不同因素對(duì)牡蠣酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響

張滿，周亞軍，溫丑玉，徐瑞彬，曹燕峰，牛麗紅，劉海梅，趙芹

(魯東大學(xué) 食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái),264025)

牡蠣作為世界第一大養(yǎng)殖貝類，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá)50.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，且必需氨基酸種類齊全[1]。近年來，隨著天然調(diào)味料的發(fā)展，以牡蠣為原料，酶解制備天然海鮮調(diào)味料引起了研究者的廣泛關(guān)注。劉海梅等[2]采用Protemax復(fù)合蛋白酶水解牡蠣肉，制備了具有強(qiáng)烈鮮美味的酶解液，其鮮味氨基酸含量達(dá)436.60 mg/100 mL。姚玉靜等[3]選用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)牡蠣進(jìn)行深度酶解，也得到了鮮味特征明顯的酶解產(chǎn)物，其鮮味氨基酸含量為17.5%，甜味氨基酸含量為30.6%。雖然牡蠣酶解液鮮味顯著且營(yíng)養(yǎng)豐富，但是由于牡蠣本身的腥味，導(dǎo)致其酶解液帶有一定的腥臭味，不僅影響了產(chǎn)品的風(fēng)味，也制約了其在水產(chǎn)調(diào)味料中的使用。

美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)是食品體系中游離氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)的氨基與還原糖的羰基之間發(fā)生的一種復(fù)雜反應(yīng)，它能賦予食品愉快的香味和誘人的色澤，同時(shí)減弱了食品中原有的腥味，目前已成為生產(chǎn)熱反應(yīng)型天然肉味香精香料的主要途徑[4]。半胱氨酸(Cysteine，Cys)和硫胺素(Vitamin B1，VB1)作為重要的肉味前體化合物，可與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生咸味、肉味和醬油樣香氣,使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味加強(qiáng)[5-6]。探討肉味前體化合物對(duì)牡蠣酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction produncts，MRPs)風(fēng)味的影響，對(duì)于改善水產(chǎn)品酶解液的腥味問題制備、肉香風(fēng)味水產(chǎn)調(diào)味料具有重要意義。

本文以牡蠣酶解液為氨基來源，與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，研究L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)、VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)、體系初始pH以及反應(yīng)時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)MRPs的影響，優(yōu)化得到最佳的美拉德反應(yīng)條件，為牡蠣熱反應(yīng)肉香風(fēng)味調(diào)味料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮太平洋牡蠣(Crassostreagigas)，殼長(zhǎng) 10～15 cm：市售；Protemax復(fù)合蛋白酶(酶活力 1.5 AU/g)、風(fēng)味蛋白酶(酶活力500 LAPU/g)：諾維信憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技(北京)有限公司；葡萄糖：上海市藍(lán)季生物有限公司；L-半胱氨酸鹽：南京奧多福尼生物科技有限公司；VB1：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2B型組織勻漿搗碎機(jī)，金壇市榮華儀器制造有限公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備

將太平洋牡蠣外殼沖洗干凈后，開殼，取出全部軟組織，瀝干后稱重。取牡蠣肉按照料液比1∶5(質(zhì)量比)加入蒸餾水，于高速組織搗碎機(jī)勻漿。pH 7.0下，添加Protemax復(fù)合蛋白酶(30 AU/kg)，于50 ℃下恒溫酶解2 h，沸水浴滅酶15 min。冷卻至室溫后添加風(fēng)味蛋白酶(10 000 LAPU/kg)，50 ℃下恒溫酶解2 h，沸水浴滅酶15 min。酶解產(chǎn)物于5 000 r/min離心15 min，取上清液即為牡蠣酶解液。

1.3.2 MRPs褐變程度和反應(yīng)中間產(chǎn)物的測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[7-8]，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定294 nm的吸光度值，作為中間產(chǎn)物生成量的指標(biāo)，測(cè)定420 nm的吸光度值表示MRPs的褐變程度，作為晚期褐變聚合物形成的指標(biāo)。

1.3.3 MRPs的感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)定小組由10人(5男5女)組成，根據(jù)表1中的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MRPs進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，打分后取平均值。

表1 美拉德反應(yīng)液風(fēng)味的感官評(píng)定指標(biāo)Table 1 Sensory evaluation standards of Maillard reaction products

1.3.4L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的葡萄糖，并加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的L-Cys(0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)，在pH 7.0下，于100 ℃熱反應(yīng)60 min，冷卻，5 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定A420、A294，評(píng)價(jià)其感官特性。

1.3.5 VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的葡萄糖，并加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的VB1(0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%)，反應(yīng)過程及測(cè)定分析指標(biāo)同1.3.4。

1.3.6 體系初始pH對(duì)MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的葡萄糖，0.25%的L-Cys，0.25%的VB1，分別調(diào)節(jié)體系pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，反應(yīng)過程及測(cè)定分析指標(biāo)同1.3.4。

1.3.7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs的影響

于牡蠣酶解液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的葡萄糖，0.25%的L-Cys，0.25%的VB1，調(diào)節(jié)pH為7.0，在100 ℃下分別加熱反應(yīng)30、60、90、120和150 min，測(cè)定分析指標(biāo)同1.3.4。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理及圖表制作。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs的影響

半胱氨酸作為含硫氨基酸，對(duì)肉香味化合物的生成具有不可替代的重要作用，但是其在反應(yīng)中生成的中間體對(duì)美拉德反應(yīng)具有一定的減緩作用。由圖1-A可知，隨著L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，美拉德反應(yīng)體系的褐變程度持續(xù)下降，說明L-Cys的添加在一定程度上抑制了MRPs的形成。HUANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Cys對(duì)大豆肽-木糖美拉德反應(yīng)體系顏色的形成也具有顯著的抑制作用，與本文結(jié)果一致。L-Cys作為含巰基的α-氨基酸，比大部分氨基酸更易被氧化。隨著美拉德反應(yīng)進(jìn)行，其氧化程度增加，進(jìn)而影響了吡嗪、呋喃等美拉德反應(yīng)的主要產(chǎn)物以及其他前體物質(zhì)的產(chǎn)生[10]。在抑制顏色生成方面，其機(jī)理可能有兩方面：一是由于Cys含有其獨(dú)特的親核基團(tuán)—SH，可與α, β-不飽和羰基中間產(chǎn)物反應(yīng)，捕獲親電子的化合物及中間產(chǎn)物，從而阻止褐色終產(chǎn)物的形成[11]；二是Cys通過阻礙加熱過程中形成大量的自由基，進(jìn)而抑制了MRPs的生成[12]。

中間產(chǎn)物生成量和感官評(píng)分隨L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(見圖1-A和圖1-B)，主要是由于隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，L-Cys在Strecker反應(yīng)中產(chǎn)生的H2S、NH3和乙醛等活躍的反應(yīng)中間物的量逐漸上升，進(jìn)一步反應(yīng)生成較多的肉香風(fēng)味化合物[13]。但是，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.25%時(shí)，L-Cys會(huì)因熱分解產(chǎn)生過多的氨、硫化氫等含硫物質(zhì)，導(dǎo)致不協(xié)調(diào)的硫臭味，破壞了肉味香氣的形成。結(jié)合不同L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)下MRPs感官評(píng)分雷達(dá)圖(圖1-C)分析得出，L-Cys的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%。

A-A420;B-A294;C-感官評(píng)分雷達(dá)圖圖1 L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs的影響Fig.1 Effect of L-Cys addition on the formation of Maillard reaction products

2.2 VB1對(duì)MRPs的影響

VB1是一種重要的肉味前體化合物，很多含硫的肉類風(fēng)味化合物，如呋喃、呋喃硫醇、噻吩、噻唑等，都可以通過VB1的熱降解產(chǎn)生，VB1的熱降解也會(huì)產(chǎn)生H2S、NH3等美拉德反應(yīng)的中間物質(zhì)[14]。由圖2-A和圖2-B可知，當(dāng)VB1用量在0%～0.50%時(shí)，隨著VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的感官品質(zhì)明顯提升，反應(yīng)生成的中間產(chǎn)物量也明顯增加，說明VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)適當(dāng)時(shí)，對(duì)整個(gè)MRPs風(fēng)味具有提升和協(xié)調(diào)作用。當(dāng)用量在0.50%～1.00%時(shí)，感官評(píng)分隨著VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加反而降低，中間產(chǎn)物的含量也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，一方面的原因可能是VB1的降解產(chǎn)物抑制了美拉德反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，另一方面可能是過量的VB1添加導(dǎo)致H2S、NH3等硫臭味物質(zhì)產(chǎn)生，掩蓋了原來的肉香味[15-16]。

由圖2-A可知，當(dāng)用量在0%～0.75%時(shí)美拉德反應(yīng)體系的色澤隨VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減弱，說明VB1在一定濃度內(nèi)有降低褐變程度的作用。VB1對(duì)色澤形成的抑制作用可能與含硫化合物如亞硫酸鹽的抑制機(jī)制相似，即硫離子通過結(jié)合糖基胺的裂解產(chǎn)物從而阻斷發(fā)色團(tuán)的生成，抑制高級(jí)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精的形成[17]。當(dāng)VB1用量在0.75%～1.00%時(shí)，褐變程度有所上升，這可能是由于VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時(shí)受熱發(fā)生降解，噻唑環(huán)中C-N及C-S鍵的斷裂，形成了非常重要的硫基酮中間產(chǎn)物―羥甲基硫基酮，由此產(chǎn)生一系列呈色的含硫雜環(huán)化合物[18]。結(jié)合MRPs的感官評(píng)分雷達(dá)圖(圖2-C)分析得出，VB1的最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%。

A-A420;B-A294;C-感官評(píng)分雷達(dá)圖圖2 VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MRPs的影響Fig.2 Effect of VB1 addition on the formation of Maillard reaction products

2.3 體系初始pH對(duì)牡蠣酶解液美拉德反應(yīng)效果的影響

體系初始pH對(duì)MRPs的影響如圖3所示。在pH 4.0～9.0，褐變程度與中間產(chǎn)物的量逐漸增加，感官評(píng)分隨pH上升呈先增加后降低的趨勢(shì)(圖3-A和圖3-B)。由此可見，初始pH值太低或者太高都會(huì)影響牡蠣美拉德反應(yīng)液的整體風(fēng)味，其原因與不同pH下美拉德反應(yīng)速率有關(guān)。在pH≤7.0時(shí)，美拉德反應(yīng)程度較弱，在強(qiáng)酸性條件下氨基被質(zhì)子化，阻止了葡基胺的形成，進(jìn)而阻礙了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。當(dāng)體系呈堿性時(shí)，美拉德反應(yīng)速率提高，氨基氮將嚴(yán)重?fù)p失，因此褐變程度和中間產(chǎn)物的量迅速增加，但同時(shí)也導(dǎo)致反應(yīng)液產(chǎn)生的風(fēng)味變差[19]。另外，在有含硫化合物參與的美拉德反應(yīng)體系中，偏酸時(shí)產(chǎn)生的H2S易逸出體系，偏堿時(shí)NH3則易逸出，而當(dāng)反應(yīng)體系缺少H2S和NH3時(shí)，都不能形成理想的肉香味[20]。結(jié)合感官評(píng)分(圖3-C)分析，體系初始pH值在7.0時(shí)，MRPs形成良好的風(fēng)味，此結(jié)果與袁林等[21]的研究結(jié)果趨勢(shì)一致。

A-A420;B-A294;C-感官評(píng)分雷達(dá)圖圖3 初始pH對(duì)MRPs的影響Fig.3 Effect of pH on the formation of Maillard reaction products

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs的影響

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)液中的氨基酸與還原糖不斷地發(fā)生反應(yīng)，會(huì)形成大量的類黑精色素[22]。由圖4可知，在0～120 min隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐變程度、感官評(píng)分和中間產(chǎn)物生成量均增加，美拉德反應(yīng)程度逐漸增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過120 min后，褐變程度和中間產(chǎn)物生成量繼續(xù)增加，但是感官評(píng)分開始下降，可能是由于過量產(chǎn)生的類黑精經(jīng)過環(huán)化生成一系列吡啶、吡咯等含氮雜環(huán)化合物，產(chǎn)生的焦香味和雜氣給MRPs帶來不良風(fēng)味[16]。綜合感官評(píng)分雷達(dá)圖(圖4-C)分析得出，美拉德反應(yīng)最適宜的時(shí)間為120 min。

A-A420;B-A294;C-感官評(píng)分雷達(dá)圖圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs的影響Fig.4 Effect of reaction time on the formation of Maillard reaction products

2.5 美拉德反應(yīng)條件的正交優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(34)，優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件。正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表2 美拉德反應(yīng)因素水平表Table 2 The factor levels of Maillard reaction factors

由表3可知，對(duì)A420而言，4個(gè)因素對(duì)MRPs影響的大小順序?yàn)镃>A>D>B，即體系初始pH>L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)>反應(yīng)時(shí)間>VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由極差分析和各因素平均值可得優(yōu)化后適宜的反應(yīng)條件為L(zhǎng)-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%，VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%，pH 8.0，反應(yīng)時(shí)間130 min；對(duì)A294而言，4個(gè)因素對(duì)MRPs影響的大小順序?yàn)锳>D>B>C，即L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)>反應(yīng)時(shí)間>VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)>體系初始pH，由極差分析和各因素平均值可得優(yōu)化后適宜的反應(yīng)條件為L(zhǎng)-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%，VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%，pH 8.0，反應(yīng)時(shí)間130 min；對(duì)感官評(píng)分而言，各因素對(duì)MRPs影響的大小順序?yàn)锳>B>C=D，即L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)>VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)>體系初始pH=反應(yīng)時(shí)間，由極差分析和各因素平均值可得優(yōu)化后適宜的反應(yīng)條件為L(zhǎng)-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%，VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%，pH 8.0，反應(yīng)時(shí)間為110或120 min。由極差分析可知，VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.50%和0.75%時(shí)的色澤和風(fēng)味差異不大，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，選用0.50%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。綜合以上分析，優(yōu)化得到美拉德反應(yīng)最佳工藝條件為L(zhǎng)-cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15 %、VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50 %、pH 8.0、反應(yīng)時(shí)間130 min。

表3 Maillard反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal optimization in Maillard reaction

2.6 美拉德反應(yīng)驗(yàn)證試驗(yàn)

在正交優(yōu)化得出的最佳組合條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，得到的MRPs的A420為0.672，A294為0.853，感官評(píng)分為4.67，無腥味且具有良好的肉香味。

3 結(jié)論

本文以牡蠣酶解液與葡萄糖建立美拉德反應(yīng)體系，通過單因素試驗(yàn)比較了L-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)、VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)、體系初始pH和反應(yīng)時(shí)間對(duì)MRPs的影響，并利用正交試驗(yàn)L9(34)優(yōu)化得到最佳的美拉德反應(yīng)條件為L(zhǎng)-Cys質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%、VB1質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%、體系初始pH為8.0、反應(yīng)時(shí)間130 min。在此條件下，得到的美拉德反應(yīng)液感官評(píng)分最高，無腥味，鮮味濃郁且具有良好的肉香味。本研究為水產(chǎn)品酶解液風(fēng)味的改善提供了良好的思路，也為新型牡蠣調(diào)味品的研究及開發(fā)利用提供了參考。