酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷制備稀有人參皂苷C-K

王彩艷,劉春瑩,肖永坤,左康澤，陳雙,徐龍權(quán),宋建國,魚紅閃*

1(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116034)2(大連大學(xué)，遼寧 大連，116622) 3(葵花藥業(yè)集團(天津)藥物研究院，天津，300457)

三七為常用的貴重中藥，但其入藥部位大多為其根部，其莖葉部分還沒有得到充分利用。在三七莖葉中總皂苷含量為5%(質(zhì)量分數(shù))以上，其中主要為Rb3、C-Mx1、Fa、Rc、Fc、Rd、Rb1、Gyp17等人參二醇類皂苷，它們含有相同的人參二醇苷元非糖基部分，但是帶有不同的3-O-和20-O-糖基[1-3]，故導(dǎo)致其功效有所差異。三七莖葉總皂苷中含量高的Rb1、Rc等分子，由于帶多個糖基，故生理活性很低，但口服后能在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為低糖基的皂苷C-K等，但是這種轉(zhuǎn)化非常微弱，而且大部分很難被利用[4-5]。與三七莖葉總皂苷含有相同苷元的人參稀有皂苷C-K、Rg3、Rh2等，具有很好的抗癌、抗血栓、抗炎、抗皮膚老化以及治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病等功效，對醫(yī)藥、保健食品、化妝品的生產(chǎn)意義很大[6-10]。

為了從低活性的三七莖葉總皂苷中生物轉(zhuǎn)化得到高活性人參稀有皂苷，柴瑞華等用酶法將三七莖葉總皂苷轉(zhuǎn)化制備人參稀有皂苷C-K，但是其轉(zhuǎn)化得率很低[11-12]。本實驗室相繼報道了4種人參皂苷糖苷酶：即轉(zhuǎn)化原人參二醇類皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rd的第3(碳)-O-和20(碳)-O-多種糖基的人參皂苷糖苷酶I型[13-15]；轉(zhuǎn)化原人參二醇類皂苷的20-O-多種糖基的人參皂苷酶Ⅱ型[16]；克隆在E.coliC41(DE3)菌種中表達的人參皂苷酶Ⅲ型，能轉(zhuǎn)化原人參二醇類皂苷的3-O-多種糖基[17]，能轉(zhuǎn)化原人參三醇類皂苷的6-O-多種糖基的人參皂苷糖苷酶Ⅳ型[18]。本實驗室也報道了不同菌來源的人參皂苷糖苷酶I型[13-15]，雖然都能轉(zhuǎn)化原人參二醇類皂苷第3(碳)-O-和20(碳)-O-多種糖基，但是在個別性質(zhì)上有所差異。如來源于A.nigersp.G4菌的酶(分子質(zhì)量80kDa)，能轉(zhuǎn)化人參二醇類皂苷變成F2、C-K和少量的Rh2[13]；來源于A.nigersp.G8菌的酶(分子質(zhì)量75 kDa)，經(jīng)2個途徑轉(zhuǎn)化人參二醇類皂苷Rb1和Rb3的3-O-和20-O-糖基，即Rb1→Rd→F2→C-K和Rb1→Gyp17→Gyp75→C-K途徑；Rb3→C-Mx1→C-Mx→C-K和Rb3→Rd→F2→C-K途徑[14]；也報道過利用來源于A.nigersp.G8菌的人參皂苷糖苷酶I型，生物轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷制備高生理活性的稀有皂苷C-K、C-Mx[19-20]；但是，上述研究的C-K轉(zhuǎn)化得率低，并且反應(yīng)后殘留中間產(chǎn)物C-Mc。

本文為了提高三七莖葉總皂苷的C-K轉(zhuǎn)化得率，嘗試了3種菌來源的人參皂苷酶、混合酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷，并對其酶反應(yīng)條件進行優(yōu)化，為充分利用三七莖葉總皂苷提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七莖葉總皂苷，遼寧桓仁陽光保健品公司；人參皂苷對照品Rb3、C-Mx1、Rc、Rb1、Rd等，天津天宿光華健康科技公司；人參皂苷對照品C-K、C-Mx、C-Mc、R7、Fc等，由本實驗室提供(全部經(jīng)國家電化學(xué)和光譜研究中心以核磁共振核對結(jié)構(gòu))[19-20]。Aspergillusnigersp.G4菌[13]、Aspergillusnigersp.G8菌[14]、Aspergillusoryzaesp.G9菌[18]，從大曲中篩選；AB-8大孔吸附樹脂、D-280離子交換樹脂，天津興南允能高分子技術(shù)有限公司；薄層層析板Silica gel 60-F254，德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜分析儀(帶Waters2996光電二極管陣列(PDA)檢測器及Empower色譜工作站)，Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶液制備

配制150 mL 50 g/L麥芽汁中加入0.5 g/L的三七莖葉總皂苷的溶液，共制備30瓶，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，冷卻至室溫。經(jīng)嚴格無菌操作，A.nigersp.G4菌、A.nigersp.G8菌和A.oryzaesp.G9菌各接種10瓶；在30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，將發(fā)酵培養(yǎng)好的150 mL發(fā)酵液，用高速冷凍離心機在8 000 r/min下離心15 min，去除菌體，收集上清液；在磁力攪拌條件下，緩慢加入已研磨好的硫酸銨粉末至80%飽和度，于4 ℃下靜置4 h。再用高速冷凍離心機在13 000 r/min下離心20 min，棄上清，收集蛋白質(zhì)沉淀。沉淀用10 mL、20 mmol/L、pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，然后裝入透析袋，用相同緩沖液透析24 h，約每2 h更換一次緩沖液。透析結(jié)束后，用高速冷凍離心機在13 000 r/min下離心10 min，除去不溶性雜蛋白，所得上清液即為粗酶液。

1.3.2 酶反應(yīng)方法

取0.1 mL酶液與0.1 mL 50 g/L的三七莖葉總皂苷底物溶液，加入1.5 mL離心管中，混合均勻，在45 ℃下反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后，加入0.2 mL水飽和正丁醇，混合均勻后離心，取正丁醇層溶液采用1.3.4中的TLC方法進行定性分析，取正丁醇層溶液濃縮蒸干后采用1.3.5中HPLC法進行定量分析。

C-K產(chǎn)率的計算方法如公式(1)所示：

(1)

式中：PC-K-酶反應(yīng)產(chǎn)物進行HPLC分析，根據(jù)對照品C-K的回歸方程計算出產(chǎn)物中C-K的含量;S-酶反應(yīng)中底物(三七莖葉總皂苷)的含量。

1.3.3 C-K等稀有皂苷的制備

稱取50.0 g三七莖葉總皂苷，溶于1 000 mL 20 mmol/L pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液中，然后加入1 000 mL酶液混合，置于反應(yīng)釜中，在45℃下反應(yīng)24 h時。反應(yīng)結(jié)束后，加入6 000 mL 950 g/L乙醇沉淀酶，并在13 000 r/min下離心20 min，取上清液濃縮，去除溶液中的乙醇，得到粗產(chǎn)品濃縮液。上述粗產(chǎn)品的濃縮液經(jīng)預(yù)先處理好的1 000 mL AB-8大孔吸附樹脂柱反復(fù)吸附后(重復(fù)吸附3～4次，使皂苷充分吸附)，用6倍柱體積的去離子水洗脫去除糖等雜質(zhì)，再用5倍柱體積的840 g/L乙醇溶液洗脫皂苷，其洗脫液再經(jīng)D-280樹脂柱脫色，減壓濃縮、干燥，得到三七莖葉總皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合皂苷[19-20]。

1.3.4 薄層層析法[21](thin layer chrmatographic,TLC)

薄層層析板采用Silica gel 60-F254，展開劑比例為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水) = 7∶2.5∶0.5，顯色劑為10% H2SO4溶液。

1.3.5 高效液相色譜(HPLC)

色譜條件[21]：采用Waters 2695高效液相色譜分析儀，Waters 2996光電二極管陣列(PDA)檢測器及Empower色譜工作站；色譜柱：Hypersil C18柱(5 μm，φ 4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈(A)-水(B)：0～20 min，20%A等度；20～31 min，20%A～32%A線性梯度，31～40 min，32%A～43%A線性梯度；40～70 min，43%A～100%A線性梯度；進樣量：10 μL；柱溫：35℃；體積比流速：0.6 mL/min；檢測波長：203 nm。

待測樣品的溶液配制：稱取三七莖葉總皂苷4 mg，加1 mL色譜級甲醇充分溶解，待用；取4 mg酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，充分溶解于1 mL色譜級甲醇溶液中，待用；分別精密稱取對照品人參皂苷Rb1、R7、Fc、Rc、Rb3、Rd、C-Mx1、C-K、C-Mc和C-Mx，分別配制成1 g/L色譜級甲醇溶液，待用；上述配置待用的樣品溶液，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后，進行HPLC分析。

1.3.6 C-K標準曲線及回歸方程

取上述配制好的對照品C-K溶液適量，加入適量的色譜級甲醇等倍稀釋成5個濃度的對照液，分別取10 μL按1.3.5色譜條件進樣分析，以對照品質(zhì)量濃度為X坐標，面積值為Y坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，回歸方程為Y=3.72×106X-1.44×104，相關(guān)系數(shù)為0.999 2。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七莖葉總皂苷的組成成分分析

市銷的三七莖葉總皂苷的組成，因廠家、生產(chǎn)批次的不同，而有所差別。對本溪陽光保健品公司的三七莖葉總皂苷產(chǎn)品和人參皂苷產(chǎn)品進行高效液相色譜分析，其結(jié)果如圖1、圖2、表1所示。

1-人參皂苷Rb1；2-人參皂苷Fc；3-人參皂苷Rc；4-人參皂苷Rb3；5-人參皂苷R7；6-人參皂苷Rd；7-人參皂苷C-Mx1；8-人參皂苷C-Mc；9-人參皂苷C-Mx；10-人參皂苷C-K圖1 人參皂苷對照品的HPLC圖譜Fig.1 The HPLC of ginsenoside standards

圖2 市銷三七莖葉總皂苷的HPLC圖譜Fig.2 The HPLC of notoginseng stem-leaf ginsenosides

表1 三七莖葉總皂苷中各組分的含量Table 1 Contents of each component in total saponins of Panax notoginseng

由圖2和圖1比對可知，市銷的三七莖葉總皂苷中含有皂苷：Fa、Rb1、Fc、Rc、Rb2、Rb3、R7、Rd、Gyp17、C-Mc1和C-Mx1共11種。把HPLC圖中各皂苷的峰面積比近似認為各皂苷的含量比[20]，則各皂苷的質(zhì)量分數(shù)為Fa 7.18%、Rb1 5.19%、Fc 10.25%、Rc 12.73%、Rb3 26.38%、R7 1.42%、Rd 3.51%、Gyp 17 2.30%、C-Mc1 6.50%、C-Mx1 14.28%，即在三七莖葉總皂苷中含量最高的是Rb3，其次是C-Mx1。

2.2 三七莖葉總皂苷的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)

取A.nigersp.G4菌、A.nigersp.G8菌和A.oryzaesp.G9菌所產(chǎn)酶以及它們兩者的等體積混合液各0.1 mL，分別與0.1 mL 50 g/L三七莖葉總皂苷溶液混合，在pH 5.0、45℃下反應(yīng)24 h；加0.2 mL水飽和正丁醇，混合均勻后離心，上清液采用TLC法進行定性分析,結(jié)果如圖3所示。

NGL-三七莖葉總皂苷；C-K、C-Mc、C-Mx、R7、Fc-人參皂苷對照品；1-A. niger sp.G4菌所產(chǎn)酶和A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶液；2-A. niger sp.G4菌所產(chǎn)酶和A. oryzae sp.G9菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶液；3-A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶和A. oryzae sp.G9菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶液；4-A. niger sp.G4菌所產(chǎn)酶；5-A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶；6-A. oryzae sp.G9菌所產(chǎn)酶圖3 酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的TLC圖Fig.3 Enzyme on notoginseng stem-leaf in TLC

由圖3可知，A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶和A.nigersp.G4菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶液轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷生成C-K的效果最好，其次為A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶；而A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶和A.oryzaesp.G9菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶、A.nigersp.G4菌所產(chǎn)酶和A.oryzaesp.G9菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶、A.oryzaesp.G9菌所產(chǎn)酶、A.nigersp.G4菌所產(chǎn)酶對三七莖葉總皂苷的轉(zhuǎn)化效果差。因此本文采用了A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶和A.nigersp.G4菌所產(chǎn)酶的等體積混合酶(以下簡稱G8-G4混合酶)，以及A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷制備稀有皂苷C-K。

2.3A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶和G8-G4混合酶的最佳酶反應(yīng)條件

2.3.1 反應(yīng)時間的優(yōu)化

G8-G4混合酶與三七莖葉總皂苷溶液等體積混合，在底物質(zhì)量濃度25 g/L，pH 5.0，45 ℃下反應(yīng)3、6、9、12、24、36、48 h，反應(yīng)結(jié)束后，分別取樣0.2 mL，與0.2 mL水飽和正丁醇混合，混合均勻后離心，取正丁醇層用TLC法進行定性檢測，并采用HPLC法進行定量分析，TLC結(jié)果如圖4所示。

NGL-三七莖葉總皂苷；C-K、C-Mc、C-Mx、R7、Fc、C-Mx1-人參皂苷對照品；1、2、3、4、5、6、7-3、6、9、12、24、36、48 h圖4 不同時間對G8-G4混合酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的影響Fig.4 Reaction time effect on the hydrolysis of notoginseng stem-leaf ginsenosides by enzyme mixture of A. niger sp.G8 and A. niger sp.G4 strains

由圖4可知，G8-G4混合酶與三七莖葉總皂苷的反應(yīng)，隨時間的延長C-K產(chǎn)率越來越高，當反應(yīng)進行到24 h，C-K產(chǎn)率達到28.6%(質(zhì)量分數(shù))。同理，A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶的反應(yīng)時間優(yōu)化表明，反應(yīng)24 h，C-K產(chǎn)率最高，為22.4%(質(zhì)量分數(shù))。

2.3.2 酶反應(yīng)溫度和pH的優(yōu)化

G8-G4混合酶液與三七莖葉總皂苷溶液等體積混合，反應(yīng)溫度分別設(shè)在35、40、45、50、55、60 ℃，底物質(zhì)量濃度25 g/L，pH 5.0，反應(yīng)24 h。結(jié)果如圖5所示。G8-G4混合酶與三七莖葉總皂苷溶液等體積混合，反應(yīng)pH值設(shè)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，底物質(zhì)量濃度為25 g/L，45 ℃反應(yīng)24 h。結(jié)果如圖6所示。

圖5 溫度對酶反應(yīng)生成C-K的影響Fig.5 The effects of temperature on enzyme reaction to C-K

圖6 pH對酶反應(yīng)生成C-K的影響Fig.6 the effects of pH on enzyme reaction to C-K

由圖5可知，G8-G4混合酶與三七莖葉總皂苷在45℃條件下反應(yīng)后，C-K的產(chǎn)率最高，達27.68%(質(zhì)量分數(shù))，由圖6可知，在pH 5.0條件下，G8-G4混合酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的C-K產(chǎn)率最高，為21.56%(質(zhì)量分數(shù))。故G8-G4混合酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的最佳反應(yīng)條件為pH 5.0，45℃，底物質(zhì)量濃度25 g/L，反應(yīng)24 h。

A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶與三七莖葉總皂苷溶液等體積混合，反應(yīng)溫度分別設(shè)在：35、40、45、50、55、60℃，底物質(zhì)量濃度25 g/L，pH 5.0，反應(yīng)24 h。結(jié)果如圖7所示。A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶與三七莖葉總皂苷溶液等體積混合，反應(yīng)pH設(shè)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，45℃，底物質(zhì)量濃度25 g/L，反應(yīng)24 h。結(jié)果如圖8所示。

圖7 溫度對酶反應(yīng)生成C-K的影響Fig.7 The effects of temperature on enzyme reaction to C-K

圖8 pH對酶反應(yīng)生成C-K的影響Fig.8 the effects of pH on enzyme reaction to C-K

由圖7可知，A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶與三七莖葉總皂苷在45℃反應(yīng)后，C-K的產(chǎn)率最高，達19.67%；由圖8可知，A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的pH為5.0時，C-K產(chǎn)率最高，為20.08%。故A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的最佳反應(yīng)條件為pH 5.0，45℃，底物質(zhì)量濃度25 g/L，反應(yīng)24 h。

2.3.3 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC檢測

用HPLC法檢測三七莖葉總皂苷經(jīng)G8-G4混合酶和A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物，如圖9及表2所示。

A-G8-G4混合酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物；B-A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物圖9 G8-G4混合酶和A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的HPLC圖Fig.9 Enzyme from G8-G4 enzyme mixture and G8 strains hydrolysis on notoginseng stem-leaf ginsenoside in HPLC注：反應(yīng)時間為24 h。

表2 G8-G4混合酶、A. niger sp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物皂苷比較Table 2 Products from notoginseng stem-leaf ginsenosides by the G8-G4 enzyme mixture, A. niger sp.G8 enzyme

由圖9和表2可知，A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物有5種：C-K、C-Mx、Fc、R7、C-Mc；而G8-G4混合酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物有4種：C-K、C-Mx、Fc、R7。

分析得知，三七莖葉總皂苷中的部分皂苷經(jīng)酶催化降解3-O-或20-O-糖基主要生成C-K、C-Mx、R7、C-Mc，其結(jié)構(gòu)如圖10中所示。初步推斷酶催化降解底物皂苷生成產(chǎn)物的對應(yīng)情況如下：

Rb1、Rd、Gyp17→降解3-O-和20-O-葡萄糖基→生成C-K；Rc和C-Mc1→降解3-O-葡萄糖基→生成C-Mc和C-K；Rb3和C-Mx1→降解3-O-葡萄糖基→生成C-Mx；Fa→降解20-O-葡萄糖基→生成R7。

G8-G4混合酶液轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的C-K轉(zhuǎn)化得率，相比A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶有所提高，這可能是C-Mc的20-O-阿拉伯糖基繼續(xù)被酶降解轉(zhuǎn)化生成C-K的緣故，圖9-A中沒有檢測到C-Mc，也能說明此結(jié)果。而G8-G4混合酶液和A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶，均不能水解C-Mx的20-O-末端木糖基，也不能水解R7和Fc的3-O-末端木糖基，因此上述2種酶液的催化反應(yīng)產(chǎn)物中均有Fc的殘留。

圖10 圖2 HPLC中三七莖葉總皂苷的結(jié)構(gòu)式Fig.10 Structure of notoginseng leaf ginsenosides of figure 2 HPLC

2.4 三七莖葉總皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物C-K等的制備

綜上結(jié)果可知G8-G4混合酶液轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的C-K得率相比A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶有所提高。其結(jié)果由如下制備生產(chǎn)來驗證。

將50.0 g三七莖葉總皂苷溶于1 000 mL的20 mmol/L pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液中，分別與等體積G8-G4混合酶或等體積A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶液混合，置于生化反應(yīng)器中，在45℃下攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，分別加入3倍體積的95%(體積分數(shù))乙醇沉淀酶，其上清濃縮后，經(jīng)AB-8脫糖、D-280脫色、濃縮干燥，得到酶反應(yīng)產(chǎn)物混合皂苷。50.0 g三七莖葉總皂苷經(jīng)G8-G4混合酶反應(yīng)后，得到產(chǎn)物33.1 g，得率為66.2%，其中C-K為32.7%；50 g三七莖葉總皂苷經(jīng)A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶反應(yīng)后，得到產(chǎn)物34.9 g，得率為69.8%，其中C-K為24.6%。

3 結(jié)論

市銷的三七莖葉總皂苷中，主要為人參二醇類皂苷，其組成成分和含量(質(zhì)量分數(shù))如下：Rb3 26.38%，C-Mx1 14.28%，Rc 12.73%，F(xiàn)c 10.25%，還含有Rb1、Rb2、Rd、Gyp17、R7、C-Mc1等皂苷。

G8-G4混合酶和A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的最佳反應(yīng)條件為45 ℃，pH 5.0，底物質(zhì)量濃度25 g/L、反應(yīng)24 h。

A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物有5種：C-K、C-Mx、Fc、R7、C-Mc；而G8-G4混合酶液轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的產(chǎn)物有4種：C-K、C-Mx、Fc、R7；且G8-G4混合酶液轉(zhuǎn)化三七莖葉總皂苷的C-K產(chǎn)率比A.nigersp.G8菌所產(chǎn)酶高，推斷是C-Mc被繼續(xù)降解轉(zhuǎn)化生成C-K所致。

三七莖葉總皂苷和酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，三七莖葉總皂苷中Rb1、Rd、Gyp17、Rc、 Rb3、C-Mc1、 C-Mx1和Fa的3-O-和20-O-葡萄糖基或阿拉伯糖基被酶水解，產(chǎn)物中約含24%～30%(質(zhì)量分數(shù))的C-K。而Fc的3-O-和20-O-末端木糖基無法被酶降解，在酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中有所殘留。今后，還需進一步開發(fā)能夠降解C-Mx、Rb3、R7、Fa、Fc的3-O-和20-O-末端木糖基的酶，以提高酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中C-K的含量。