；單獨(dú)使用3-MA作用于LPS攻擊的A549細(xì)胞，ERS增加，自噬水平降低，細(xì)胞活力減弱，這表明LPS攻擊后，適度自噬有利于減輕肺損傷，而當(dāng)自噬降低到一定水平時反而會加重ALI，且ERS可激活自噬，自噬水平過低也會激活 ERS［5］。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種重要的代謝調(diào)節(jié)因子，有利于維持能量平衡。研究顯示，腹腔注射LPS引起ALI的同時，肺組織細(xì)胞自噬微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II（microtubule-associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II）蛋白表達(dá)水平降低，p62水平增高，自噬受抑制，p-AMPK和p-乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）減少；使用 AMPK激活劑 A-769662后，LPS攻擊小鼠的肺組織中p-AMPK、p-ACC和LC3-II表達(dá)均顯著增高，炎癥因子表達(dá)降低，ALI顯著減輕，存活率提高；3-MA降低LC3-II表達(dá)，增加p62與炎癥因子表達(dá)，肺損傷明顯加重，且逆轉(zhuǎn)了A-769662的治療作用。上述結(jié)果表明LPS攻擊通過抑制AMPK-ACC信號通路降低自噬水平，增加炎癥因子表達(dá)，造成肺損傷，而激活A(yù)MPK后，自噬增加，炎癥反應(yīng)與肺損傷減輕［6］。

報道顯示，LPS通過Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）介導(dǎo)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活化來抑制支氣管或肺泡上皮細(xì)胞自噬。LPS刺激小鼠肺上皮細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞后，LC3B-II表達(dá)降低，pmTOR和核糖體蛋白質(zhì)S6表達(dá)增高，24 h到達(dá)峰值；敲減TLR4基因表達(dá)后，這種現(xiàn)象完全相反；敲減mTOR基因表達(dá)后，LC3-II蛋白的表達(dá)顯著增加，炎癥因子的表達(dá)減少；敲減ATG5基因表達(dá)后，炎癥因子mRNA的表達(dá)水平明顯增高。這表明mTOR在TLR4信號通路介導(dǎo)下磷酸化，抑制自噬，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。此外，敲減mTOR基因表達(dá)后，小鼠氣道炎癥、屏障損壞及肺水腫程度均減輕，存活時間延長。這些結(jié)果提示LPS攻擊后，自噬可能由于mTOR活化而受到抑制，此時敲減mTOR基因而增加自噬有利于減輕ALI，而mTOR激活則可通過下調(diào)自噬進(jìn)而加重 LPS 誘導(dǎo)的 ALI［7］。

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是肺血管內(nèi)皮屏障的重要組成部分，是LPS增加肺微血管通透性的主要靶細(xì)胞之一。LPS刺激人PMVECs后，LC3-II和ATG7蛋白表達(dá)增高，p62蛋白表達(dá)降低，自噬通量上調(diào)，緊密連接蛋白1表達(dá)減少，細(xì)胞骨架蛋白F-肌動蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞通透性增高，細(xì)胞活力顯著降低，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放增加；LPS攻擊增加了小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥介質(zhì)水平、肺組織細(xì)胞自噬小體數(shù)量與濕干重比，引起ALI；使用ATG5siRNA、ATG7siRNA和氯喹（chloroquine，CLQ）抑制人PMVECs及小鼠自噬后，上述變化均進(jìn)一步加?。?］。這表明LPS激活自噬，但自噬不足，依然導(dǎo)致了ALI及通透性增加，此時抑制自噬加重?fù)p傷，適當(dāng)上調(diào)自噬有利于抵抗LPS引起的PMVECs損傷，維持肺微血管屏障的完整性，減輕ALI。

Rab26是一種小GTP酶，通過結(jié)合吞載體的組裝位點(diǎn)，直接導(dǎo)致吞噬泡的降解。鈣黏素5（cadherin 5，CDH5）是維持血管內(nèi)皮屏障完整性以及血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)分子。研究表明，LPS攻擊小鼠后，隨著時間延長，Rab26表達(dá)逐步減弱，p-Tyr731、p-Tyr685（p-Tyr731是細(xì)胞間黏附分子1介導(dǎo)白細(xì)胞遷移所必需的蛋白，p-Tyr685可提高血管通透性）及酪氨酸激酶SRC表達(dá)均增高，發(fā)生ALI，但CDH5無明顯變化。Rab26-/-小鼠肺組織p-Tyr731、p-Tyr685和p-Tyr416 SRC表達(dá)顯著增加，肺濕干重比和BALF中總蛋白顯著增加，ALI加重，存活率降低。人PMVECs受LPS攻擊后，上述蛋白出現(xiàn)了相同變化，且LC3-II蛋白表達(dá)明顯增加。敲減Rab26的表達(dá)、上調(diào)p-SRC及p-CDH5表達(dá)均可加劇內(nèi)皮完整性及內(nèi)皮屏障的損傷。當(dāng)Rab26-SRC通路正常時，Rab26介導(dǎo)的SRC自噬性靶向可維持屏障的完整性［9］。這表明Rab26-SRC信號通路激活的細(xì)胞自噬參與ALI的發(fā)生過程。

LPS處理也顯著促進(jìn)了巨噬細(xì)胞自噬。LPS刺激后，小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7細(xì)胞）和小鼠腹膜巨噬細(xì)胞活化的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶1α（calcium/calmodulin-dependent protein kinase 1α，CaMK1α）磷酸化AMPK，形成CaMK1α-AMPK-ATG7復(fù)合物，激動磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositiol 3-kinase，PI3K）Vps34以mTOR非依賴性的方式直接誘導(dǎo)自噬；敲減小鼠肺和支氣管免疫細(xì)胞CaMK1α基因的表達(dá)可致自噬減少，髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性降低，炎癥加重；抑制自噬及敲減PI3K Vps34基因的表達(dá)均產(chǎn)生類似效應(yīng)［10］。由此可知，CaMK1α-AMPK-ATG7信號通路介導(dǎo)的自噬顯著減弱LPS誘導(dǎo)的肺中性粒細(xì)胞炎癥，且不依賴于mTOR，直接針對PI3K Vps34而激動自噬。此外，LPS攻擊后，大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AMs）活力顯著降低，凋亡率增加，胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-8、caspase-9、多腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］、Bax、LC3-II及beclin-1表達(dá)增加，Bcl-2和p62表達(dá)降低，自噬增加；脂氧素A4受體激動劑BML-111減輕了大鼠AMs的上述表現(xiàn)，但自噬顯著上調(diào)，且肺組織炎癥因子表達(dá)和肺濕干重比降低，肺損傷減輕［11］?？梢?，LPS激活的自噬起到了一定的保護(hù)性作用，但初期自噬不足，上調(diào)自噬有利于減輕LPS引起的肺損傷，也說明脂氧素A4受體參與了LPS激活A(yù)Ms自噬的過程。

綜上所述，在LPS引起ALI的發(fā)病機(jī)制中，適度自噬是機(jī)體的一種適應(yīng)性反應(yīng)，有利于維持肺微血管內(nèi)皮屏障的完整性，減少肺水腫，對抗ALI，延長存活時間；此時，適度增加或激活自噬有利于減輕ALI，LPS增加自噬的機(jī)制與ERS、ATF3激活、TLR4活化、AMPK-ACC信號通路抑制、mTOR抑制、Rab26-SRC信號通路激活、CaMK1α-AMPK-ATG7信號通路活化、脂氧素A4受體活化等因素有關(guān)。

1.2 過度細(xì)胞自噬參與LPS引起的ALI 研究發(fā)現(xiàn)，LPS攻擊后，大鼠動脈氧分壓顯著降低，二氧化碳分壓顯著增加，肺組織出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，濕干重比增加，自噬小體數(shù)量和LC3-II表達(dá)增多，且定位于肺泡II型上皮細(xì)胞，大鼠存活率降低［12］；LPS攻擊小鼠引起了BALF中蛋白水平、肺濕干重比和通透性增加，肺組織ATG5-ATG12和LC3-II表達(dá)增多［13-14］。同時，LPS增加了肺組織MPO和鎂依賴性磷酸酶1活性以及血清炎癥因子水平，上調(diào)了肺組織p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、TLR4及NF-κB表達(dá)［12-14］。3-MA在降低自噬的同時，顯著減輕肺血管滲漏和肺組織水腫，有效降低LPS介導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)，減輕ALI［13］。飽和氫鹽水和右旋美托咪定（dexmedetomidine，DEX）均顯著減輕了ALI，使肺相關(guān)指標(biāo)恢復(fù)至正常水平，降低細(xì)胞自噬及炎癥因子水平，分別抑制了p38 MAPK活化和TLR4-NF-κB 通路活化［12，14］。這些研究表明，LPS激活肺組織細(xì)胞過度自噬，過度自噬通過增加通透性、肺組織水腫及中性粒細(xì)胞扣押造成ALI，與p38 MAPK和TLR4-NF-κB信號通路活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，降低或下調(diào)自噬的治療措施，有利于減輕ALI；這些結(jié)果也表明過度自噬是ALI的關(guān)鍵機(jī)制之一。

2 細(xì)胞自噬在膿毒癥引起的ALI中的作用

膿毒癥是多種感染因素引起的過度炎癥反應(yīng)綜合征，肺組織細(xì)胞自噬水平降低或不足、自噬小體累積，參與了膿毒癥ALI的發(fā)病過程。

2.1 細(xì)胞自噬降低參與膿毒癥后的ALI 在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation puncture，CLP）誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型中，小鼠肺組織LC3-II和ATG5水平均下調(diào)，炎癥因子表達(dá)增加，caspase-3表達(dá)增加，存活率顯著降低，BALF炎癥因子水平增加，蛋白漏出增多，出現(xiàn) ALI［15-16］；自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）或活化蛋白C刺激自噬可減輕炎癥及肺損傷，而使用自噬抑制劑巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）和CLQ，均加重了炎癥及 ALI［15］。大蒜素通過增強(qiáng)自噬來降低炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮抗氧化效應(yīng)，而3-MA幾乎完全逆轉(zhuǎn)了大蒜素減輕膿毒癥致ALI的有利作用［17］。這些研究表明，膿毒癥抑制了肺組織細(xì)胞自噬，使自噬不能發(fā)揮高效清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物的作用，引起ALI；以提高自噬水平為靶標(biāo)的治療策略，在提高肺組織細(xì)胞自噬水平的同時，發(fā)揮了減輕ALI的積極作用。

2.2 細(xì)胞自噬不足參與膿毒癥后的ALI 與前述研究不同的是，CLP后，小鼠肺組織LC3、beclin-1、溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosome-associated membrane protein-2，LAMP-2）和Rab7表達(dá)增高，且在24 h到達(dá)高峰，炎癥因子表達(dá)和肺含水量增加，肺功能降低，BALF中性粒細(xì)胞及漏出蛋白增加，MPO增加；RAPA可有效抑制肺組織損傷、中性粒細(xì)胞募集及炎癥因子釋放，進(jìn)而減輕炎癥細(xì)胞浸潤，升高PaO2/FiO2；3-MA則加重上述損傷［18］。研究顯示，CLP小鼠肺組織LC3-II蛋白表達(dá)隨時間增高，但LC3/18S、beclin-1、Rab7和LAMP-2A均是先增高后降低，在8 h到達(dá)峰值，且Rab7和LC3的共定位酸性磷酸酶活性也是先增高后降低，在8 h到達(dá)峰值；透射電鏡發(fā)現(xiàn)自噬小體逐漸累積，自噬小體-溶酶體融合延遲；使用3-MA抑制LC3-II蛋白表達(dá)和bafilomycin A1抑制Bax表達(dá)后，PARP裂解及IL-6和TNF-α水平較對照組無明顯差別；使用bafilomycin A1后，肺組織MPO、炎癥因子和濕干重比均增加，BALF中LDH增加；與野生型（wild-type，WT）CLP小鼠比較，高表達(dá)LC3的轉(zhuǎn)基因小鼠自噬小體與溶酶體融合加速，BALF中LDH降低，肺組織炎癥因子和MPO均減少，CLP后存活時間更長［19］。這些研究表明，CLP致膿毒癥小鼠ALI過程中，肺組織細(xì)胞發(fā)生了自噬，但自噬程度不足，自噬不足參與了膿毒癥后ALI的發(fā)生，增加自噬可減輕膿毒癥所致ALI、改善肺功能。

研究顯示，CLP后，肺組織蛋白激酶C相互作用蛋白1（protein interacting with C-kinase 1，PICK1）及LC3-II、p62的mRNA和蛋白水平均增加，自噬小體增多；與WT小鼠相比，PICK1-/-小鼠肺組織損傷加重，LC3-II表達(dá)降低，p62表達(dá)增加，自噬小體聚集，自噬通量減少，且PI3K-Akt-mTOR信號通路磷酸化形式表達(dá)下調(diào)，這表明PICK1基因敲除中斷了自噬過程；CLQ引起了與PICK1基因敲除相似的ALI，且PICK1基因敲除與CLQ聯(lián)用后，肺損傷更為嚴(yán)重。研究結(jié)果進(jìn)一步證明了膿毒癥小鼠肺組織中適度自噬發(fā)揮保護(hù)性作用，這種自噬與PICK1介導(dǎo)的PI3KAkt-mTOR信號通路活化有關(guān)［16］。鑒于p38 MAPK對自噬的調(diào)節(jié)作用，將其上游激酶——MAPK激酶3（MAPK kinase 3，MKK3）基因敲除后，膿毒癥小鼠的存活率和平均動脈血壓均顯著提高，肺組織中性粒細(xì)胞與AMs減少，線粒體損傷減輕，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成減少，內(nèi)皮連接改善，LC3B-II表達(dá)顯著增加，提示膿毒癥引起ALI與自噬增加的機(jī)制與MKK3表達(dá)下調(diào)有關(guān)［20］。

鑒于自噬不足參與膿毒癥引起ALI的發(fā)展進(jìn)程、適量提高自噬有利于減輕ALI，針對調(diào)節(jié)自噬防治膿毒癥的研究取得了新進(jìn)展。miR-155通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子活化酶1結(jié)合蛋白2激活自噬，進(jìn)而減輕膿毒癥肺損傷［21］。小劑量的蒽環(huán)類藥物可活化DNA損傷反應(yīng)及刺激肺內(nèi)自噬通路而提高小鼠對嚴(yán)重膿毒癥的耐受性［22］。血紅素氧合酶1通過提高膿毒癥小鼠肺組織細(xì)胞自噬水平，從而減少炎癥因子釋放、增加抗炎因子釋放，該作用是通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控實(shí)現(xiàn)的［23］。低生理劑量的一氧化碳通過提高線粒體ROS生成促進(jìn)肺上皮細(xì)胞beclin-1依賴性細(xì)胞自噬，提高膿毒癥小鼠存活率［24-25］。

上述研究表明，引起膿毒癥的諸多因素在一定程度上激活自噬，其機(jī)制與PICK1介導(dǎo)的PI3K-AktmTOR信號通路活化和MKK3表達(dá)下調(diào)有關(guān)；這種不足的自噬并沒有完全抑制ALI的發(fā)生，以提高肺組織細(xì)胞自噬水平或通量的治療措施針對膿毒癥ALI的干預(yù)發(fā)揮了積極有利的作用。

2.3 自噬小體累積參與膿毒癥后的ALI Lo等［19］發(fā)現(xiàn)，CLP后24 h內(nèi)，LC3-II在肺內(nèi)逐漸累積，24 h后LC3基因表達(dá)逐漸恢復(fù)到基線水平，但自噬小體-溶酶體融合在CLP后8～24 h逐漸減少，提示膿毒癥促進(jìn)了自噬，但肺內(nèi)自噬小體清除能力減弱；LC3轉(zhuǎn)基因小鼠CLP后，自噬小體清除能力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡減少，炎癥反應(yīng)減弱，中性粒細(xì)胞聚集減少，白蛋白滲漏及水腫均減輕，存活率增高，說明自噬小體過度累積在膿毒癥晚期發(fā)揮損害作用。研究結(jié)果表明，膿毒癥后肺LC3-II水平明顯升高，其升高是由于自噬小體-溶酶體融合延遲引起的自噬小體累積導(dǎo)致的。

可見，細(xì)胞自噬在膿毒癥引起ALI的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。適度自噬發(fā)揮一定的保護(hù)作用，自噬降低、自噬不足或自噬小體過度累積是膿毒癥致ALI的主要發(fā)生機(jī)制，增加自噬或增加自噬小體清除有利于減輕膿毒癥后的ALI。

3 細(xì)胞自噬在感染性病原體引起的ALI中的作用

3.1 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染引起的ALI 研究表明，可通過beclin-1-ATG7-ATG5途徑促進(jìn)AMs自噬小體形成，使用RAPA和干擾素γ后，細(xì)菌清除率顯著增加，敲減beclin-1的表達(dá)或用3-MA抑制自噬后，細(xì)菌清除率減少，細(xì)菌數(shù)目較單純感染PA組增加，說明抑制自噬導(dǎo)致AMs功能受損［26］。在PA誘導(dǎo)膿毒癥小鼠模型中，ATG7敲除加速了炎癥小體過度活化，肺組織損傷加重，炎癥因子表達(dá)較WT膿毒癥小鼠明顯增加，感染水平顯著增加，存活率顯著降低；同時，膿毒癥WT小鼠AMs的LC3通量顯著增加，沉默ATG7基因，增加了細(xì)胞毒性，凋亡相關(guān)蛋白caspase-1 p10表達(dá)增高，炎癥因子增加，導(dǎo)致病原體清除障礙及肺損傷加重［27］。這些研究表明，PA感染激活了細(xì)胞自噬，這種不足的細(xì)胞自噬參與了ALI的形成。

膜聯(lián)蛋白A2（annexin A2，AnxA2）在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、內(nèi)吞、胞吐及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮多種生物學(xué)作用。AnxA2-/-小鼠與WT小鼠相比，LC3-II表達(dá)降低且炎癥因子升高，細(xì)菌清除率降低，肺損傷加重，死亡率增加，說明AnxA2與PA誘導(dǎo)的自噬相關(guān)，該作用是通過Akt-mTOR-ULK1/2信號通路實(shí)現(xiàn)的［28］。PA感染宿主后，觸發(fā)宿主自噬和炎癥小體激活，TLR2啟動AMs的吞噬過程，激活Src激酶Lyn，轉(zhuǎn)而將細(xì)菌傳遞給溶酶體，通過異源吞噬而降解；使用3-MA或耗竭Lyn抑制自噬，AMs的吞噬過程及細(xì)菌清除均減少，Lyn通過異源吞噬作用將細(xì)菌傳遞到溶酶體，通過細(xì)胞骨架運(yùn)輸?shù)鞍祝鏡ab5和Rab7，極大地促進(jìn)了早期吞噬小體的形成、自噬小體的成熟和最終自噬介導(dǎo)的細(xì)菌降解。這些發(fā)現(xiàn)揭示了Lyn、TLR2和Rab可調(diào)節(jié)自噬相關(guān)的吞噬功能，增強(qiáng)殺菌活性［29］。

此外，PA引起的自噬與炎癥小體活化相互調(diào)節(jié)，協(xié)調(diào)宿主的防御機(jī)制。PA感染通過激活骨髓源性巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）的TLR4-TNF受體相關(guān)因子相互作用蛋白（TNF receptor-associated factor-interacting protein，TRIP）信號通路而觸發(fā)保護(hù)性自噬。同時，可激活NLRC4炎癥小體，導(dǎo)致caspase-1介導(dǎo)的TRIF裂解并抑制自噬，從而減少細(xì)菌清除［30］。反之，自噬可以選擇性去除BMDMs受損的線粒體（線粒體自噬）來消除NLRC4炎癥小體的活化，提高細(xì)菌清除率［31］。因此，PA感染后，自噬激活可起到清除病原體、減輕ALI的作用。自噬誘導(dǎo)和NLRC4炎癥小體活化，可能構(gòu)成PA感染后BMDMs的負(fù)反饋環(huán)，這為臨床治療PA導(dǎo)致的ALI提供了新思路。

由上述可知，PA感染所致ALI中，適度自噬對機(jī)體有保護(hù)性作用，AnxA2基因表達(dá)、TLR2活化、TLR4-TRIP信號通路活化等參與了PA感染激動自噬的過程。

3.2 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）感染引起的ALI KP感染激活了小鼠AMs自噬；ATG7-/-小鼠肺組織炎癥因子和超氧化物水平顯著升高，使該小鼠對KP的易感性增加，表明ATG7介導(dǎo)的自噬是機(jī)體抗KP感染所致ALI的主要機(jī)制之一［32］。同時，KP作用于AMs后，ATG7可直接結(jié)合磷酸化的NF-κB抑制蛋白α（phosphorylated IκBα，p-IκBα），抑制NF-κB活化，減輕炎癥反應(yīng)；ATG7-/-小鼠感染KP后肺損傷加重，干擾AMs的ATG7表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的釋放，此結(jié)果進(jìn)一步表明了ATG7有利于機(jī)體對抗肺損傷［33］。與PA引起自噬過程類似，AMs中的TLR-Lyn-或Wnt5A-Rac1-Disheveled介導(dǎo)的異源吞噬也有助于KP的降解和清除［29，34］?？梢姡贙P致ALI的過程中，自噬發(fā)揮了保護(hù)性作用，其機(jī)制與ATG7基因高表達(dá)、異源吞噬等相關(guān)。

3.3 H5N1流感病毒感染引起的ALIH5N1流感病毒感染引起人類的死亡率約為60%，主要原因是H5N1病毒引起肺泡上皮細(xì)胞及PMVECs死亡。研究報道，H5N1病毒感染引起了人和小鼠肺組織自噬小體增多，引起了小鼠24 h肺組織和人肺A549細(xì)胞株自噬標(biāo)志分子LC3-II表達(dá)增多；3-MA和Atg5siRNA在分別抑制細(xì)胞自噬的同時，提高了A549細(xì)胞的活力，減輕了小鼠肺損傷，提高了小鼠存活率；H5N1病毒感染抑制了A549細(xì)胞p-Akt、TSC2和pmTOR的蛋白水平，TSC2基因干擾抑制了LC3-II表達(dá)；研究結(jié)果表明，H5N1感染引起ALI的機(jī)制與肺組織細(xì)胞的過度自噬有關(guān)，其機(jī)制與Akt-TSC2-mTOR信號通路活化有關(guān)，使用自噬抑制劑可治療H5N1 引起的 ALI［35］。

綜上所述，細(xì)胞自噬在多種病原體感染等因素引起的ALI發(fā)生過程中發(fā)揮著錯綜復(fù)雜的作用。適度的細(xì)胞自噬可通過不同機(jī)制清除病原體和有害物質(zhì)，降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕ALI。相反，自噬過度激活或者自噬小體大量蓄積則會抑制細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞損傷，加重ALI。

4 細(xì)胞自噬在非感染性因素誘導(dǎo)的ALI中的作用

4.1 缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）引起的ALI I/R導(dǎo)致的ALI是一種急性無菌性肺損傷，是肺移植、嚴(yán)重創(chuàng)傷、肺栓塞等疾病的常見并發(fā)癥。在多種致病因素引起I/R中，肺組織細(xì)胞自噬不足或過度自噬均參與了ALI的發(fā)生過程。

4.1.1 細(xì)胞自噬不足參與I/R引起的ALI 研究發(fā)現(xiàn)，氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）引起了PMVECs緊密連接損傷和細(xì)胞死亡，CLQ預(yù)處理阻斷自噬后，進(jìn)一步加重了OGD損傷PMVECs的作用，RAPA預(yù)處理促進(jìn)自噬則減少了PMVECs死亡；同樣，抑制自噬加重了小鼠肺I/R引起的肺水腫及炎癥，而激動自噬則減輕了肺損傷［36］。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2作為自噬通路的正調(diào)節(jié)因子，激活ERK1/2可抑制mTOR從而促進(jìn)自噬、減輕肺損傷，抑制ERK1/2可增加mTOR表達(dá)進(jìn)而減輕了I/R誘導(dǎo)的自噬、加重肺損傷。整合素αvβ5具有特異性增加肺微血管通透性的作用，用特異性抗體阻斷αvβ5不僅可以減少血管滲漏，還可以提高存活率［37］。研究顯示，αvβ5阻斷抗體（αvβ5-blocking antibody，ALULA）特異性抑制αvβ5后，在促進(jìn)OGD攻擊PMVECs后自噬的基礎(chǔ)上，降低細(xì)胞通透性和凋亡率，激活caspase-3表達(dá)，這些有利作用可被ATG7siRNA消除；ALULA預(yù)處理可降低肺I/R小鼠的肺濕干重比、BALF蛋白濃度及肺水腫，減輕ALI，該作用可被CLQ預(yù)處理消除［38］。

上述研究從動物與細(xì)胞水平，證實(shí)了I/R激活了肺組織細(xì)胞自噬，發(fā)揮著一定的保護(hù)作用，其機(jī)制與ERK1/2活化和αvβ5抑制有關(guān)；但這種自噬的程度不足以抑制I/R引起的ALI，反而參與了ALI的發(fā)生，適度提高自噬水平可增強(qiáng)自噬保護(hù)性作用，減輕ALI。

4.1.2 過度細(xì)胞自噬參與I/R引起的ALI 在大鼠肺移植致I/R后，肺組織細(xì)胞自噬增加，6 h時到達(dá)高峰；3-MA可減少細(xì)胞自噬與凋亡，RAPA可激活自噬并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和肺損傷［39］；在肢體I/R導(dǎo)致大鼠ALI過程中，肺組織細(xì)胞自噬增加，肺組織ATG5、LC3-I、LC3-II及beclin-1表達(dá)均增高［40］。這些研究說明，過度細(xì)胞自噬參與了I/R引起ALI的發(fā)病過程。

在小型豬肺I/R模型中，早期階段AMs自噬激活，且與損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）釋放相關(guān)，重組高遷移率族蛋白B1或熱休克蛋白60可誘導(dǎo)AMs自噬；ATG7基因或BECN1基因（編碼beclin-1的基因）敲除可抑制自噬，且通過抑制MAPK和NF-κB信號通路活化而明顯減少DAMPs誘導(dǎo)AMs產(chǎn)生的炎癥因子，抑制TNF受體相關(guān)因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）與Lys63級聯(lián)的泛素化作用；3-MA可抑制Lys63相關(guān)TRAF6的泛素化作用。這些結(jié)果表明肺I/R引起ALI的機(jī)制與自噬增加有關(guān)，且DAMPs誘導(dǎo)自噬的發(fā)生機(jī)制與增強(qiáng)TRAF6的Lys63泛素化、激活下游MAPK和NF-κB信號通路有關(guān)［41］。

Hu等［42］報道，腸I/R后，AMs的補(bǔ)體活化產(chǎn)物C5a受體表達(dá)上調(diào)，I/R損傷產(chǎn)生的C5a與AMs的C5a受體結(jié)合，啟動下游信號，激活自噬，促進(jìn)AMs凋亡，出現(xiàn)肺損傷；ATG5-/-小鼠自噬受到抑制，肺損傷減輕；同時，C5a與C5a受體互相作用后，C5a受體介導(dǎo)的Bcl-2的降解可誘導(dǎo)AMs自噬，破壞肺內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)AMs凋亡，參與ALI的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果表明，腸I/R通過C5a與C5a受體的相互作用激活A(yù)Ms自噬，引起ALI。

近年來，以抑制I/R后細(xì)胞自噬為靶向的治療措施取得了若干進(jìn)展。烏司他丁可通過抑制自噬溶酶體而抑制肢體I/R過程中的肺組織細(xì)胞過度自噬，從而減輕ALI［40］；前列地爾注射液在降低肺濕干重比、提高動脈血氧分壓的同時，降低了肺組織LC3-II及beclin-1表達(dá)，RAPA抑制了前列地爾注射液的有利作用，肺損傷加重，LC3-II及beclin-1表達(dá)隨之升高，說明前列地爾注射液可通過抑制自噬減輕I/R引起的ALI［43］；DEX預(yù)處理可通過抑制自噬上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)，下調(diào)Bcl2/腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白 3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，BNIP3）、BNIP3樣蛋白（BNIP3-like protein，BNIP3L）及 LC3-II表達(dá)，減輕I/R 導(dǎo)致的 ALI［41］；缺血后處理可通過上調(diào)PI3K/Akt信號通路及其下游分子mTOR和p70S6K減輕細(xì)胞自噬及凋亡，從而減輕I/R導(dǎo)致的 ALI［44］。

綜上所述，過度自噬在多種I/R導(dǎo)致ALI的發(fā)病過程中發(fā)揮損害性作用，其機(jī)制與MAPK活化、NF-κB激活、TRAF6的Lys63泛素化、補(bǔ)體C5a上調(diào)等因素有關(guān)，以抑制細(xì)胞自噬為靶向的治療措施有利于減輕這些I/R因素引起的肺損傷。

4.2 失血性休克引起的ALI

ALI是失血性休克后最早、最易發(fā)生的一種器官損傷，是重癥患者晚期死亡的主要原因。已有研究顯示，3-MA可減輕失血性休克后的肺組織損傷、降低肺微血管通透性，從側(cè)面表明肺組織細(xì)胞過度自噬是失血性休克引起ALI的原因之一，但相關(guān)機(jī)制還不明確。小鼠失血性休克后，BALF中AMs內(nèi)模式識別受體——核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2（nucleotide binding oligomerzation domain 2，NOD2）的mRNA和蛋白表達(dá)增加，LC3-II未見明顯變化，BALF中炎癥因子水平增高；氣管內(nèi)滴注NOD2配體細(xì)菌細(xì)胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）的失血性休克WT小鼠，AMs的LC3-II表達(dá)顯著增加，AMs炎癥反應(yīng)加劇，ALI程度增加；3-MA顯著抑制了AMs的LC3-II表達(dá)；但在NOD2-/-小鼠，即使給予MDP滴注，失血性休克亦沒有引起AMs的LC3-II高表達(dá)，但是減輕了AMs炎癥反應(yīng)的程度。上述結(jié)果提示失血性休克后AMs自噬的機(jī)制與NOD2和MDP的相互作用有關(guān)，AMs自噬與炎癥反應(yīng)和ALI相關(guān)［45］。這些研究說明，細(xì)胞自噬參與了失血性休克后ALI的發(fā)生過程，針對細(xì)胞自噬防治失血性休克ALI的機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

4.3 創(chuàng)傷引起的ALI 創(chuàng)傷引起的ALI是患者死亡的原因之一。已有研究顯示，在股骨干骨折合并腦損傷大鼠，肺組織細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II和beclin-1的mRNA表達(dá)水平升高，48 h達(dá)到高峰，5 d時仍高于正常水平［46］；在雙側(cè)股骨干骨折所致ALI大鼠，3-MA在抑制肺組織細(xì)胞過度自噬的同時，顯著降低了肺組織炎癥介質(zhì)表達(dá)并減輕了組織學(xué)損傷［47］；前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）可抑制自噬調(diào)節(jié)蛋白BNIP3L介導(dǎo)的自噬和自噬性凋亡，提高撞擊傷大鼠的動脈血氧分壓，降低肺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)，減輕肺水腫［48］。這些研究提示，創(chuàng)傷可激活肺組織細(xì)胞自噬，自噬抑制劑及PGE1可減輕ALI。

此外，創(chuàng)傷性腦損傷（trauma brain injury，TBI）引起了肺組織細(xì)胞自噬活化，適量增加自噬可抑制肺組織細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，還可通過ERK1/2/mTOR/STAT3信號通路改善TBI后的肺屏障功能、氧合功能和靜態(tài)順應(yīng)性，進(jìn)而減輕ALI，抑制自噬則加重了這些病理變化［49］。

4.4 高氧引起的ALI 高氧治療是改善重癥患者氧供的常用措施，但是長時間高氧治療會導(dǎo)致ROS過度產(chǎn)生、DNA損傷和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起ALI及呼吸衰竭。研究顯示，高氧可以誘導(dǎo)肺泡上皮A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3高表達(dá)，在24 h增加，48 h達(dá)到高峰，且與肺泡上皮A549細(xì)胞損傷呈正相關(guān)，可見過度自噬是持續(xù)高氧誘導(dǎo)ALI的機(jī)制之一［50］。但短期高氧亦引起小鼠肺組織LC3-II表達(dá)增加，自噬小體增多；用siRNA敲減LC3基因表達(dá)后，BEAS-2B細(xì)胞LC3-II的表達(dá)減少，LDH較之前顯著增加，細(xì)胞活力降低；使LC3過表達(dá)后，LDH減少，細(xì)胞活力增強(qiáng)且凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及PARP均上調(diào)，F(xiàn)as與caspase-8的相互作用減少，這說明自噬不足是短期高氧誘導(dǎo)ALI的機(jī)制之一［51］。

相關(guān)機(jī)制研究顯示，高氧通過激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）上調(diào)小鼠肺組織及人支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B的LC3-II表達(dá)，自噬小體形成增多；與此同時，高氧誘導(dǎo)下BEAS-2B細(xì)胞的p-JNK上調(diào)，LDH增加，細(xì)胞活力下降；高氧4 h后，LC3B和Fas的相互作用增強(qiáng)，但若長期暴露于高氧中，LC3B和Fas復(fù)合物就會解離，這表明長期高氧可能使LC3的保護(hù)作用消失。由此可知，短期高氧會適度激活自噬，增強(qiáng)LC3與Fas交互作用，從而促進(jìn)細(xì)胞存活，而長期高氧則會使這種作用消失，造成嚴(yán)重的 ALI［51］。

高氧可致小鼠肺泡上皮MLE-12細(xì)胞釋放炎癥因子增多，8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶（8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG-1）表達(dá)上調(diào)，且DNA鏈斷裂；OGG-1-/-小鼠暴露于高氧下，肺損傷明顯加重的同時，自噬受到抑制，LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化和LC3點(diǎn)狀染色減少，ATG7表達(dá)降低；而ATG7-/-小鼠或siRNA處理后，細(xì)胞磷酸化NF-κB升高，炎癥因子增加，結(jié)果提示高氧引起ALI過程中的自噬與OGG-1基因活化、ATG7基因上調(diào)進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)有關(guān)［52］。

4.5 百草枯（paraquat，PQ）中毒引起的ALI PQ中毒后主要沉積在肺組織，引起急性彌漫性肺損傷，死亡率達(dá)90%以上。研究發(fā)現(xiàn)，PQ中毒后第7天，肺組織出現(xiàn)自噬前體及初級溶酶體，14 d可見自噬前體及自噬小體，21 d出現(xiàn)大量自噬小體及部分自噬溶酶體，28 d自噬溶酶體膨脹及空泡化；且PQ中毒動物的肺組織LC3和beclin-1表達(dá)隨時間增高，14 d到達(dá)高峰，28 d有所下降但仍高于對照組。這些結(jié)果表明PQ中毒可激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而加重肺組織纖維化與細(xì)胞死亡［53］。外源性硫化氫通過下調(diào)肺組織細(xì)胞LC3-I、LC3-II和beclin-1表達(dá)，抑制PQ誘導(dǎo)的ALI［54］；大鼠腹腔注射PQ后，自噬相關(guān)蛋白在3 d表達(dá)增高，14 d到達(dá)峰值，隨后表達(dá)下降，同時ERS標(biāo)志分子CHOP和caspase-12表達(dá)也呈先升高后降低的趨勢［55］。這些研究表明，過度細(xì)胞自噬是PQ中毒引起ALI的機(jī)制之一，且伴有ERS。

4.6 顆粒物（particulate matter，PM）暴露引起的ALI 長期暴露于PM濃度較高的環(huán)境中，吸入后的PM主要?dú)埩粲诜谓M織，引起ALI的同時，肺組織細(xì)胞自噬增多［56］；益氣復(fù)脈方通過抑制TLR4-MyD88和mTOR自噬通路，減輕PM誘導(dǎo)的ALI，降低PM吸入導(dǎo)致的過度炎癥反應(yīng)。肺長期暴露于富含氧化鋅納米顆粒環(huán)境中，能導(dǎo)致自體吞噬泡累積于肺組織，LC3B-II及p62升高進(jìn)而引起自噬通量受損，發(fā)生ALI；3-MA顯著減少了自噬泡積累、LC3B-II和p62表達(dá)，從而顯著減輕了肺組織損傷、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，且3-MA可直接減少肺組織中鋅離子的釋放［57］。這些研究表明，PM激活自噬是引起ALI的機(jī)制之一，抑制自噬的相關(guān)治療措施有利于減輕ALI。

4.7 海水淹溺引起的ALI 海水淹溺是意外死亡的原因之一，全世界每年約有45萬人死于溺水，典型表現(xiàn)為海水高滲透壓引起以肺水腫、低氧血癥和過度炎癥反應(yīng)為特征的ALI［58］。研究發(fā)現(xiàn)，海水吸入氣管可引起大鼠肺泡上皮細(xì)胞自噬過度增加，細(xì)胞通透性增加；3-MA治療可降低肺指數(shù)和BALF中TNF-α水平，提高動脈血氧分壓［59］。上述研究提示，過度自噬是海水淹溺引起ALI的主要發(fā)病機(jī)制之一。

4.8 氯氣（chlorine，Cl2）暴露引起的ALI Cl2是一種常見的工業(yè)毒性吸入氣體，Cl2吸入可導(dǎo)致ALI和呼吸衰竭。在Cl2暴露下，人肺腺癌NCI-H441細(xì)胞線粒體受損，LC3-II表達(dá)上調(diào)；使用海藻糖激活自噬后可以減輕Cl2暴露引起的細(xì)胞線粒體損傷，減少炎癥，該保護(hù)作用可被3-MA消除［60］。由此可知，適度激活自噬可通過干預(yù)線粒體損傷減輕Cl2所致ALI。

綜上所述，細(xì)胞自噬參與了I/R、失血性休克、創(chuàng)傷、高氧、PQ中毒、PM暴露、海水淹溺、Cl2暴露等多種非感染因素引起的ALI。這些非感染因素引起細(xì)胞自噬的表現(xiàn)形式有自噬不足和過度自噬兩種。一方面，致病因素引起了自噬，發(fā)揮了一定的肺保護(hù)作用，但由于自噬不足，清除細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)的能力不足，依然發(fā)生了ALI，進(jìn)一步激活自噬有利于減輕ALI；另一方面，致病因素引起了細(xì)胞過度自噬，直接參與ALI的發(fā)生過程，以抑制自噬作為治療措施有利于減輕ALI。

5 小結(jié)與展望

總之，細(xì)胞自噬是LPS、膿毒癥、病原體感染以及諸多非感染性因素引起ALI發(fā)生的機(jī)制之一，在不同因素引起ALI發(fā)生的過程中有不同的表現(xiàn)形式。對感染相關(guān)因素而言，細(xì)胞自噬主要表現(xiàn)為自噬降低、自噬不足和過度自噬；而非感染因素引起的自噬主要為自噬不足和過度自噬。從目前的研究來看，引起肺組織細(xì)胞自噬降低的因素有CLP引起的膿毒癥；引起肺組織細(xì)胞自噬不足的因素有LPS攻擊、膿毒癥、PA和KP感染以及I/R、創(chuàng)傷性腦損傷、短期高氧、Cl2暴露等非感染因素；引起肺組織細(xì)胞過度自噬的因素有LPS攻擊、膿毒癥、H5N1感染以及I/R、失血性休克、骨折或撞擊創(chuàng)傷、長期高氧、PQ中毒、PM暴露、海水淹溺等非感染因素。這些不同的表現(xiàn)形式，除了與致病因素有關(guān)，亦可能與作用強(qiáng)度不同有關(guān)，不同信號分子也參與不同的自噬過程。

總的來看，細(xì)胞自噬在多種因素引起ALI的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮雙刃劍作用。以激活或抑制自噬為靶標(biāo)的治療措施，以恢復(fù)自噬正?；癁槟繕?biāo)，對于減輕多種致病因素引起的ALI具有積極作用。當(dāng)然，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果大多來自動物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如何將這些有益的治療措施轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床還有很長的一段路要走。同時，如何從患者出發(fā)，明確細(xì)胞自噬的生物標(biāo)志物，并以此明確患者不同時段機(jī)體的自噬狀態(tài)，也是開展以細(xì)胞自噬為靶標(biāo)的臨床治療措施的關(guān)鍵。