半楓荷的組織培養(yǎng)

陳齊明

(福建省鑫閩種業(yè)有限公司，福建 福清 350301)

半楓荷(Semiliquidambarcathayensis)又名邊荷楓、楓荷梨，是金縷梅科半楓荷屬常綠喬木，國家二級重點保護野生植物，也是我國特有的材藥兩用樹種[1]。半楓荷干形筆直，葉異型，是一種優(yōu)良的園林綠化觀賞樹種，主要分布在我國華南地區(qū)，包括江西、廣東、福建以及貴州等省[2-3]。近年來，由于人類不合理的開發(fā)利用，導(dǎo)致其野生資源嚴(yán)重破壞。因此，如何保護與擴大半楓荷資源已成為當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問題。 為此，國內(nèi)眾多學(xué)者從種子育苗、嫁接和扦插等方面對半楓荷展開大量研究[4-6]。然而，由于傳統(tǒng)種子育苗無法在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗，且后代無法穩(wěn)定保持親本優(yōu)良性狀。另一方面，半楓荷屬于較難生根的樹種，扦插成活率較低[6]，因此扦插繁殖方式也無法滿足優(yōu)良品系大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化需求。組織培養(yǎng)具有周期短、速度快和穩(wěn)定保持親本優(yōu)良性狀等特點。因此，建立半楓荷的組培快繁技術(shù)是解決半楓荷資源枯竭、保護其優(yōu)良品種的有效途徑。

目前有關(guān)半楓荷組培的研究報道較少，且主要集中在愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代等過程[7-11]。胡剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)比較適合半楓荷繼代增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，增殖系數(shù)為3.93；生根培養(yǎng)基以1/2 WPM + NAA 2 mg·L-1+ 0.2%活性炭為宜，生根率在90%以上。但該研究在增殖和生根過程中均采用單因素試驗，研究結(jié)果只能在有限的幾個處理中得到相對較優(yōu)的配方，而影響組培苗增殖和生根的因素較多，而且各因素的水平數(shù)也較多，因此采用適宜的試驗設(shè)計開展半楓荷組培研究顯得尤為關(guān)鍵。鑒于此，本研究采用半楓荷優(yōu)良單株當(dāng)年生萌條為材料，在研究半楓荷外植體消毒的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，對其誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，構(gòu)建半楓荷優(yōu)良無性系組培快繁技術(shù)體系，以期為半楓荷優(yōu)質(zhì)苗木的大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的半楓荷優(yōu)良單株“茫蕩1號”由南平市順昌林業(yè)科技推廣中心選育，以“茫蕩1號”當(dāng)年生萌條為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 剪取半楓荷當(dāng)年生幼態(tài)萌條作為外植體，流水沖去表面污物，用洗潔精清洗15 min后再用清水反復(fù)沖洗干凈；在無菌條件下，先用75%的酒精浸泡1 min，再用0.1%的HgCl2液浸泡8～15 min，最后用無菌水沖洗4～5次。將滅菌后的外植體切取帶芽的莖段，長1.5～2 cm，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。7 d后觀察記錄外植體污染率、褐化率、成活率。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

1)不同基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。選用MS、1/2 MS、4/5 MS、B5和White作為半楓荷誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，每處理20瓶，每瓶接入5個芽，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后，調(diào)查統(tǒng)計不同的培養(yǎng)基下外植體叢生芽的誘導(dǎo)率。

2)不同濃度6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg·L-1)的6-BA，研究不同濃度6-BA對叢生芽誘導(dǎo)的影響。每處理20瓶，每瓶接入5個芽，每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后，調(diào)查統(tǒng)計不同的培養(yǎng)基下外植體叢生芽的誘導(dǎo)率。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng) 采用L9(34)正交試驗設(shè)計，研究不同培養(yǎng)基類型(改良WPS、B5、MS培養(yǎng)基)、不同6-BA質(zhì)量濃度(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)、不同NAA質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.5 mg·L-1)和不同IBA質(zhì)量濃度(0.1、0.2、0.3 mg·L-1)對半楓荷繼代增殖的影響。試驗共9個處理，每處理20瓶，每瓶5個，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后，調(diào)查統(tǒng)計芽的增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=現(xiàn)有不定芽數(shù)/原接種不定芽數(shù)×100%。

1.2.4 生根培養(yǎng) 采用正交表L9(34)設(shè)計，3種培養(yǎng)基 (MS、1/4MS、1/2MS)和3種濃度(0.3、0.6、0.9 mg·L-1)的ABT、IBA，形成9個處理，每個培養(yǎng)基配方中都加入活性炭0.2 g·L-1。各培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接長度為2～3 cm的有效芽苗，每瓶接種5個單株，每處理20瓶，每處理3次重復(fù)。先暗培養(yǎng)5 d后進(jìn)行光照培養(yǎng)，生根培養(yǎng)30 d，觀察統(tǒng)計各處理的芽苗生根率和根系生長狀況。

1.2.5 煉苗與移栽 當(dāng)生根苗長至3～4 cm高，根數(shù)每株2～3根，根長達(dá)到1～2 cm后，從培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到煉苗溫室，煉苗14 d后，將小苗從瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基后，種植于不同基質(zhì)的穴盤中，栽后噴水保濕并定期噴灑百菌清或甲基托布津等殺菌劑預(yù)防病害發(fā)生。移栽30 d后統(tǒng)計其成活率。

1.2.6 半楓荷的培養(yǎng)條件 試驗培養(yǎng)基中均添加白糖30 g·L-1，卡拉膠5.8 g·L-1，培養(yǎng)室溫度(26±1) ℃ ，光強為(4000±200) lx，光照時間12 h·d-1，培養(yǎng)基pH值為5.8±0.1。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用Duncan′s方法進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對半楓荷消毒效果的影響

由表1可知，隨著消毒時間的延長，“茫蕩1號”半楓荷外植體污染率逐漸下降，但褐化率逐漸增加，而成活率呈先增加后降低的趨勢。0.1% HgCl2處理15 min時，盡管外植體污染率最低，但其褐化率達(dá)到最高水平。因此，綜合污染率、成活率和褐化率來看，半楓荷外植體消毒最佳方案為0.1% HgCl2液處理10 min，在該條件下能達(dá)到滿意的消毒效果，獲得合格的外植體達(dá)90.25%。

表1 不同消毒時間處理對半楓荷合格率的影響

*：同列不同小寫字母為0.05水平上差異顯著，下同。

2.2 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.2.1 不同培養(yǎng)基類型對叢生芽誘導(dǎo)的影響 組培苗增殖過程中培養(yǎng)基類型是影響叢生芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。由表2可知，“茫蕩1號”叢生芽對不同培養(yǎng)基類型響應(yīng)存在顯著差異。MS基本培養(yǎng)基下半楓荷的誘導(dǎo)率最高，達(dá)86.74%，且芽體生長良好，在基部產(chǎn)生大量的愈傷組織，同時愈傷組織上出現(xiàn)了許多芽點；B5培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率也較高，達(dá)到81.28%，但是芽體生長后期缺乏營養(yǎng)，30 d后芽體上生長出的葉片會出現(xiàn)黃化現(xiàn)象；White基本培養(yǎng)基對“茫蕩1號”芽的誘導(dǎo)率最低，僅為46.53%。此外，降低MS培養(yǎng)基養(yǎng)分濃度對叢生芽誘導(dǎo)效果也不理想，隨著養(yǎng)分濃度的降低，叢生芽誘導(dǎo)率顯著下降。其中，4/5 MS下叢生芽的誘導(dǎo)率為72.12%，而1/2 MS下叢生芽誘導(dǎo)率僅為49.48%，而且芽的長勢均不理想。因此，MS培養(yǎng)基是“茫蕩1號”半楓荷莖段叢生芽誘導(dǎo)適宜的培養(yǎng)基。

2.2.2 不同6-BA濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響 6-BA不同濃度對“茫蕩1號”叢生芽誘導(dǎo)結(jié)果(表3)表明，隨著6-BA濃度的升高，芽誘導(dǎo)率呈先增加后降低的趨勢，并在1.2 mg·L-1時誘導(dǎo)率達(dá)到最高 (93.74%)，而當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度超過1.2 mg·L-1時，半楓荷芽誘導(dǎo)率開始顯著下降。可見適宜的6-BA濃度對半楓荷叢生芽的誘導(dǎo)極為關(guān)鍵，濃度過低不能很好地促進(jìn)叢生芽的誘導(dǎo)，而濃度過高又會抑制叢生芽的誘導(dǎo)。因此，適合于“茫蕩1號”半楓荷外植體叢生芽誘導(dǎo)的6-BA質(zhì)量濃度為1.2 mg·L-1。

表2 不同的培養(yǎng)基對叢生芽誘導(dǎo)的影響

表3 不同濃度的6-BA對叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

不同培養(yǎng)基類型和植物生長調(diào)節(jié)劑種類(6-BA、NAA、IBA)和濃度對不定芽繼代增殖影響的結(jié)果見表4和圖1。R值大小反映不同因素對增殖結(jié)果的影響大小，研究結(jié)果表明各因素對半楓荷繼代增殖影響的大小順序為：基本培養(yǎng)基>NAA>IBA>6-BA，說明培養(yǎng)基類型是影響半楓荷不定芽增殖的關(guān)鍵因素。根據(jù)k值結(jié)果可知，繼代增殖的最佳處理組合為A3B2C1D3，即改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1。本次試驗得出的繼代增殖較佳培養(yǎng)基配方為改良MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+白糖30 g·L-1+卡拉膠5.8 g·L-1，繼代增殖系數(shù)可達(dá)3.5倍。

表4 不同培養(yǎng)基類型和激素對半楓荷不定芽繼代增殖的影響

圖1 半楓荷在最佳培養(yǎng)基中繼代生長情況

2.4 不同培養(yǎng)基養(yǎng)分濃度和植物生長調(diào)節(jié)劑水平對半楓荷生根的影響

由表5可知，生根率最高的為處理2，該處理下半楓荷生根率達(dá)到96.3%，而且根系粗壯、根數(shù)較多；而生根率最低的為處理4，僅為65.2%。R值結(jié)果表明不同因素對半楓荷生根影響的主次順序為：基本培養(yǎng)基>IBA>ABT。綜合k值結(jié)果來看，半楓荷最佳生根處理組合為：A1B2C2。因此，半楓荷理想的生根培養(yǎng)基配方應(yīng)為：MS+IBA 0.6 mg·L-1+ABT 0.6 mg·L-1+白糖30 g·L-1+卡拉膠5.8 g·L-1+活性炭0.2 g·L-1。半楓荷在最佳生根培養(yǎng)基中的生根情況見圖2。

表5 基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對生根率的影響

2.5 不同移栽基質(zhì)對半楓荷移栽的影響

不同移栽基質(zhì)對半楓荷生根苗移栽成活率具有顯著影響(表6)。其中3號處理：泥炭土∶黃心土∶珍珠巖=7∶1∶2(v/v)的移栽成活率最高，達(dá)91.7%；其次為2號處理：泥炭土∶杉木木屑=5∶5 (v/v)，其成活率為84.0%，而以泥炭土和黃心土等比例混合的基質(zhì)移栽成活率最低，這可能是由于該基質(zhì)配方質(zhì)地較其他2種配方更為緊實，不利于根系的生長和對養(yǎng)分的吸收造成的。因此泥炭土∶黃心土∶珍珠巖=7∶1∶2(v/v)是半楓荷組培苗移栽較適宜的基質(zhì)配方。

圖2 半楓荷在最佳生根培養(yǎng)基中的生長情況

表6 不同栽培基質(zhì)對半楓荷組培苗成活率的影響

3 結(jié)論

本研究建立了以“茫蕩1號”半楓荷莖段為外植體的組培快繁技術(shù)體系，為實現(xiàn)半楓荷規(guī)?；a(chǎn)提供參考。①“茫蕩1號”半楓荷當(dāng)年生幼態(tài)萌條帶芽的莖段采用75%酒精浸泡1 min，再用0.1% HgCl2液浸泡10 min，外植體平均污染率為8.09%，成活率達(dá)90.25%。②半楓荷叢生芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+白糖30 g·L-1+卡拉膠5.8 g·L-1，半楓荷誘導(dǎo)率高達(dá)93.74%。③半楓荷繼代增殖最佳培養(yǎng)基配方為改良MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+白糖30 g·L-1+卡拉膠5.8 g·L-1，半楓荷繼代增殖系數(shù)可達(dá)3.5倍。④半楓荷生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+IBA 0.6 mg·L-1+ABT 0.6 mg·L-1+白糖30 g·L-1+卡拉膠5.8 g·L-1+活性炭0.2 g·L-1，生根率可達(dá)96.30%；而適合“茫蕩1號”半楓荷移栽的基質(zhì)配方為泥炭土∶黃心土∶珍珠巖=7∶1∶2(v/v)，半楓荷移栽成活率可達(dá)91.70%。