啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌種特異性檢測體系的建立與應(yīng)用

曹偉華，羅娜，孫義玄，涂京霞，劉靜，王德良，郝建秦，欒春光*，包怡紅

1(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150040) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)3(廣州南沙珠江啤酒有限公司，廣東 廣州，511462)

啤酒是世界上最受歡迎的酒精飲料之一。盡管工業(yè)生產(chǎn)中對微生物污染高度重視，但由于啤酒微生物的高度適應(yīng)性，微生物污染的情況仍時(shí)有發(fā)生，這給啤酒生產(chǎn)企業(yè)帶來了極大的困擾[1]。

啤酒中的腐敗菌種類較多，以乳酸菌為主。近年，啤酒中發(fā)現(xiàn)的1個新啤酒腐敗菌菌種——耐乙酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)，因其特殊的生理特性引起了人們的關(guān)注[2]。啤酒中的耐乙酸乳桿菌保持了乳桿菌的菌種特性，以乳酸、醋酸和雙乙酰為糖酵解終產(chǎn)物，大量的雙乙酰使啤酒產(chǎn)生了令消費(fèi)者不愉快的黃油味和油膩的口感，嚴(yán)重影響了啤酒的品質(zhì)；同時(shí)，該菌具有在一般營養(yǎng)條件下不易培養(yǎng)的生理特性，國標(biāo)等常規(guī)方法難以檢測到此菌，出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3]。這使得啤酒在貯存或銷售環(huán)節(jié)易出現(xiàn)質(zhì)量問題，嚴(yán)重影響產(chǎn)品形象和企業(yè)聲譽(yù)。

基于微生物檢測技術(shù)的快速發(fā)展，除常規(guī)的檢測方法外，蛋白質(zhì)和核酸等分子檢測手段也得到廣泛應(yīng)用。其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polmerase chain reaction, PCR)技術(shù)以其較高的靈敏性和準(zhǔn)確性在啤酒腐敗菌檢測中得到普遍認(rèn)可[4]。PCR檢測多以啤酒腐敗菌某些特定的靶標(biāo)進(jìn)行檢測，包括16SrDNA通用引物和四聯(lián)球菌特異性引物等[5-7]；或利用某些特殊抗性基因，如酒花抗性基因horA[8]、horB[9]或horC[10-11]進(jìn)行跨種屬檢測，以實(shí)現(xiàn)對啤酒腐敗菌的快速檢測。但對于新出現(xiàn)的啤酒污染菌仍然需要建立對應(yīng)的檢測方法，以實(shí)現(xiàn)對其進(jìn)行有效的監(jiān)控[12]。因此本研究以建立啤酒中耐乙酸乳桿菌種特異性檢測體系為切入點(diǎn)，建立特異性的檢測體系，以實(shí)現(xiàn)對啤酒生產(chǎn)過程質(zhì)量檢測和對出廠啤酒提供必要的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

2-16N高速微量離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；NanoDrop One，賽默飛世爾儀器有限公司；ABI7500 real time PCR system，美國ABI公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；BX51顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；LRH-250培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BC-C57PCR儀，北京天林恒泰科技有限公司；BG-sub MIDI多用途水平電泳儀、Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

NBB-P培養(yǎng)基，德樂公司；KK4601 KAPA SYBR FAST試劑盒，KAPA BIOSYSTEMS；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2 本研究中使用的菌株

本研究中使用的菌株均分離自出現(xiàn)混濁、異味或產(chǎn)生沉淀的啤酒樣品，共分離鑒定了12株啤酒腐敗菌，菌株信息見表1。所有菌株均采用平板分離后再進(jìn)行厭氧培養(yǎng)[13-14]。

表1 本研究中分離和使用的啤酒腐敗菌菌株Table 1 Beer spoilage strains isolated and used in the study

1.3 引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

1.3.1 耐乙酸乳桿菌特異性基因的篩選與引物設(shè)計(jì)

目前開放的GenBank數(shù)據(jù)庫中僅有一株較為完整的耐乙酸乳桿菌的基因組數(shù)據(jù)，其余均為基因組草圖[15-16]。研究中根據(jù)以上數(shù)據(jù)和預(yù)測的蛋白質(zhì)信息，利用Mauve軟件比對GenBank中23株耐乙酸乳桿菌基因組，從中篩選出10個耐乙酸乳桿菌較為特異的基因編碼區(qū)片段，然后將基因編碼序列與數(shù)據(jù)庫中的微生物序列進(jìn)行BLAST比對，在比對結(jié)果中排除具有較多相似菌株且相似度較高的基因序列，保留比對結(jié)果中只有耐乙酸乳桿菌的特異性基因序列，以此篩選出耐乙酸乳桿菌特有的基因作為檢測的備選基因用于后續(xù)研究。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

下載篩選到的目的基因序列，使用Primer premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物長度18～24 bp，GC含量40%～60%，目標(biāo)產(chǎn)物在130 bp～300 bp，Tm值在55～60℃，設(shè)計(jì)完成后登錄在線引物設(shè)計(jì)工具[17-18]，在模板輸入框中分別輸入引物上下游序列，在線檢測合成產(chǎn)物。

1.4 擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件

將設(shè)計(jì)好的引物送上海生工生物有限公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL，包括上下游引物各0.4 μL(200 nmol/L)，基因組DNA為1.0 μL(1 ng/μL)，2×mix10 μL，50×ROX 0.4 μL，無菌水定容到20 μL；反應(yīng)條件見表2。

1.5 耐乙酸乳桿菌定性檢測

1.5.1 引物特異性驗(yàn)證

表2 耐乙酸乳桿菌種特異性PCR反應(yīng)條件Table 2 Speceis-specific PCR reaction conditions

以提取的啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌基因組DNA為模板，使用設(shè)計(jì)的10對耐乙酸乳桿菌引物分別對每種菌的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，篩選特異性最佳的耐乙酸乳桿菌引物用于后續(xù)混合菌中耐乙酸乳桿菌的定性和定量檢測[19-20]。

1.5.2 混合菌中耐乙酸乳桿菌的定性檢測

以本研究中使用的12株啤酒腐敗菌的基因組DNA混合物作為模板，檢測篩選的特異性引物在混合菌中耐乙酸乳桿菌的檢出情況[21]。

1.5.3 同種屬耐乙酸乳桿菌的檢測

以同種屬的耐乙酸乳桿菌2011-3(2011年3月在8°純生啤酒中回收樣品中檢出)與2011-8(2011年8月在10°純生微檢留樣中檢出)的DNA為模板，檢測引物特異性。

1.6 耐乙酸乳桿菌特異性探針的定量檢測

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒，提取耐乙酸乳桿菌的菌懸液(1.0×108CFU/mL)基因組。經(jīng)10倍系列梯度稀釋，得到耐乙酸乳桿菌不同DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。再以該標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用篩選到的特異性耐乙酸乳桿菌引物進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，建立耐乙酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性方程，用于后續(xù)的實(shí)際樣品檢測[22]。

1.7 耐乙酸乳桿菌特異性探針的最低檢出限

將培養(yǎng)好的耐乙酸乳桿菌按照10倍系列梯度稀釋后，分別接種到NBB-B液體培養(yǎng)基中，26 ℃厭氧培養(yǎng)2 d，提取基因組。利用優(yōu)化的種特異性引物對目標(biāo)菌上機(jī)檢測，比對確認(rèn)樣品中耐乙酸乳桿菌的菌量與實(shí)際值之間的差異，完成樣品中耐乙酸乳桿菌的種特異性定性和定量檢測。

1.8 耐乙酸乳桿菌特異性引物檢測實(shí)際樣品

跟蹤生產(chǎn)上的20批樣品，利用膜過濾(0.45 μm)富集啤酒樣品中的微生物。然后，將抽濾膜置于NBB-B培養(yǎng)基中，26 ℃厭氧培養(yǎng)2 d，取10 mL菌液提取基因組DNA，然后使用本研究方法進(jìn)行檢測。同時(shí)，對陽性樣品進(jìn)行菌株分離，然后送往華大基因公司進(jìn)行測序，對比本研究建立的方法與實(shí)際樣品的一致性。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物篩選和定性檢測

2.1.1 耐乙酸特異性引物的篩選

按照1.3的方法，初步篩選10個基因作為備選靶標(biāo)用于啤酒中耐乙酸乳桿菌的種特異性檢測。以啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌CN247基因組DNA為模板，經(jīng)RT-qPCR擴(kuò)增后，剔除產(chǎn)生非特異性片段的引物，最終確定了3對特異性強(qiáng)的引物，引物序列如表3所示。

表3 本研究篩選的啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌的特異性引物序列Table 3 Specific primer sequence for Lactobacillus acetotolerans

2.1.2 耐乙酸乳桿菌特異性引物定性檢測單一DNA模板的結(jié)果

以本研究中12株菌的基因組為模板，分別用YW5、YW6和YW7三對耐乙酸乳桿菌特異性引物進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，以確認(rèn)3對引物對耐乙酸乳桿菌檢測的特異性。YW5、YW6和YW7特異性引物的RT-qPCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線如圖1所示。

圖1 YW5、YW6和YW7引物在RT-qPCR上檢測單一DNA的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve of detection of single DNA by YW5,YW6 and YW7 primers on RT-qPCR

如圖1所示，使用1.4的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，YW5、YW6和YW7三對引物只有在擴(kuò)增耐乙酸乳桿菌CN247時(shí)分別出現(xiàn)了對應(yīng)的擴(kuò)增曲線，其余菌株均無擴(kuò)增曲線；同時(shí)，對應(yīng)的熔解曲線出現(xiàn)單一尖銳的峰，沒有雜峰，說明在本研究的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，3對引物對于耐乙酸乳桿菌菌種CN247檢測具有特異性，參照Ct值和熔解曲線可將CN247與其他11株腐敗菌區(qū)分開來，因此這3對引物可以作為CN247的特異性引物用于12種啤酒腐敗菌中耐乙酸乳桿菌菌種的定性檢測。

2.1.3 耐乙酸乳桿菌特異性引物定性檢測混合DNA模板

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選引物的特異性，研究中將12個菌種的基因組混合后作為模板，利用篩選的3對引物對目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

圖2 YW5、YW6和YW7引物在RT-qPCR上檢測混合DNA的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.2 Amplification curve and melting cuve of detection of mixed DNA by YW5、YW6 and YW7primers on RT-qPCR

如圖2所示，在分別使用3對特異性引物對混合DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，在多個復(fù)雜模板及近緣乳酸菌菌種存在的情況下，檢測體系只對耐乙酸乳桿菌的檢測具有種特異性，說明引物特異性良好。

2.1.4 耐乙酸乳桿菌特異性引物定性檢測同種屬其他耐乙酸乳桿菌

為了進(jìn)一步驗(yàn)證設(shè)計(jì)的特異性引物對另外2株鑒定的耐乙酸乳桿菌2011-3和2011-8檢測的有效性，使用其中1對引物YW5對測試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。

RT-qPCR測試結(jié)果表明，檢測的2株菌2011-3與2011-8為耐乙酸乳桿菌，與分子鑒定的結(jié)果相同。說明設(shè)計(jì)的引物對耐乙酸乳桿菌菌種具有種特異性。

因此，以分離到的12株啤酒污染菌基因組為模板，無論是單一菌DNA還是混合菌的DNA，通過YW5、YW6和YW7三對引物在RT-qPCR上擴(kuò)增后，均能對樣品中的耐乙酸乳桿菌檢測出唯一的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，同時(shí)也能對耐乙酸乳桿菌的菌種進(jìn)行種特異性有效檢出，表明了3對引物的特異性符合檢測耐乙酸乳桿菌的檢測要求。

2.2 定量檢測結(jié)果

2.2.1 耐乙酸乳桿菌DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以108CFU/mL耐乙酸乳桿菌提取的基因組為基礎(chǔ)，通過10倍梯度稀釋的DNA為模板，以特異性引物YW5對不同梯度的耐乙酸乳桿菌基因組DNA擴(kuò)增，建立耐乙酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。

圖3 YW5引物在RT-qPCR上檢測耐乙酸乳桿菌2011-3和2011-8的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig 3 Amplification curve and melting cuve of detection of strain 2011-3 and 2011-8 by YW5 primer on RT-qPCR

圖4 耐乙酸乳桿菌DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of Lactobacillus acetotoleransDNA

如圖4所示，7個濃度梯度的耐乙酸乳桿菌DNA樣品擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足誤差范圍，其對應(yīng)的回歸方程y=-3.344X+33.56，R2>0.99，線性關(guān)系良好，滿足后續(xù)對標(biāo)的需要。

2.2.2 標(biāo)曲的重復(fù)性和再現(xiàn)性驗(yàn)證

選取3人分別使用新開發(fā)的耐乙酸乳桿菌特異性探針YW5，驗(yàn)證定量標(biāo)曲(從DNA稀釋至上機(jī)為一次操作)的重復(fù)性和再現(xiàn)性，每人做6次標(biāo)曲，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

如表4所示，每個人測試6次標(biāo)曲斜率的重復(fù)性RSD均在5%以內(nèi)，3人測試標(biāo)曲的再現(xiàn)性RSD為3.94%，在5%的合格范圍內(nèi)，說明標(biāo)曲的重復(fù)性和再現(xiàn)性良好，可以用于實(shí)際的檢測。

2.2.3 耐乙酸乳桿菌的最低檢出限

為了進(jìn)一步確定耐乙酸乳桿菌特異性引物的最低檢出限，將濃度1×108CFU/mL的耐乙酸乳桿菌CN247的原始菌液10倍梯度稀釋，并以最后3個梯度分別進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，26℃厭氧培養(yǎng)2 d。再對各梯度的菌液平板計(jì)數(shù)，確定樣品培養(yǎng)前后的菌體濃度。培養(yǎng)后的菌液分別取10 mL菌液提取DNA后在RT-qPCR進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。

不同梯度接種的樣品經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2 d后，取10 mL預(yù)培養(yǎng)液提取的基因組DNA中均可以檢測到目標(biāo)菌。其中，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的最低稀釋度的4號樣品平板檢測結(jié)果為11 CFU/mL。因在提取DNA做RT-qPCR時(shí)使用的是10 mL菌液，故上機(jī)檢測出來4號樣品對應(yīng)的菌數(shù)為102CFU/mL。因此，新開發(fā)的特異性探針對耐乙酸乳桿菌的最低檢出限為102CFU，檢測精度為101CFU/mL。

表4 標(biāo)曲的重復(fù)性和再現(xiàn)性結(jié)果Table 4 Repeatability and reproducibility results offstandcurve

表5 不同梯度CN247培養(yǎng)2 d后的菌液使用特異性探針RT-qPCR測試結(jié)果Table 5 The results of RT-qPCR using the special probeto detecting the suspension of CN247 after cultivation

注：“+”表示結(jié)果正常，判定為陽性。

2.3 實(shí)際樣品的檢測

應(yīng)用本研究開發(fā)的耐乙酸乳桿菌特異性引物檢測生產(chǎn)上預(yù)培養(yǎng)2 d的20批樣品，并同時(shí)進(jìn)行菌株分析后的樣品測序?qū)Ρ冉Y(jié)果如表6所示。

表6 樣品分離鑒定后的測序結(jié)果與新開發(fā)探針方法檢測結(jié)果Table 6 Sequencing results of isolated and identified sample and test results of newly developed method

注: “+”表示NBB-B液體培養(yǎng)基變色，判定為陽性；“-”表示不變色或未檢測到，判定為陰性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，檢測的20批生產(chǎn)樣品經(jīng)預(yù)培養(yǎng)2 d后，只要樣品中含有耐乙酸乳桿菌且達(dá)到檢出限的樣品，均可以使用本研究開發(fā)的方法進(jìn)行有效檢測。結(jié)果表明，本研究開發(fā)的耐乙酸乳桿菌特異性探針對實(shí)際樣品中的耐乙酸乳桿菌檢測具有特異性及準(zhǔn)確性，檢出效率為100%。

3 結(jié)論

本研究以耐乙酸乳桿菌3個種特異性基因?yàn)榘心繕?biāo)，成功設(shè)計(jì)并優(yōu)化了3對種特異性引物用于啤酒腐敗菌耐乙酸乳桿菌的檢測。建立了基于SYBR GREEN實(shí)時(shí)熒光定量種特異性PCR方法及耐乙酸乳桿菌定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了對耐乙酸乳桿菌的定性與定量檢測。定量檢測的最低檢測限為102CFU/mL，精度為10 CFU/mL。實(shí)際樣品經(jīng)富集培養(yǎng)2 d后，可以滿足PCR檢測需求，整個檢測時(shí)間可控制3 d以內(nèi)，特異性探針對生產(chǎn)上含有耐乙酸乳桿菌樣品的檢出率為100%。本研究開發(fā)的方法滿足了啤酒生產(chǎn)企業(yè)對出廠產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制的要求，為啤酒或其他食品中新發(fā)現(xiàn)的污染微生物檢測提供了借鑒。