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    高產(chǎn)胞外多糖植物乳桿菌篩選及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

    2020-01-13 08:31:58張文平趙英杰羅晟程新
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年21期
    關(guān)鍵詞:胞外氮源碳源

    張文平,趙英杰,羅晟,程新

    (江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西 南昌,330045)

    乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的一種糖類高聚物的總稱[1-2]。大量研究表明,乳酸菌胞外多糖具有多種生理功能,如抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)腸道菌群平衡、免疫調(diào)節(jié)等[3],此外,乳酸菌胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑,改善食品黏稠度、質(zhì)地和風(fēng)味等[4],因此被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5-7]。

    目前,乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量普遍偏低,這也是制約著其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要原因之一[8-9]?;诖?,近年來(lái),大多數(shù)研究都集中在如何進(jìn)一步優(yōu)化乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量[10-12]。葉廣彬等[13]采用響應(yīng)面法優(yōu)化檸檬明串珠菌TD1產(chǎn)胞外多糖條件,優(yōu)化后產(chǎn)量是優(yōu)化前的1.76倍。WANG等[14]對(duì)LactobacillusplantarumKX041合成胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化,優(yōu)化后,最大胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到599.52 mg/L,是優(yōu)化前的3倍。因此,優(yōu)化菌株?duì)I養(yǎng)和培養(yǎng)條件是提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的重要途徑。

    本實(shí)驗(yàn)以提高胞外多糖產(chǎn)量為出發(fā)點(diǎn),從課題組保藏的20株乳酸菌中篩選高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌,采用形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)手段對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,同時(shí),采用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳發(fā)酵工藝條件,為乳酸菌胞外多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 供試菌株

    乳酸菌,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室保藏。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏10.0 g/L,酵母膏5.0 g/L,葡萄糖20.0 g/L,檸檬酸氫二銨2.0 g/L,無(wú)水乙酸鈉5.0 g/L,MgSO40.2 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L,吐溫-80 1.0 mL/L,pH 6.2~6.4,121 ℃高壓滅菌,15 min。

    改良MRS培養(yǎng)基:用蔗糖代替葡萄糖,其他同MRS培養(yǎng)基。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    JW-3022HR高速冷凍離心機(jī),安徽嘉文儀器裝備有限公司;721可見(jiàn)分光光度計(jì),上海佑科儀器儀表有限公司;LRH-250-C培養(yǎng)箱,韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司; FEI Quanta 250型掃描電子顯微鏡,美國(guó)FEI。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

    將保藏于-80 ℃的20株乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,采取平板劃線法將活化好的乳酸菌接種于改良的MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài),選取菌落表面黏稠且可拉絲的單菌落[15],保藏于MRS培養(yǎng)基斜面,置于4 ℃冰箱保存。

    將初篩獲得的菌株接種于改良的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置發(fā)酵24 h。取發(fā)酵液于10 000 r/min,4 ℃條件下離心15 min,取上清液加三氯乙酸至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,4 ℃反應(yīng)12 h后,10 000 r/min,4 ℃條件下離心15 min,收集上清液,于上清液中加入3倍體積95%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液于4 ℃浸提12 h后在10 000 r/min,4 ℃條件下離心15 min,收集沉淀,用無(wú)水乙醇洗滌沉淀后,將沉淀用去離子水溶解定容,溶液用去離子水透析(8 000~14 000 Da)3 d,每8 h換一次水,透析結(jié)束后減壓真空濃縮至原體積即為粗多糖溶液[16]。

    采用硫酸-苯酚法[17]測(cè)定胞外多糖含量。從而確定高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌菌株。

    1.2.2 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的鑒定

    菌株形態(tài)學(xué)鑒定、掃描電鏡、生理生化特性分析、16S rDNA鑒定分別參考文獻(xiàn)[18-21]進(jìn)行。

    1.2.3 單因素優(yōu)化乳酸菌產(chǎn)胞外多糖條件

    在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別研究碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖)、最佳碳源濃度(10、20、30、40、50 g/L)、氮源(酪蛋白、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨)、最佳氮源濃度(5、10、15、20、25 g/L)、發(fā)酵時(shí)間(18、24、30、36、42 h)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35、40 ℃)、發(fā)酵初始pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%(體積分?jǐn)?shù)))等因素對(duì)乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的影響。

    1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選發(fā)酵工藝條件顯著因子

    根據(jù)單因素的結(jié)果,使用Design-expert 8.0軟件,選用19因素,20次實(shí)驗(yàn)次數(shù)的Plackett-Burman設(shè)計(jì)[22],采用Design-expert 8.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定顯著因子。

    1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果,篩選出對(duì)出發(fā)菌株產(chǎn)胞外多糖影響顯著的3個(gè)因子,以胞外多糖產(chǎn)量為響應(yīng)值,根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理,采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素五水平實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行顯著性分析[23],確定最佳發(fā)酵工藝條件。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman和Central Composite Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析,圖形繪制采用Origin 8.5軟件,數(shù)據(jù)處理采用DPS 7.5軟件;對(duì)不同處理間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,Duncan法進(jìn)行多重比較,圖中不同小寫字母表示處理間在P<0.05水平上差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌篩選

    將保藏的20株乳酸菌在改良的MRS固體培養(yǎng)基上平板劃線,觀察菌落特征,初篩結(jié)果如表1所示,選取其中6株菌落黏稠、有拉絲現(xiàn)象的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),測(cè)定其胞外多糖產(chǎn)量進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明,其中1、2、6、10、16號(hào)5株菌的胞外多糖的產(chǎn)量基本都在550~800 mg/L之間,而LPC-1的胞外多糖產(chǎn)量可以達(dá)到1 060.39 mg/L,故選擇LPC-1菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    表1 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of exopolysacch-arides-producing lactic acid bacteria

    注:“+”:是;“-”:否。

    圖1 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Re-screening results of exopolysaccharides-producing lactic acid bacteria

    2.2 菌株LPC-1的鑒定

    2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

    菌株LPC-1在改良MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h后,菌落形態(tài)如圖2所示,LPC-1菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊光滑,表面濕潤(rùn)有光澤、黏稠、中央隆起、不透明。通過(guò)光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察顯示,LPC-1菌體為革蘭氏陽(yáng)性,桿狀,不形成芽孢。菌落形態(tài)及菌體照片如圖2所示。

    圖2 LPC-1菌株菌落及菌體形態(tài)Fig.2 Colony morphologies and electron micrograph(8 000×) of strain LPC-1

    2.2.2 生理生化鑒定

    對(duì)LPC-1菌株進(jìn)行生理生化特征分析,以干酪乳桿菌菌株為對(duì)照,結(jié)果如表2所示,LPC-1菌株過(guò)氧化氫酶、H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陰性,可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、棉子糖、甘露糖、阿拉伯糖、蜜二糖等,不能利用鼠李糖,與植物乳桿菌的性質(zhì)接近。

    表2 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characters of strains

    注:“-”表示陰性,“+”表示陽(yáng)性。

    2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

    對(duì)菌株LPC-1的16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,獲得大小約為1.5 Kb的擴(kuò)增片段(GenBank登錄號(hào)為MK722196),將序列提交GenBank做Blast同源性比對(duì)分析。結(jié)果顯示,該序列與多株植物乳桿菌16S rRNA基因序列相似性為99%,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖3所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPC-1菌株與乳桿菌屬在同一個(gè)分支,具有極高的同源性。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化等微生物學(xué)特性及其遺傳特性16S rDNA將菌株LPC-1初步鑒定為L(zhǎng)actobacillusplantarum。

    圖3 16S rDNA構(gòu)建的菌株LPC-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the polygenetic analysisof 16S rDNA sequences showing the position ofstrain LPC-1

    2.3 單因素對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

    2.3.1 碳源對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

    由圖4-A所示,L.plantarumLPC-1均可以利用所添加的多種碳源,但胞外多糖產(chǎn)量各異,其中以蔗糖為碳源時(shí),胞外多糖產(chǎn)量最高為1 080.86 mg/L,其次,分別為麥芽糖、葡萄糖和果糖,乳糖最低,因此選擇蔗糖作為L(zhǎng).plantarumLPC-1合成胞外多糖的最佳碳源。DESAI等[24]從印度發(fā)酵穇子中篩選得到1株L.plantarum,研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)胞外多糖的最佳碳源為乳糖。而姜云蕓等[25]對(duì)植物乳桿菌K25產(chǎn)胞外多糖影響因素發(fā)現(xiàn),以葡萄糖為碳源時(shí),其胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大,可達(dá)235.4 mg/L。以上說(shuō)明植物乳桿菌產(chǎn)胞外多糖對(duì)優(yōu)勢(shì)碳源的需求存在一定的菌株差異性。

    不同蔗糖濃度對(duì)L.plantarumLPC-1產(chǎn)胞外多糖的影響如圖4-B所示,隨著蔗糖濃度的增加,胞外多糖的產(chǎn)量先增加后降低,當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí),胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大1 268.19 mg/L,所以選擇蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L作為L(zhǎng).plantarumLPC-1產(chǎn)胞外多糖的最佳碳源濃度。

    圖4 不同碳源和碳源濃度對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different carbon sources and concentra-tions on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

    2.3.2 氮源對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

    如圖5-A所示,當(dāng)以大豆蛋白胨為氮源時(shí),胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大為1 302.03 mg/L,所以選擇大豆蛋白胨為最佳氮源進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。劉晶等[26]從芬蘭傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的LactobacillusparacaseiVL8,利用大豆蛋白胨為氮源,其產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大,與本研究結(jié)果相一致。

    不同大豆蛋白胨濃度對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖5-B所示,當(dāng)大豆蛋白胨為10 g/L時(shí),L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量最大,為1 309.12 mg/L,過(guò)高或過(guò)低的碳氮比均會(huì)降低胞外多糖的產(chǎn)量,所以選擇大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L作為L(zhǎng).plantarumLPC-1產(chǎn)胞外多糖的最佳氮源濃度。

    圖5 不同氮源和氮源濃度對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources and concentr-ations on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

    2.3.3 發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

    如圖6-A所示,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)24 h時(shí),胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最大,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),胞外產(chǎn)量逐漸降低,可能是由于發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和菌體產(chǎn)生降解多糖的酶。廖乾偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌SR2-2胞外多糖隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在24 h達(dá)到最大值463.64 mg/L,隨后胞外多糖產(chǎn)量逐漸降低,與本實(shí)驗(yàn)的L.plantarumLPC-1發(fā)酵條件相符合。

    發(fā)酵溫度對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖6-B所示,胞外多糖產(chǎn)量隨著溫度升高而增加,當(dāng)溫度為30 ℃時(shí),胞外多糖產(chǎn)量最高,溫度再升高時(shí),胞外多糖產(chǎn)量有所下降。馮小婉等[28]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌AR307產(chǎn)胞外多糖最佳溫度為32 ℃,與本研究結(jié)果較為相似。

    圖6 不同發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different fermentation time and temper-ature on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

    2.3.4 初始pH和接種量對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響

    由圖7-A可知,初始pH值對(duì)L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的影響較大,L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的初始pH值為6.5時(shí),即弱酸性條件,L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高。王英等[29]對(duì)干酪乳桿菌FM10-3的發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的pH研究也得到了相同的結(jié)論。

    接種量對(duì)L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖7-B所示,當(dāng)接種量為4%(體積分?jǐn)?shù))時(shí),L.plantarumLPC-1胞外多糖達(dá)到最高,為1 670.00 mg/L。隨著接種量的增加,胞外多糖產(chǎn)量逐漸降低。馮美琴等[22]對(duì)植物乳桿菌70810產(chǎn)胞外多糖優(yōu)化發(fā)現(xiàn),接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)有利于胞外多糖的合成,與本研究結(jié)果略有差異,可能與菌株差異性有關(guān)。

    圖7 不同pH值和接種量對(duì)L. plantarum LPC-1胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of different pH and inoculum concentrationon the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

    2.4 Plackett-Burman篩選發(fā)酵工藝條件顯著因子結(jié)果

    Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示,利用Design-expert 8.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析結(jié)果如表4所示,經(jīng)過(guò)分析可以得到胞外多糖產(chǎn)量一階模型:

    Y=1 224.38+19.44X1-33.88X2-46.88X3-56.30X4+14.90X5-26.49X6+140.12X7+9.62X8-43.18X9+17.54X10-3.19X11+180.03X12+165.92X13+4.69X14

    2.5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

    根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出的3個(gè)顯著因子(溫度、pH、檸檬酸氫二銨)進(jìn)行三因素五水平的中心組合實(shí)驗(yàn)考察,測(cè)定胞外多糖產(chǎn)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示,采用Design-expert 8.0 軟件獲得擬合方程:

    其中,y為胞外多糖產(chǎn)量,x1、x2、x3分別為溫度、pH值、檸檬酸氫二銨的編碼值。

    表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 3 Plackett-Burman design matrix and results

    表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance for the Plackett-Burmandesign

    表5 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 5 Central composite design(CCD) matrix andresults

    表6 中心組合試驗(yàn)方差分析Table 6 Analysis of variance for the central compositedesign

    通過(guò)Design-expert 8.0 軟件分析可知,L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的最佳發(fā)酵工藝條件為:溫度31.71 ℃、pH值6.68、檸檬酸氫二銨3.26 g/L,在此條件下發(fā)酵所得胞外多糖質(zhì)量濃度理論值為2 069.18 mg/L,根據(jù)實(shí)際可行操作情況,將發(fā)酵條件修正為溫度32 ℃、pH值6.7、檸檬酸氫二銨 3 g/L,采取上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果測(cè)得胞外多糖平均質(zhì)量濃度為2 064.69 mg/L,與預(yù)測(cè)值基本一致。

    3 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)從20株乳酸菌中篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌LPC-1,經(jīng)鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。本研究從碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值、接種量對(duì)合成胞外多糖影響的單因素基礎(chǔ)上聯(lián)合Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Central-Composite實(shí)驗(yàn)方法,通過(guò)顯著性分析及響應(yīng)面分析,得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:溫度32 ℃、pH值6.7、檸檬酸氫二銨3 g/L,在此條件下發(fā)酵測(cè)得實(shí)際質(zhì)量濃度為2 064.69 mg/L,與預(yù)測(cè)值基本吻合,與優(yōu)化前相比增加了48.64%。

    據(jù)報(bào)道,乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量一般都在50~800 mg/L左右,優(yōu)化后也很少達(dá)到1 000 mg/L,本實(shí)驗(yàn)篩選得到的L.plantarumLPC-1優(yōu)化前胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 060.39 mg/L,最終優(yōu)化后,其胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)到2 064.69 mg/L,與現(xiàn)如今報(bào)道的乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量相比,本實(shí)驗(yàn)篩選得到的L.plantarumLPC-1胞外多糖產(chǎn)量較高,具有較大的研究?jī)r(jià)值。

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