銀杏葉提取物中總黃酮含量的熒光光度法測定

黃肖楨，劉 斌，常 薇，楊金鑫，劉伶文，王曉軍

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,陜西 西安 710048)

0 引 言

銀杏(Ginkgo biloba L.)又名白果、公孫樹,為我國特產(chǎn)植物[1]。銀杏葉是銀杏重要的醫(yī)藥部位,其中主要成分為黃酮類和內(nèi)酯類化合物[2-5]。銀杏葉黃酮主要是以黃酮糖苷的形式存在, 由山奈酚、槲皮素以及異鼠李素等黃酮苷元與葡萄糖等單糖以O(shè)-糖苷鍵聯(lián)接而成, 以該種形式存在的黃酮占到提取物黃酮總含量的95%以上[6]。銀杏黃酮具有抗衰老、抗菌、消炎等功效[7-9]。

銀杏葉提取物(GBE)的有效成分主要是黃酮苷類和萜類物質(zhì)[10-11],藥理活性廣泛且不良反應(yīng)較少[12]。測定黃酮常采用紫外分光光度法(UV)、響應(yīng)面法和高效液相色譜法(HPLC)[13-15],國外也有報道采用HPLC法[16-17]。UV法操作簡單、方便,所需成本較低,故普遍用來測定植物中總黃酮的含量[18]。本文依據(jù)黃酮類化合物可以與Al3+形成一種穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物[19](5-羥基黃酮鋁絡(luò)合物),提出用熒光光度法[20]測定總黃酮含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所采用的方法操作簡便,檢測高效快速,結(jié)果準(zhǔn)確,數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好,適合用于銀杏葉提取物中總黃酮含量的測定。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(C27H30O16,上海源葉生物科技有限公司);無水乙醇(分析純,天津天力化學(xué)試劑有限公司);六水合氯化鋁(分析純,天津天力化學(xué)試劑有限公司);冰醋酸(分析純,天津富宇精細(xì)化工有限公司);氫氧化鈉(分析純,天津福晨化學(xué)試劑廠);正丁醇(分析純,天津天力化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 儀器 RF-5301型熒光分光光度計(日本島津),移液槍(YE3K158723,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),超純水機(jī)(UPD-I-10T,四川優(yōu)普超純科技有限公司),燒杯、量筒、容量瓶。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

準(zhǔn)確移取樣品溶液1 mL,置于25 mL容量瓶中,加入正丁醇溶液5 mL,pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液2.5 mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鋁溶液7.5 mL,用60%的乙醇定容至刻度，搖勻。在激發(fā)波長為442 nm,發(fā)射波長為482 nm的條件下,測定熒光強(qiáng)度,再用回歸方程求取含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 5-羥基黃酮鋁絡(luò)合物的激發(fā)及發(fā)射光譜

蘆丁與Al3+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成的5-羥基黃酮鋁絡(luò)合物具有較強(qiáng)的熒光,其熒光光譜如圖1所示。圖1中F表示熒光強(qiáng)度(cd),λ代表激光波長(nm)。由圖1可知,它的最佳激發(fā)波長為λex=442 nm,最佳發(fā)射波長為λem=482 nm。

圖1 5-羥基黃酮鋁絡(luò)合物的激發(fā)及發(fā)射光譜

2.2 測定條件

2.2.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響 在蘆丁質(zhì)量濃度為12 mg/L,氯化鋁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,醋酸-醋酸鈉pH=4,正丁醇含量為5 mL的條件下,測試不同乙醇濃度對溶液熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響

從圖2可知,溶液的熒光強(qiáng)度隨乙醇濃度增大而顯著增強(qiáng)。這是由于給電子取代基團(tuán)—OH會與芳香環(huán)形成p-π共軛,增強(qiáng)了π電子共軛程度,使得熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液用作溶劑,這樣可降低成本并且具有較好的測定效果。

2.2.2 正丁醇含量對熒光強(qiáng)度的影響 在蘆丁質(zhì)量濃度為12 mg/L,氯化鋁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,醋酸-醋酸鈉pH=4的條件下,測試不同正丁醇的含量對熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 正丁醇含量對熒光強(qiáng)度的影響

從圖3可知,隨著正丁醇含量的增加,溶液的熒光強(qiáng)度先逐漸增強(qiáng),隨后減弱,在加入量為5 mL的時候達(dá)到最大值。這是由于給電子基團(tuán)—OH增強(qiáng)了π電子共軛程度,使得熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；之后由于正丁醇在溶液中所占體積比增大,產(chǎn)生熒光淬滅,使得熒光強(qiáng)度減弱。所以,本實(shí)驗(yàn)選用加入正丁醇的含量為5 mL。

2.2.3 pH值對熒光強(qiáng)度的影響 在蘆丁質(zhì)量濃度為12 mg/L,氯化鋁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,正丁醇含量為5 mL的條件下,測試不同pH值對溶液熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH值對熒光強(qiáng)度的影響

從圖4可知,當(dāng)pH=4的時候,所測得的熒光強(qiáng)度最大；pH=6時,最大發(fā)射波長已發(fā)生了偏移,可能是黃酮類化合物在偏中性環(huán)境與鋁離子生成了另一種絡(luò)合物。所以,本次實(shí)驗(yàn)選用了pH=4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

2.2.4 氯化鋁質(zhì)量分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響 在蘆丁質(zhì)量濃度為12 mg/L,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,醋酸-醋酸鈉pH=4,正丁醇含量為5 mL的條件下,測試不同氯化鋁質(zhì)量濃度對溶液熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖5 AlCl3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響

從圖5可知,隨著氯化鋁的質(zhì)量濃度增加,溶液的熒光強(qiáng)度先逐漸增強(qiáng),隨后減弱；在氯化鋁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時,熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。原因是黃酮類化合物與鋁離子形成的熒光絡(luò)合物濃度較高時,熒光分子間碰撞幾率增加,分子間相互作用形成二聚體,產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象,使得熒光強(qiáng)度減弱。所以,本次實(shí)驗(yàn)選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的氯化鋁溶液。

2.2.5 靜置時間對熒光強(qiáng)度的影響 在蘆丁質(zhì)量濃度為12 mg/L,氯化鋁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,醋酸-醋酸鈉pH=4,正丁醇含量為5 mL的條件下,配得溶液。將溶液在室內(nèi)(無陽光直射)靜置,并在不同的靜置時間下測定其熒光強(qiáng)度,結(jié)果如圖6所示。

圖6 靜置時間對熒光強(qiáng)度的影響

從圖6可知,溶液的熒光強(qiáng)度隨靜置時間的增長而逐漸增強(qiáng),之后緩慢下降,在10 min處有最大熒光強(qiáng)度。原因是隨著時間延長,生成的熒光絡(luò)合物會由于光氧化作用而產(chǎn)生熒光淬滅,使得熒光強(qiáng)度減弱。所以,選擇靜置10 min時作為最佳測定時間。

2.2.6 干擾試驗(yàn) 本次實(shí)驗(yàn)還測定了一些常見金屬離子對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在上述最佳測試條件下,固定蘆丁質(zhì)量濃度12 mg/L,并用標(biāo)準(zhǔn)溶液測定體系的熒光強(qiáng)度。選取相對誤差在±5%以內(nèi),允許共存物質(zhì)(倍數(shù))為Zn2+(25),K+(25),Na+(25)。

2.3 工作曲線和方法的檢出限

在確定的最佳條件下,配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定其熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明,在質(zhì)量濃度為4.0～20.0 mg/L范圍內(nèi),蘆丁質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為

F=11.89C+13.05 (R2=0.999 4)

(1)

式中：C表示蘆丁的質(zhì)量濃度(mg·L-1)。

對空白對照溶液進(jìn)行7次平行測定,由式(2)計算檢出限MDL

MDL=t(n-1,0.99)S

(2)

式中：n為樣品的平行測定次數(shù);t為自由度n-1，置信度99%時的t值;S為n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。計算得出該方法的檢出限為 0.062 mg/L。

2.4 樣品測定及回收率實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)所確定的最佳條件下,將樣品溶液稀釋25倍,測定5個不同樣品(記為Ⅰ～Ⅴ號)總黃酮的含量。為了測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度,對其中一個樣品進(jìn)行5次平行測定,結(jié)果如表1所示。由表1可知,測得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2%,因此實(shí)驗(yàn)精確度較好。

表1 Ⅰ號樣品中總黃酮含量及精確度

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性,對另外4個樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

表2 樣品加標(biāo)回收率

由表2可知,實(shí)驗(yàn)測得銀杏葉提取物中總黃酮含量的平均回收率在98.6%～100.2%之間,結(jié)果準(zhǔn)確,證明了實(shí)驗(yàn)的可行性。

3 結(jié) 論

(1)根據(jù)黃酮類化合物能與Al3+形成穩(wěn)定的熒光絡(luò)合物,以蘆丁為對照品,選用熒光光度法測定銀杏葉提取物中總黃酮的含量。最佳測定條件為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%,正丁醇含量為5 mL,醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH值為4,氯化鋁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,靜置時間為10 min。

(2)在最優(yōu)條件下,相對誤差±5%以內(nèi),允許共存物質(zhì)(倍數(shù))為Zn2+(25),K+(25),Na+(25)，熒光強(qiáng)度與蘆丁質(zhì)量濃度在4.0～20.0 mg/L的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,線性方程為F=11.89C+13.05 (R2=0.999 4)。

(3)該方法的檢出限為 0.062 mg/L,平均回收率為99.4%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2%。與其他測定方法相比,此方法操作更為方便快捷,測定結(jié)果更為準(zhǔn)確,其線性關(guān)系、精確度以及回收率都能滿足科研和生產(chǎn)要求。