牡丹籽油甘油三酯結(jié)構(gòu)及理化特性分析

馮西婭，黃威，索化夷，王洪偉，張玉*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)2(食品科學與工程國家級教學示范中心(西南大學)，重慶，400700)3(重慶文理學院，重慶，402160)

牡丹籽油是以油用牡丹籽為原料，經(jīng)壓榨、精制等工藝制成黃色透明油狀液體[1]。牡丹籽油含有豐富的不飽和脂肪酸，具有抗氧化、降低血糖血脂、防癌抗癌、調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、保護肝臟等作用[2-4]。牡丹籽油中富含亞麻酸(約40 g/100 g)，遠遠超過橄欖油(約0.5 g/100 g)、菜籽油(約8.5 g/100 g)等植物油，有研究表明，α-亞麻酸對血脂成分、花生酸合成、免疫功能異常、心血管健康、脂類代謝的基因異常、精神障礙、細胞信號級聯(lián)反應和基因表達等均有重要影響[5-7]。α-亞麻酸的缺乏是導致老年癡呆、心腦血管疾病、高血壓、高脂血癥和糖尿病、癌癥等疾病的重要誘因，可見牡丹籽油是一種很有開發(fā)前景的植物油[8-11]。

甘油三酯是由1個甘油分子和3個脂肪酸分子生成，天然甘油三酯很少含有3個相同的?；舅幔话闶怯啥喾N不同的脂肪酸組成。國外研究表明，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布對于脂肪營養(yǎng)是一個重要的影響因子，決定著甘油三酯的吸收代謝過程及油脂的應用價值[12-14]。故而分析牡丹籽油甘油三酯結(jié)構(gòu)對牡丹籽油對人體的保健功能研究有參考作用。拉曼光譜對有機酸分子具有很好的指紋特性，有快速高效、無污染、無損分析等優(yōu)點，且其特征峰對應于有機分子的官能團，能精確反映官能團的濃度[15]。相比紅外、紫外、熒光、近紅外等光譜分析方法，拉曼光譜應用領(lǐng)域更廣、檢測范圍更寬、靈敏度更高、更快速，無污染[16]。食用油的拉曼光譜信息非常豐富，油脂結(jié)構(gòu)中占有較大比重的不飽和鍵對拉曼光譜中的分子振動有較大貢獻，其信息可于拉曼光譜中清晰表達[17]。

本實驗在分析牡丹籽毛油基本理化特性的同時選用胰脂肪酶對甘油三酯Sn-1,3位進行專一性水解，將Sn-1,3位置上的脂肪酸游離出來，通過薄層層析分離可得到單甘脂。甲酯化后經(jīng)氣相色譜分析可知Sn-2位脂肪酸組成，利用1,3-隨機-2-隨機分布學說可計算出甘油三酯組成[18-20]。利用拉曼光譜測試牡丹籽毛油拉曼光譜特征，分析其分子的官能團結(jié)構(gòu)，以期為牡丹籽油的營養(yǎng)學深入研究和產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘鳳丹’牡丹籽，山東菏澤油用牡丹產(chǎn)業(yè)基地；37種C4-C24脂肪酸甲酯混標(產(chǎn)品編號：18919-1AMP | SUPELCO)，sigma-aldrich公司；豬胰脂肪酶(30 000 u/g，生物試劑純)，上海騰準生物科技有限公司；膽酸鈉(分析純)、柱層析硅膠(100～200目，化學純)，重慶市鈦新化工有限公司；其他實驗室常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀(配有氫火焰檢測器(FID)，日本島津公司；激光顯微拉曼光譜儀，英國Renishaw公司；SB-3200DTDN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；1580型離心機，Gene有限公司；6YZ-160型榨油機，上海亞榮生化儀器廠；GF254高效薄層層析硅膠板(20 cm×20 cm)，北京貝洛生物科技有限公司；硅膠柱(柱長30 cm，內(nèi)徑2 cm)，重慶市鈦新化工有限公司；薄層色譜展開缸(200 mm×200 mm)，上海信誼儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 校準曲線的制作

外標溶液的配制：將8.2 mg標準品溶于2 mLV(石油醚)∶V(乙醚)=1∶1溶劑中，稀釋成質(zhì)量濃度為4.1 g/L的溶液；將此母液依次稀釋為2.05、1.03、0.51、0.26 g/L的混標溶液。將各濃度溶液經(jīng)氣相色譜法分析，對照說明書，計算各脂肪酸甲酯的標準曲線及相關(guān)系數(shù)。

氣相色譜儀條件：檢測器：火焰離子檢測器(FID)；色譜柱：DB-WAX(30 m×0.246 mm×0.25 mm)；升溫程序：185 ℃保持 3min；氣化室250 ℃；進樣溫度250 ℃；載氣：高純氦氣(60 mL/min)，氫氣(40 mL/min)，空氣(400 mL/min)；進樣(1 μL)。

1.3.2 牡丹籽毛油提取

預熱榨油機10 min，稱取顆粒飽滿牡丹籽40 g，分批數(shù)次放入榨油機，初榨油置于離心機5 000 r/min離心10 min，吸取上層油樣用于后續(xù)分析使用。

1.3.3 牡丹籽毛油理化指標測定

酸價參照GB 5009.229—2016 執(zhí)行;皂化值按照GB/T5534—20088 執(zhí)行;過氧化值參照GB 5009.227—2016 執(zhí)行;碘價參照GB/T 5532—2008 執(zhí)行。

1.3.4 牡丹籽油甘油三酯制備

采用硅膠柱分離法：硅膠30 g，用石油醚調(diào)成糊狀填充層析柱。取油樣1 g，溶于15 mL三氯甲烷，加入層析柱，然后用300 mL洗脫液V(石油醚)∶V(乙醚)=9∶1洗脫，流速1～1.5 mL/min。收集液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得純甘三酯，供氣相色譜分析使用。

1.3.5 牡丹籽毛油脂肪酸組成測定

參考并改進室溫甲酯化方法[21]。取80 mg牡丹籽毛油，裝入5 mL離心管，加V(石油醚)∶V(乙醚)=1∶1混合溶液2 mL，稍適振搖，放置40 min。再加1 mL KOH-甲醇(0.4 moL/L)溶液混勻，靜置30 min。沿瓶壁加入1 mL蒸餾水，靜置，待分層后，上機檢測。

1.3.6 胰脂肪酶水解牡丹籽油甘油三酯

稱取0.1 g純化過的甘油三酯于50 mL離心管中，加入胰脂肪酶100 mg及Tris-HCl緩沖液(pH 8)4 mL，搖勻；依次加入1 mL 2 g/L的膽酸鈉溶液及0.4 mL 220 g/L的CaCl2溶液，搖勻，后置于40 ℃的恒溫水浴鍋7 min,并不斷搖動；在40 ℃，18 KHz，80 W超聲波清洗機中超聲12 min，加入6 mol/L的HCl 3 mL并搖勻，加入10 mLV(正己烷)∶V(異丙醇)=9∶1混合液，搖勻，吸取上清液[22]。經(jīng)薄層層析分離，確定甘一酯帶并刮下，用乙醚提取甘一酯后除去溶劑，對甘一酯進行甲酯化后經(jīng)氣相色譜分析Sn-2位脂肪酸組成及含量。利用1，3-隨機-2-隨機分布學說計算甘油三酯的構(gòu)成及含量[23]。

1.3.7 牡丹籽油拉曼光譜分析

儀器預熱穩(wěn)定后，將牡丹籽油樣不經(jīng)任何化學預處理，放入專用液體樣品池。

拉曼光譜測定條件：激光波長：785 nm，光柵：400刻線/mm，光闌：50 μm狹縫，激光能量：10.0 mW；曝光時間：1.00 s，曝光次數(shù)：30，背景曝光次數(shù)：512，物鏡：10×。

1.3.8 甘油三酯分布與組成的計算

根據(jù)牡丹籽油立體專一分布，由Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸組成分析數(shù)據(jù)，采用1,3-隨機-2-隨機分布學說計算各甘三酯組分的含量，如公式(1)所示:

Sn-XYZ/%=R1×R2×R3×10-4

(1)

式中：R1，X酸在Sn-1,3 位的百分含量，%；R2，Y酸在Sn-2位的百分含量，%；R，Z酸在Sn-1,3位的百分含量，%。

如果油脂中含有n種脂肪酸，理論上可以生成n3種甘油三酯。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS進行顯著性檢驗。每組試驗進行3次，結(jié)果用(平均值±標準偏差)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 牡丹籽毛油的理化指標

根據(jù)1.3.3 提供的方法測定牡丹籽油的理化特性指標。如表1所示，牡丹籽油的酸值為(3.54±0.19) mg/g，過氧化值為(0. 19±0.01) g/100 g，符合國標對植物原油的規(guī)定[24]。牡丹籽油皂化值較高，說明牡丹籽油脂肪酸分子量小，易吸收；碘值為(161.80±2.65) g/100 g，說明油的不飽和程度很高，牡丹籽油易被氧化，應注意貯藏條件[25]。

表1 牡丹籽毛油的理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of crude oil ofpeony seed

2.2 甘油三酯脂肪酸組成的定性與定量分析

將牡丹籽油甘三酯樣品甲酯化處理，再進行氣相色譜分析，所得色譜圖見圖1。

a-37種脂肪酸甲酯氣相色譜圖;b-牡丹籽油脂肪酸組成氣相色譜圖圖1 牡丹籽油脂肪酸組成定性分析Fig.1 Qualitative analysis of fatty acid composition ofpeony seed oil

所得圖譜結(jié)合37種脂肪酸甲酯標樣的保留時間與標準曲線定性定量，并將脂肪酸甲酯對照換算系數(shù)換算為脂肪酸含量，結(jié)果如表2所示[26]。此品種牡丹籽毛油的脂肪酸總含量為(89.73±1.89) g/100 g，總不飽和脂肪酸為(77.51±1.51) g/100 g。其主要脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其中三不飽和脂肪酸亞麻酸的含量高達(40.33±1.01) g/100 g，遠高于橄欖油[(0.34g±0.01) g/100 g]及葡萄籽油[(0.21±0.01) g/100 g]等植物油[27-28]。有研究表明，人體每天需攝取6 g亞油酸，牡丹籽油甘三酯中含人體必需脂肪酸亞油酸，其含量為(21.08±0.61) g/100 g[29]。可見牡丹籽油是一種富含亞麻酸，亞油酸的植物油，可以維持人體正常生理代謝。

表2 牡丹籽油脂肪酸組成及定量分析Table 2 Fatty acid composition and quantitative analysis ofpeony seed oil glycerin three fat

2.3 牡丹籽油甘油三酯結(jié)構(gòu)分析

利用氣相色譜法分析牡丹籽油甘三酯的總脂肪酸組成及其Sn-2位脂肪酸組成，根據(jù)脂肪酸甲酯標樣定性，峰面積歸一法定量，得到牡丹籽油的總脂肪酸及Sn-2位脂肪酸含量，所得氣相色譜見圖2，并采用1,3-隨機-2-隨機分布學說計算出甘三酯中Sn-1位、Sn-2位、Sn-3位脂肪酸組成分布，結(jié)果見表3。根據(jù)牡丹籽油立體專一分布，由Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸組成分析數(shù)據(jù)，采用1,3-隨機-2-隨機分布學說計算牡丹籽油主要甘三酯組分的含量，結(jié)果見表4。

由豬胰脂酶水解法測定的牡丹籽油Sn-2位脂肪酸分布表明：Sn-2位脂肪酸主要由棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸組成，其中油酸含量最高，相對百分含量為(48.06±1.41)%，其次為亞油酸，為(24.07±0.63)%，亞麻酸(23.11±0.57)%。研究表明，Sn-2位脂肪酸直接以單甘酯的形式在小腸吸收，吸收效率大于Sn-1,3位脂肪酸。

結(jié)合表3及表4可知，牡丹籽油甘油三酯中有79%的油酸在Sn-2位置，這說明牡丹籽油中的油酸主要選擇性地與Sn-2結(jié)合，Sn-2位油酸以單甘油酯的形式在體內(nèi)被很好地吸收。13.0%的棕櫚酸在牡丹籽油的甘油三酯Sn-2位置。22.0%的硬脂酸在牡丹籽油的甘油三酯Sn-2位置，這表明飽和脂肪酸牡丹籽油通常有選擇性地酯化于Sn-1, 3位。牡丹籽油甘油三酯中有29.03%的亞油酸位于Sn-2位，17.25%的α-亞麻酸酯化在Sn-2位，這表明大多數(shù)亞油酸和α-亞麻酸酸選擇性地結(jié)合到Sn-1,3位。這兩種多不飽和脂肪酸比油酸更容易氧化，其高含量使牡丹籽油更容易氧化變質(zhì)，這個分布不利于保護易氧化的脂肪酸。UUU的含量在79%以上，而SUU的含量在14%左右。牡丹籽油甘油三酯中Sn-LOLn含量最高，為15.64%，其次為Sn-LnOLn，為14.77%。其中Sn-LLLn、Sn-LLnLn、Sn-LnLLn、Sn-LnLnLn的含量約為7%。其余甘油三酯相對較小，含量小于5%。

a-牡丹籽油甘油三酯總脂肪組成氣相色譜圖;b-牡丹籽油Sn-2位脂肪酸組成氣相色譜圖;1-肉豆蔻烷酸甲酯，2-十五烷酸甲酯，3-棕櫚酸甲酯，4-棕櫚油酸甲酯，5-十七烷酸甲酯，6-十七碳烯酸甲酯，7-硬脂酸甲酯，8-油酸甲酯，9-亞油酸甲酯，10-亞麻酸甲酯，11-花生酸甲酯，12-二十碳烯酸甲酯圖2 牡丹籽油甘三酯總脂肪組成及Sn-2位脂肪酸組成氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of total triglyceride composition and Sn-2 fatty acid composition of peony seed oil

表3 牡丹籽油立體專一分布相對百分含量

單位：%

表4 牡丹籽毛油甘油三酯結(jié)構(gòu)及組成分析Table 4 Analysis of structure and composition of glycerolthree fat in peony seed oil

注:UUU，三不飽和脂肪酸甘油三酯；SSU，一不飽和二飽和脂肪酸甘油三酯；SUU，一飽和二不飽和脂肪酸甘油三酯；SSS，三飽和脂肪酸甘油三酯。

2.4 牡丹籽油脂肪酸官能團組成分析

圖3 牡丹籽油的拉曼光譜Fig.3 Raman spectroscopic map of peony seed oil

1 265 cm-1處的特征峰常被用來估計順式不飽和脂肪酸的總含量，如果樣品中存在反式雙鍵，則在這個波段沒有吸收峰[30]。由于在相同波長下，不同植物油拉曼光譜的光譜形態(tài)差異顯著，譜峰得到有效分離，可用于鑒別各類植物油；基于全波段光譜信息和形態(tài)建立的多步聚類分析模型還可準確鑒定各種類型的摻偽植物油[31]。

表5 牡丹籽油拉曼光譜主要特征峰Table 5 Main characteristic peaks of Raman spectraof peony seed oil

3 結(jié)論

牡丹籽毛油脂肪酸組成有12種，主要為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其不飽和脂肪酸含量為(77.51±1.51) g/100 g。

由胰脂酶水解法測定牡丹籽油甘三酯Sn-2位脂肪酸分布表明：亞麻酸、棕櫚酸，硬脂酸主要分布在Sn-1、Sn-3位上；油酸主要分布在Sn-2位上，油酸以單甘油酯的形式在體內(nèi)被很好地吸收。亞油酸在Sn-1、Sn-2、Sn-3位上分布較平均。牡丹籽油甘油三酯中Sn-LOLn含量最高，為15.64%。

牡丹籽油的拉曼光譜表明，牡丹籽油有11個主要特征峰，其分子結(jié)構(gòu)顯著特征是含有酯基及碳碳雙鍵。值得注意的是，1 265 cm-1處的特征峰說明牡丹籽油幾乎不含反式脂肪酸。