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    嚴(yán)格厭氧嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化

    2020-01-13 02:11:42章亭洲朱廷恒王騰浩趙艷沈煒
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年22期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵罐補(bǔ)料梭菌

    章亭洲,朱廷恒,王騰浩,趙艷,沈煒

    1(浙江科峰生物技術(shù)有限公司,浙江 海寧, 314423) 2(浙江工商大學(xué),浙江 杭州, 310018)

    纖維素是自然界中含量最多的一類碳水化合物,也是最廉價(jià)的可再生資源,纖維素主要存在植物細(xì)胞壁中[1]。纖維素酶是能催化水解纖維素生成葡萄糖的一類糖苷水解酶,又稱纖維素酶系[2]。纖維素酶系根據(jù)其功能的差異,主要分為三大類,分別為內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glcanohdrolase,EG)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase,BG),它們?cè)诶w維素的水解過程中協(xié)同作用,高效降解纖維素。EG隨機(jī)水解纖維素非結(jié)晶區(qū)內(nèi)部的糖苷鍵,主要產(chǎn)生纖維糊精和低聚糖。CBH從纖維素鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖。BG水解纖維二糖和寡糖以釋放可發(fā)酵的葡萄糖[2,3]。纖維素酶廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)乙醇、食品、紡織、飼料等行業(yè),我國有豐富的纖維素資源,開發(fā)高效的纖維素酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4]。

    纖維素酶廣泛存在于微生物中,多種產(chǎn)纖維素酶活性較高的微生物已被發(fā)現(xiàn)和工業(yè)化應(yīng)用[5]。因真菌產(chǎn)纖維素酶系較全,分解纖維素能力較強(qiáng),國內(nèi)外對(duì)降解纖維素菌研究多集中于真菌,比較典型的有木霉菌屬木酶屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等[2-6]。

    嗜熱纖維梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermocellum,以下簡稱嗜熱纖維梭菌,俗稱為梭熱桿菌)是一種嗜熱厭氧細(xì)菌,分泌大量纖維素酶,是目前自然界中已知的降解纖維素最高效的微生物之一,是利用纖維素生產(chǎn)生物能源和化學(xué)品的理想菌株[7-8]。嗜熱纖維梭菌中含有催化纖維素降解的纖維小體,它是由若干纖維素酶活性的催化單元與無催化活性的支架蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物,其獨(dú)特的結(jié)構(gòu),使得它可以比真菌纖維素酶更緊密地結(jié)合到纖維素表面,從而高效降解底物[9-12]。嗜熱纖維梭菌產(chǎn)生的纖維素酶耐熱性好,但是由于熱纖梭菌是一種嚴(yán)格的厭氧菌,培養(yǎng)條件極其苛刻,分泌纖維素酶必須在高度厭氧的條件下進(jìn)行,且酶產(chǎn)量相對(duì)較低,我國目前尚未實(shí)現(xiàn)嗜熱纖維梭菌纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn),也很少見到有關(guān)該菌發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝優(yōu)化等基礎(chǔ)研究報(bào)道。

    本文對(duì)從美國羅切斯特大學(xué)引進(jìn)的嗜熱纖維梭菌進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。

    1 材料與方法

    1.1 菌株

    嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)ATCC 27405菌株[13]:由美國羅切斯特大學(xué)化學(xué)工程系J. H. David Wu教授提供。

    1.2 培養(yǎng)基

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g):KH2PO41.5;K2HPO42.9;尿素2.1;MgCl2·6H2O 1.0;CaCl2·2H2O 0.15;FeSO4·7H2O 0.002 5;鹽酸胱氨酸1.0; Resazurin 2.0mg;纖維二糖5.0;嗎啉丙烷磺酸(morpholinopropane sulfonic acid,MOPS) 10.0;酵母提取物 5.0;二水檸檬酸鈉3.0。

    種子培養(yǎng)基(g/L):纖維二糖10,玉米漿12,檸檬酸三鉀鹽2,一水檸檬酸1.25,Na2SO41,KH2PO41,NaHCO32.5,NH4Cl 1.5,尿素5,酵母抽提物l,MgCl2·6H2O 50,F(xiàn)eCl2·4H2O 0.1,MgCl20.2,一水半胱氨酸鹽酸鹽1,二鹽酸吡哆胺0.02,對(duì)氨基苯甲酸0.004,D-生物素0.002,VB120.02,VB10.002,pH值自然。115 ℃濕熱滅菌20 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):纖維二糖10,微晶纖維素10,玉米漿12,檸檬酸三鉀鹽2,一水檸檬酸1.25,Na2SO41,KH2PO41,NaHCO32.5,NH4Cl 1.5,尿素5,酵母抽提物1,MgCl2·6H2O 50,FeCl2·4H2O 0.1, CaCl2·2H2O 0.2,一水半胱氨酸鹽酸鹽1,二鹽酸吡哆胺0.02,對(duì)氨基苯甲酸0.004,D-生物素0.002,VB120.02,VB10.002,pH值自然。115℃濕熱滅菌20min。

    1.3 纖維素酶酶活測定

    酶活測定(濾紙酶活)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[14]。

    取50 mg濾紙(剪成1 cm×6 cm的濾紙條),加1 mL pH 4.8的 50 mmol/L檸檬酸緩沖液,加入適當(dāng)稀釋含酶液(發(fā)酵上清液)0.5 mL,50℃反應(yīng)1 h,加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液,沸水浴5 min,迅速冷卻至室溫,加入20 mL去離子水,混合均勻后測定540 nm處的吸光值??瞻讓?duì)照對(duì)應(yīng)加入500 μL檸檬酸緩沖液(50 mmol/L,pH 4.8)。以上酶活均扣除發(fā)酵液中的還原糖后計(jì)算酶活力,發(fā)酵培養(yǎng)基中的殘留乳糖通過高效液相色譜測定:Bio-Rad HPX-87P 色譜柱,柱溫30 ℃,流動(dòng)相為5 mmol/L的稀硫酸,檢測器為示差檢測器。

    酶活定義為每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位。

    1.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

    1.4.1 菌株活化

    采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化。將配制好的基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基煮沸驅(qū)氧,而后用定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中,每支10 mL,并插入通氮?dú)獾拈L針頭以排除氧氣。此時(shí)可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑刃天青由藍(lán)到紅最后變成無色,說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài),然后,蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋,121℃滅菌20 min后備用。

    將嗜熱纖維梭菌接種到培養(yǎng)管的培養(yǎng)基中,然后將培養(yǎng)管放入60℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 h。

    1.4.2 發(fā)酵條件的探索

    培養(yǎng)管中活化培養(yǎng)后的菌株接種到裝液量60 mL的100 mL厭氧培養(yǎng)瓶中進(jìn)行下列不同發(fā)酵條件的研究。對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH值分別進(jìn)行單因素試驗(yàn),尋找最適條件。

    設(shè)置不同的發(fā)酵溫度,分別為30、40、50、55、60 ℃,發(fā)酵72 h,發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

    設(shè)置不同的培養(yǎng)時(shí)間,分別為24、48、60、72、84、96 h,60℃培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

    設(shè)置不同的培養(yǎng)基初始pH,分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8,發(fā)酵結(jié)束后測定纖維素酶活。

    1.5 發(fā)酵工藝探索

    1.5.1 放大工藝下的纖維素酶發(fā)酵法

    將活化的菌株按照2%的接種量轉(zhuǎn)接到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,55℃恒溫培養(yǎng)24 h,得到一級(jí)種子液。

    發(fā)酵培養(yǎng)基裝入5 L發(fā)酵罐,裝液量3 L,滅菌結(jié)束后,向發(fā)酵罐通入氮?dú)?,除去培養(yǎng)基及罐內(nèi)氧氣。調(diào)節(jié)培養(yǎng)pH恒定為7,罐溫控制為55℃,然后接入一級(jí)種子液,停止通氣,間歇式攪拌發(fā)酵。保持發(fā)酵罐內(nèi)無氧狀態(tài),厭氧發(fā)酵。

    1.5.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶

    1.5.2.1 補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)的確定

    將活化菌株接種到種子培養(yǎng)基中,然后以 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,得到一級(jí)種子液,將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,厭氧培養(yǎng),罐溫控制為55℃,調(diào)節(jié)pH為7,間歇式攪拌。根據(jù)菌體生長情況和糖耗情況,分別在發(fā)酵開始后的16、20、24 h開始向發(fā)酵體系中緩慢添加纖維二糖溶液,流速為6 mL/h,上述纖維二糖溶液質(zhì)量濃度為200 g/L,比較產(chǎn)酶情況。

    1.5.2.2 補(bǔ)料碳源的確定

    將活化的菌株接種到種子培養(yǎng)基中,然后以2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,得到一級(jí)種子液,將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,厭氧培養(yǎng),罐溫控制為55℃,調(diào)節(jié)pH為7,間歇式攪拌。發(fā)酵16~48 h,分別添加纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液,流速為6 mL/L,上述碳源溶液質(zhì)量濃度為200 g/L,發(fā)酵至60 h,比較產(chǎn)酶情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

    嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌,進(jìn)行發(fā)酵條件研究時(shí),保證發(fā)酵的無氧條件,厭氧發(fā)酵。

    不同發(fā)酵溫度下的研究結(jié)果表明,嗜熱纖維梭菌在50~60℃的條件下相對(duì)酶活較高,可達(dá)90%以上,其中55℃時(shí)相對(duì)酶活力最高(圖1)。此溫度與報(bào)道的該菌的嗜熱特征和產(chǎn)纖維素酶的條件相似,因此,利用該菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的最適溫度應(yīng)為55℃。

    圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酶活影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on enzymatic activity

    不同發(fā)酵時(shí)間的結(jié)果表明,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,酶活力呈上升趨勢,發(fā)酵至60 h酶活力達(dá)到峰值,96 h酶活開始下降(圖2)。所以發(fā)酵進(jìn)行60 h后停止,可以大大節(jié)約發(fā)酵成本。

    圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活影響Fig.2 Effect of fermentation time on enzymatic activity

    培養(yǎng)基不同初始pH值的研究結(jié)果表明,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.5~8時(shí),相對(duì)酶活可達(dá)90%以上,最適培養(yǎng)基pH為7(圖3)。按照上述優(yōu)化條件即在55℃,初始培養(yǎng)基pH為7的條件下發(fā)酵60 h,測得酶活為5.12 U/mL,為未優(yōu)化的1.5倍。

    圖3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)酶活影響Fig.3 Effect of initial fermentation pH on enzymatic activity

    2.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

    2.2.1 放大工藝下的纖維素酶發(fā)酵法

    嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌,發(fā)酵放大工藝研究時(shí)維持發(fā)酵罐內(nèi)無氧條件,厭氧發(fā)酵。將保藏的菌株接種到種子培養(yǎng)基中,然后,以 2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,得到一級(jí)種子液,將種子液以5%的接種量接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,厭氧培養(yǎng),罐溫控制為55℃,調(diào)節(jié)pH為7,間歇式攪拌。發(fā)酵60 h酶活為12.37 U/mL。結(jié)果表明,發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)條件下,嗜熱纖維梭菌產(chǎn)纖維素酶酶活顯著高于厭氧瓶條件下的酶活。

    2.2.2 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶的最佳時(shí)間

    首先研究了根據(jù)嗜熱纖維梭菌生長曲線和糖耗的關(guān)系,結(jié)果表明菌體在16 h后進(jìn)入指數(shù)生長期,生物量顯著增加,此時(shí)糖的利用率最大(圖4)。根據(jù)菌體生長和糖耗情況,確定了補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)。分別在發(fā)酵開始后的16、20、24 h開始向發(fā)酵體系中緩慢添加質(zhì)量濃度為200 g/L纖維二糖溶液,流速為6 mL/h。比較產(chǎn)酶情況,發(fā)現(xiàn)0~12 h糖耗和生長情況較緩慢,進(jìn)入16 h后,菌體快速生長和糖耗進(jìn)入快速消耗階段,所以選擇16、20、24 h作為補(bǔ)料點(diǎn)。通過比較了不同補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)酶情況,發(fā)現(xiàn)從16 h的點(diǎn)開始補(bǔ)料,酶活最高,達(dá)到16.38 U/mL(表1)。發(fā)酵48 h后,菌體到達(dá)穩(wěn)定期,糖耗變緩,因此,確定補(bǔ)料時(shí)間為16~48 h。

    圖4 嗜熱纖維梭菌生長和糖耗曲線Fig.4 Curve of growth and glucose use for Clostridium thermocellum

    表1 不同補(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)對(duì)酶活影響Table 1 Effect of different time of carbon addition on enzymatic activity

    2.2.3 補(bǔ)料分批發(fā)酵制備纖維素酶的最佳碳源

    對(duì)幾種可能提高嗜熱纖維梭菌纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)生酶活的碳源進(jìn)行了研究。發(fā)酵16~48 h,分別添加質(zhì)量濃度為200 g/L的纖維二糖、微晶纖維素、木聚糖溶液,流速為6 mL/L,發(fā)酵60 h后,測定酶活。酶活結(jié)果分析比較發(fā)現(xiàn),添加纖維二糖的時(shí)候,酶活最高,達(dá)16.56U/mL(表2)。因此,纖維二糖為分批補(bǔ)料發(fā)酵條件下的最佳補(bǔ)料碳源。

    表2 不同碳源對(duì)酶活影響Table 2 Effect of different carbon sources on enzymatic activity

    3 結(jié)論

    纖維素的分解和利用是當(dāng)今世界研究熱點(diǎn)之一,可以用于生物基能源生產(chǎn)、新型生物工藝和功能產(chǎn)品開發(fā)等,但轉(zhuǎn)化效率很低,高效纖維素酶、纖維小體的研究和開發(fā)應(yīng)用是突破瓶頸的關(guān)鍵[15-16]。纖維素酶已在轉(zhuǎn)化利用含纖維素物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料、食品和飼料原料加工、造紙業(yè)、紡織業(yè)等多個(gè)行業(yè)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[17-19]。目前纖維素酶研究主要集中于真菌,但由于細(xì)菌相對(duì)真菌來說生長速率較高,所產(chǎn)纖維素酶的熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性高,用細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶的優(yōu)勢正在引起更多研究者的關(guān)注[20-22]。

    嗜熱纖維梭菌是嗜熱厭氧細(xì)菌,產(chǎn)生纖維小體,纖維素酶具有耐高溫、催化活性高等明顯的優(yōu)勢[23-25],該菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件探索和優(yōu)化是利用其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的前提。嗜熱纖維梭菌是嚴(yán)格厭氧菌,工業(yè)化生產(chǎn)條件要求苛刻,要確保發(fā)酵罐內(nèi)無氧條件,厭氧發(fā)酵。本文對(duì)該菌在發(fā)酵厭氧瓶水平上進(jìn)行了發(fā)酵條件探索,發(fā)現(xiàn)在55℃,初始培養(yǎng)基pH為7、發(fā)酵60 h為最佳條件,此時(shí)測得酶活為5.12 U/mL。此外,在放大的發(fā)酵罐水平上進(jìn)行了發(fā)酵工藝探索和優(yōu)化,根據(jù)菌體生長情況對(duì)分批發(fā)酵條件下的補(bǔ)料時(shí)間和添加碳源進(jìn)行了研究,放大和優(yōu)化后,該菌產(chǎn)纖維素酶的酶活由5.12 U/mL提高到16.56 U/mL,效果極顯著。研究結(jié)果為進(jìn)一步規(guī)?;墓I(yè)化生產(chǎn)降低成本和設(shè)計(jì)工藝提供了參考依據(jù)。

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