烏賊生物活性物質研究進展

戴宏杰，陳啟彪，曹子璇，張歡，王姍姍，高煥秋，張宇昊*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048)

烏賊屬于軟體動物門(Mollusca)，頭足類(Cephalopoda)，烏賊目(Sepiida)，烏賊科(Sepiidae)，主要生活在熱帶和溫帶沿岸淺水中，冬季常遷至較深海域，曾與大黃魚、小黃魚和帶魚并稱為“中國四大海產”[1]。我國產量較多的烏賊種類為金烏賊(Sepiaesculenta)，在我國近海海域均有分布[2]；擬目烏賊(Sepialycidas)主要分布于東海和南海海域[3]；虎斑烏賊(Sepiapharaonic)主要分布于南海海域[4]；曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)[5]，主要分布于浙江南部沿海及福建沿海。

由于海洋環(huán)境的獨特性，從海洋生物中提取分離天然產物得到廣泛關注。烏賊作為一種深海動物，長期生活在高壓、低溫、低氧和黑暗的環(huán)境中，其獨特的生活方式使其具有產生新型生物活性物質的巨大潛力。越來越多的研究表明，從烏賊中分離獲得的多糖[1,6]、多肽[4,7]、蛋白質[8-9]等天然產物都顯示出了良好的抗腫瘤、抗氧化、降血糖等生物活性[10]。近年來，隨著曼氏無針烏賊、金烏賊和虎斑烏賊等烏賊種類在育苗和養(yǎng)成技術取得一定程度上的突破，烏賊產量進一步增加[11]，2015年我國烏賊總產量達到14萬t[12]，研究烏賊生物活性物質對于提高烏賊產業(yè)的經濟價值和豐富海洋藥物來源途徑具有重要意義。本文綜述了近年來從烏賊不同部位來源(烏賊墨、烏賊骨、烏賊內臟、烏賊肉、烏賊皮、烏賊眼和烏賊喉軟骨)中分離獲得的天然活性物質種類及其生物活性概述，以期為烏賊生物活性物質的研究開發(fā)利用提供建議和思路，拓展烏賊的綜合深加工利用和產品開發(fā)途徑，為海洋藥物和功能性食品、保健品開發(fā)提供基礎資料。

1 烏賊墨

烏賊墨是烏賊加工過程中的副產物，其主要化學成分為黑色素和蛋白多糖復合體，其中黑色素是吲哚醌(吲哚-5,6-醌與2羥基吲哚-5,6-醌)的多聚物，與蛋白結合或不結合。而蛋白多糖復合體中糖類部分主要含有等分子質量的葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖[13]。新鮮的烏賊墨中主要含有蛋白質、糖類、脂類、水和色素等成分，其含量分別為6.3%、3.0%、0.2%、75%和15.5%(質量分數)。已有眾多研究表明，烏賊墨具有調節(jié)免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血壓、抗氧化、抗輻射、止血和抑菌等生物活性[14]。

1.1 烏賊墨多糖

1.1.1 抗氧化活性

陳穎[15]研究了烏賊墨多糖對活性氧(ROS)過量聚集產生的皮膚氧化應激損傷的影響，結果表明，烏賊墨多糖可通過調節(jié)NADPH氧化酶和Connexin43途徑來有效減輕皮膚成纖維細胞的氧化應激損傷。GU等[16]研究表明，烏賊墨多糖能夠抑制環(huán)磷酰胺(CP)誘導的小鼠精子畸形、組織結構和曲細精管損傷的產生，提高超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性，降低丙二醛(MDA)的含量，顯著降低生精細胞的壞死率；同時烏賊墨多糖能夠有效減弱睪丸間質細胞超微結構的損傷。表明烏賊墨多糖能夠通過提高抗氧化能力和抑制自噬來預防CP對細胞骨架的破壞。

1.1.2 抗腫瘤活性

烏賊墨多糖的抗腫瘤作用主要通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管形成、抗腫瘤侵襲與轉移、調節(jié)免疫功能、降低化療藥物的毒副作用、輔助化療藥物發(fā)揮作用及抗氧化等途徑實現[1]。CHEN等[17]研究表明，烏賊墨硫酸化多糖能夠抑制HepG2人肝癌細胞的生長、入侵和轉移，同時對雞胚絨毛尿囊膜血管的生長也有抑制作用。ZONG等[18]研究表明，烏賊墨多糖能夠誘導人卵巢癌細胞株SKOV-3的凋亡，抑制SKOV-3細胞內聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1的表達，上調促凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9和bax的表達水平。JIANG等[19]研究表明，烏賊墨硫酸化多糖能夠減弱表皮細胞生長因子(EGF)誘導的表皮生長因子受體(EGFR)表達和活化，并通過抑制SKOV-3細胞的p38/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑來抑制SKOV-3細胞的遷移和侵襲，表現出在抗腫瘤藥物方面的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1.1.3 抗菌防腐

SHI等[20]研究發(fā)現，烏賊墨對冷藏黃鯛魚有較好的抗菌防腐作用，能夠延長保質期。吳金龍等[21]研究表明，烏賊墨多糖對冷凍魷魚有較好的防腐抗菌作用，其中7 mg/mL的烏賊墨多糖和1 mg/mL的山梨酸鉀、3 mg/mL的殼聚糖防腐效果相當。此外，食用烏賊墨多糖還能明顯改善化療藥物造成的腸道菌群失調，增加有益菌數量，提高腸道抗感染能力[6]。SADOK等[22]考察了烏賊墨對去皮蝦肉的保鮮效果。隨著烏賊墨濃度的增加，保鮮效果也相應提高，總揮發(fā)性鹽基氮(TVB)和三甲胺(TMA)水平降低，同時烏賊墨對蝦肉的外觀、氣味和味道等沒有產生不利影響，表明烏賊墨可作為天然水產品保鮮防腐劑進行開發(fā)利用。

1.1.4 免疫增強活性

LIU等[23]研究表明金烏賊墨多糖(SEP)能夠抑制CP對小鼠卵泡、卵巢、子宮的毒性，可通過抑制p38 MAPK信號通路和激活PI3K/Akt信號通路有效預防CP引起的卵巢功能衰竭。SEP是一種新型烏賊墨多糖，主要由GalN和Ara組成(比例為1∶1)，幾乎占所有單糖組成的一半，此外還含有少量的Fuc、Man、GlcN、GlcA和GalA。ZUO等[24]對小鼠進行腹腔注射CP處理后發(fā)現烏賊墨多糖(OBP)能夠增強occludin、zonulae occluden (ZO)-1和E-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白質表達水平。ZO-1和E-鈣黏蛋白的免疫組織化學染色證實了mRNA和蛋白質水平的增加。OBP還能夠顯著增強其他緊密連接蛋白(包括ZO-2、ZO-3、密蛋白-2和cingulin)的mRNA表達，表明OBP對宿主防御具有重要意義，尤其是對CP誘導的上皮細胞損傷的免疫增強作用。ZUO等[25]同時發(fā)現OBP還能夠增強細胞中的黏蛋白表達，OBP對黏蛋白的上調依賴于杯狀細胞的增加量，表明OBP對腸黏膜的免疫增強具有重要意義。

1.1.5 其他生物活性

SOLIMAN等[26]研究表明，烏賊墨水提物對膽汁淤積引起的腎臟和脂質代謝紊亂具有一定的療效，同時還具有良好的抗氧化能力。ZHANG等[27]采用烏賊墨和幾丁質制成止血混合海綿，表明烏賊墨可以作為天然來源的止血材料開發(fā)利用。此外，有研究表明，烏賊墨硫酸化多糖能夠增加部分促凝血酶原激酶時間和凝血酶原時間，表明其可通過抑制內源性和外源性血液凝固過程發(fā)揮抗凝作用。烏賊墨硫酸化多糖主要通過抗凝血酶Ⅲ或肝素輔助因子Ⅱ介導來有效抑制凝血因子FIIa和FXa的活性表達[28]。

1.2 烏賊墨多肽

生物活性多肽是指能夠優(yōu)化機體代謝環(huán)境、有益于機體健康的一類多肽。一般由蛋白酶酶解制得，通常含有3 ～ 20個氨基酸殘基，它在原蛋白質序列上沒有生物活性，但是通過酸、堿或酶水解釋放后具有生物活性，其活性取決于它們的氨基酸組成及其排列順序[29]。由于烏賊墨中蛋白含量相對較低，以烏賊墨為原料來源的多肽活性研究報道相對較少。DING等[30]通過胰蛋白酶水解烏賊墨得到一種氨基酸序列為Gln-Pro-Lys的多肽，分子質量為343.4 Da。該寡肽能夠顯著抑制人前列腺癌細胞DU-145的增殖并以劑量依賴性方式誘導其死亡，具有一定的抗腫瘤活性。該研究團隊繼續(xù)研究發(fā)現，該活性寡肽通過加強細胞周期的S和G2/M期來抑制前列腺癌細胞DU-145和LNCaP的增殖，通過加強細胞周期SubG1和G0/G1階段來調節(jié)PC-3細胞的生長，并呈現劑量依賴性，進一步實驗表明，該活性寡肽抑制前列腺癌細胞增殖機制可能是通過下調基因Bcl-2的表達，上調基因Bax和Capase-3的表達，同時增加Bax/Bcl-2的比例來實現的[7]。此外，他們還在烏賊墨中分離出另一種新型抗腫瘤肽(SHP)，其氨基酸序列為Leu-Lys-Glu-Glu-Asn-Arg-Arg-Arg-Arg-Asp，分子質量1 371.53 Da。SHP能夠以時間和劑量依賴性方式顯著抑制PC-3細胞的增殖[31]。這些研究表明來源于烏賊墨的多肽可以作為一種新型的癌癥腫瘤的治療藥物進行開發(fā)利用。

1.3 烏賊墨肽聚糖

肽聚糖是一種包含多糖和氨基酸的聚合物，是原核生物細胞壁的重要組成成分。一些研究表明，肽聚糖具有良好的生物活性，如抗腫瘤、抗凝血和抗病毒等生物活性[32-33]。鄭玉寅等[34]從烏賊墨中提取得到肽聚糖，通過大量體外實驗表明，烏賊墨肽聚糖通過上調Caspase-3 mRNA表達，下調COX-2和VEGF蛋白、Bcl-2 mRNA表達，誘導DU-145和PC-3細胞的凋亡從而達到抑制其生長的作用，其抑制效果具有明顯的量效依賴性。

1.4 烏賊墨黑色素

黑色素是烏賊墨中的重要組成部分，天然的黑色素是吲哚-5，6-醌(Ⅰ)與2-羧基吲哚-5，6-醌(Ⅱ)的共聚物，具有一定的生物活性。李和生等[35]研究表明，烏賊墨黑色素是由黑色素單體堆積而成，其單體顆粒呈圓形，平均直徑約為118 nm。烏賊墨黑色素可有效抑制豬油的氧化反應，對大鼠自發(fā)性脂質過氧化也有明顯的抑制作用，其抑制率達到53.3%。同時，黑色素對Fe2+-Cys誘導大鼠肝脂質過氧化也有較明顯的抑制作用，其抑制率達到22.5%。GUO等[36]通過超聲輔助降解法從烏賊墨中提取水溶性黑色素，利用薄膜分離不同分子質量分大小的黑色素分子，其中超過10 kDa的分子顯示最強的抗氧化能力。DONG等[37]研究表明，烏賊墨黑色素對小鼠腸道菌群結構無明顯影響，但能影響優(yōu)勢細菌群落的比例且與劑量正相關。從健康的角度來看，使用黑色素不會引起腸道菌群失調，證明了烏賊墨黑色素作為功能性成分在調節(jié)腸道微生物群落方面的潛力。

2 烏賊骨

3 烏賊內臟

烏賊經加工取得可食部分，剩余的內臟、皮、墨汁等加工廢棄物占烏賊總比例35%以上，如何高值化利用這些加工副產物對烏賊產業(yè)的發(fā)展具有重要意義[50]。CUDENNEC等[51]用酶解法得到烏賊內臟水解液，其能刺激膽囊收縮素(CCK)和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的分泌而沒有毒性，同時能夠抑制DPP-4(T細胞表面抗原CD26)和結腸腺癌細胞DPP-IV的活性。戴宏杰等[3,52]以擬目烏賊生殖腺為原料得到水提和堿提多糖，兩種多糖均具有一定的自由基清除活性并呈現劑量依賴性，堿提多糖還具有良好的吸濕和保濕性能。沙龍等[53]研究了曼氏無針烏賊內臟脂溶性提取物的抗炎功效，結果表明當劑量為100 mg/kg時能明顯抑制二甲苯誘導小鼠耳廓腫脹(抑制率為39.6%)、角叉菜膠誘導大鼠足腫脹模型(抑制率為28.73%)、棉球肉芽腫增生(抑制率為36.21%)這3種炎癥模型，具有較強的抗炎功效，可作為天然的抗炎營養(yǎng)增補劑開發(fā)利用。葉叢林等[54]以烏賊內臟為原料，采用胰蛋白酶酶解得到不同分子質量的多肽，其具有不同程度的抗氧化活性。對比同屬為頭足類的魷魚內臟的研究，關于烏賊內臟生物活性物質的研究還遠遠不夠。例如魷魚精巢中的魷魚精白具有增強肝功能、促進細胞增長、抑制腫瘤增長等功效，已在醫(yī)藥領域廣泛應用[55]。同時魷魚內臟中含有大量的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)[56]，而內臟中的大量存在的核酸對動物體生命活動也具有重要意義，這些生物活性物質都值得深入研究。而在烏賊內臟中缺乏相關的研究數據，這對于發(fā)展烏賊內臟的高值化綜合利用具有重要意義。

4 烏賊皮

烏賊皮中的蛋白質含量約占烏賊皮干重的80%[57]。近年來關于烏賊皮的研究主要集中在明膠提取和生物膜制備，關于其生物活性的研究相對較少[58-63]。JRIDI等[63]采用不同的微生物酶制劑處理得到烏賊皮明膠水解物，其蛋白含量達到74.3%～78.3%，溶解度超過90%。具有較好的清除自由基活性和抑制脂質過氧化作用，可用作具有抗氧化活性和功能性質的食品添加劑進行利用。JRIDI等[62]從烏賊皮中提取膠原蛋白并制備凝膠生物材料，其具有促進傷口愈合的能力，局部施用膠原基凝膠能夠顯著增加傷口閉合率。JRIDI等[59]從烏賊皮和肌肉中得到新型硫酸化多糖，其對幾種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均顯示良好的抗菌活性，同時具有一定的體外抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑和抗菌劑利用。烏賊皮中含有大量的膠原蛋白，但現階段的信息相對較少，后續(xù)研究應集中在烏賊皮膠原蛋白的優(yōu)勢提取工藝、生物活性和功能應用方向。

5 烏賊肉

烏賊肉的藥用始載于《名醫(yī)別錄》：性平味酸，入肝、腎兩經，能滋陰血，益肺氣，養(yǎng)肝腎，補血脈，利胎產，調經帶，常煮食內服[64]。烏賊肉營養(yǎng)價值高，是重要的蛋白質來源之一，也是目前烏賊加工的主要產品形式。據報道，擬目烏賊肌肉粗蛋白質含量為14.80%、曼氏無針烏賊為14.28%[65]、金烏賊為13.37%[66]、虎斑烏賊為20.24%[67]。BALTI等[68]研究了不同細菌蛋白酶水解烏賊肉蛋白獲得的產物對血管緊張素I轉化酶(ACE)的抑制活性。其中提取自莫哈韋芽孢桿菌(BacillusmojavensisA21)的粗蛋白酶水解后的產物具有最高的ACE抑制活性。進一步通過Sephadex G-25和反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離出11種ACE抑制肽，抑制活性較好的多肽序列為Ala-His-Ser-Tyr、Gly-Asp-Ala-Pro、Ala-Gly-Ser-Pro和Asp-Phe-Gly，其中Ala-His-Ser-Tyr顯示出最高的ACE抑制活性，IC50值為11.6 μmol/L。BALTI等[69]繼續(xù)從烏賊肉中酶解分離純化得到更多具有ACE抑制活性的肽，其結構序列為Val-Glu-Leu-Tyr-Pro、Ala-Phe-Val-Gly-Tyr-Val-Leu-Pro和Glu-Lys-Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro。其中Val-Glu-Leu-Tyr-Pro的ACE抑制活性最高，其IC50值為5.22 μmol/L。這些結果表明,烏賊蛋白水解物可作為ACE抑制肽的良好來源。此外，動物實驗結果表明,多肽Val-Glu-Leu-Tyr-Pro還具有降血壓的功效，可作為營養(yǎng)保健品進行開發(fā)利用。HMIDET等[70]也用上述蛋白酶水解烏賊肌肉蛋白，不同水解度的產物均表現出顯著的螯合金屬離子活性和DPPH·清除活性，并能夠抑制亞油酸過氧化，其抗氧化性能隨水解度的增加而增加。DAI等[9]從虎斑烏賊肌肉中提取得到粗糖蛋白SPMG，純化后得到兩種糖蛋白SPMG-Ⅰ和SPMG-Ⅱ，均表現出一定的清除自由基活性和還原能力。基于烏賊肉的高蛋白含量和高營養(yǎng)價值，可作為烏賊生物活性肽的重要提取原料開發(fā)利用。但是目前關于烏賊肉生物活性肽的研究主要集中在ACE抑制肽，對于其他生物活性多肽尚需繼續(xù)挖掘，例如抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老和抗凝血等多功能活性肽。而對于活性肽的氨基酸組成、結構與生物活性的關系、作用機理、分子水平的調控機制也尚不完全清楚，需要進一步深入研究。

6 烏賊眼

由于烏賊眼相對于烏賊其他加工下腳料占比更少，關于其研究也相對較少。從烏賊眼中分離透明質酸是目前的主要研究方向，透明質酸是由β-D-葡萄糖醛酸和N-乙?；?D-氨基葡糖交替聚合而成的高分子線性黏多糖[71]，在機體生命活動中發(fā)揮重要作用，如影響細胞的增殖與分化、調節(jié)蛋白質、潤滑關節(jié)、調節(jié)血管壁的通透性、抗腫瘤、抗氧化、促進創(chuàng)口愈合和吸水保水性，廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品領域[72]。張麗媛等[73]對中性蛋白酶提取金烏賊眼中透明質酸的工藝進行優(yōu)化。結果表明，影響提取率的工藝因素順序為加酶量>酶解時間>酶解溫度，最佳酶解條件為加酶量8 200 U/g、酶解時間3 h、酶解溫度60 ℃，此時透明質酸提取率為10.70%。李密等[72]研究表明，烏賊眼中提取的透明質酸不僅具有較好的抗氧化活性，還能夠有效促進小鼠創(chuàng)口的無痕愈合，愈合效果優(yōu)于對照組(云南白藥組)，同時沒有表現出皮膚致敏性。烏賊眼含有較多的玻璃體，可作為透明質酸的良好來源，這也是目前發(fā)展烏賊眼高值化利用的主要途徑，但相關更深入的研究較為缺乏。

7 烏賊喉軟骨

王亞兒等[74]以金烏賊的喉軟骨為原料，通過酶法提取得到硫酸軟骨素，分離純化后得到CS-1和CS-2兩個樣品，均為E型硫酸軟骨素，分子質量分別為39 800 u和19 500 u。與哺乳動物中常見的A型硫酸軟骨素和大多數海產品提取的C型硫酸軟骨素相比，E型硫酸軟骨素具有2個硫酸鹽基團，具有更高的生理活性[75]。鄭麗等[76]進一步以上述CS-1和CS-2為原料，比較其抗氧化和抑制黑色素瘤生長活性。結果表明，CS-1和CS-2清除DPPH·的IC50值分別為13.64和12.42 mg/mL，對清除·OH的IC50值分別為7.52和3.98 mg/mL。CS-1和CS-2均對黑色素瘤細胞B16-F10的生長有抑制作用，濃度在240 μg/mL時，CS-1和CS-2的抑制率分別約為38%和54%，而同條件下抗腫瘤藥物CDDP的抑制率為79%，表明CS-1和CS-2的具有良好的抗腫瘤活性。已有研究表明硫酸軟骨素具有廣泛的生物活性，如抗炎、免疫調節(jié)、降血脂、抗凝血、抗腫瘤等活性[77]，但當前對于烏賊來源的硫酸軟骨素的研究相對缺乏。

8 結論與展望

海洋是潛力巨大的天然生物活性物質資源寶庫，海洋環(huán)境的獨特性賦予了海洋天然活性物質獨特的結構和更多、更強的生物活性。我國海域遼闊，海洋資源豐富，開發(fā)潛力巨大，近年來我國海域的烏賊年產量和占漁獲量的比例均呈逐年上升趨勢，同時隨著烏賊養(yǎng)殖、營養(yǎng)和繁殖行為學等相關研究的開展，迫切需要提供更多、更經濟、更高附加值的烏賊綜合加工利用手段。因此，對烏賊各部位的生物活性物質開展系統(tǒng)利用研究具有重要意義，不僅能夠提高烏賊產業(yè)的附加值，加快烏賊類功能性食品和保健品開發(fā)利用，更能為海洋藥物的創(chuàng)新開發(fā)提供資源庫和研究思路。

目前以烏賊為原料的生物活性物質研究主要集中在烏賊墨活性多糖，且已表現出良好的效果和發(fā)展?jié)摿?，但是研究仍然不夠全面，相應的活性機制也尚未被完全揭示清楚，對相關的信號傳導通路仍較為模糊。盡管烏賊骨已經作為中藥材原料開發(fā)利用，多糖和甲殼素是烏賊骨中的主要研究生物活性物質對象，但是缺乏更多的相關研究數據去分析和解釋其生物活性機理。其他占比重較多的部位如烏賊肉、烏賊內臟、烏賊皮的研究則相對更少。而烏賊肉中蛋白質含量較高，烏賊內臟中油脂含量較高(不飽和脂肪酸)，烏賊皮中膠原多肽含量較多，這些生物活性物質亟待獲得更多的關注。作為烏賊加工下腳料的烏賊墨、烏賊內臟、烏賊皮、烏賊骨、烏賊眼和烏賊喉軟骨應最大限度的開發(fā)利用，減少加工廢棄物的產生和提高烏賊加工產業(yè)附加值。此外，關于烏賊生物活性物質的分離純化工藝、分子結構解析和生物活性機制應著重研究，并結合適當的改性修飾技術提高生物活性。而不同烏賊品種、海域環(huán)境和生長期之間造成的生物活性物質差異比較研究目前尚屬空白。綜合開展這些方向的研究有利于推進和完善烏賊來源的生物活性物質系統(tǒng)開發(fā)和利用。