一株高產淀粉酶扣囊復膜孢酵母的產酶條件優(yōu)化及酶學性質研究

孫思佳，翟磊，白秀彬，許玲，于盼盼，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，北京，100015)2(山東扳倒井股份有限公司，山東 淄博，256300)

淀粉酶是一類重要的糖苷水解酶，可作用于淀粉，將其分解為糊精、麥芽糖、葡萄糖等小分子糖，根據(jù)作用方式的不同，分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶等[1]。作為工業(yè)應用中最廣泛的一類酶，淀粉酶在發(fā)酵、食品、飼料、醫(yī)療和印染等領域都具有重要應用價值[2]，如添加適量中溫α-淀粉酶到面粉中，可以有效改善面團質量，增強面條口感與質構咀嚼性[3]；在啤酒釀造時添加淀粉酶高粱輔料，可降低啤酒生產成本，增加企業(yè)效益[4]；在禽畜飼料中添加淀粉酶可以提高飼料轉化率，增強禽畜生產性能[5-6]。

白酒釀造離不開大曲，而淀粉酶則是大曲中重要的一類水解酶[7]，對于大曲原料利用以及白酒風味物質形成具有重要作用[8]，還穩(wěn)定出酒率，提高基酒質量[9]。大曲中淀粉酶主要來源于大曲微生物，但目前對大曲中產淀粉酶菌株的研究多集中于細菌及霉菌[10-15]，對高產淀粉酶酵母研究的較少。

扣囊復膜孢酵母是一類產子囊孢子的二形態(tài)酵母[16]，廣泛存在于高淀粉含量基質中，能夠分泌淀粉酶、酸性蛋白酶及β-葡萄糖苷酶[17-19]，是大曲發(fā)酵前期優(yōu)勢菌種，在白酒釀造過程中被廣泛分離使用[20-22]。作為產生淀粉分解酶類最好的子囊孢子菌之一，扣囊復膜孢酵母在釀酒行業(yè)極具應用潛力，因此對篩選得到的高產淀粉酶扣囊復膜孢酵母進行研究是十分必要的。

本研究通過單因素實驗及響應面分析對篩選自芝麻香型白酒高溫大曲中的高產淀粉酶菌株扣囊復膜孢酵母(Saccharomycopsisfibuligera)CICC 33077進行了發(fā)酵產酶條件的優(yōu)化，并對該酶酶學性質進行了初步探究，旨在為該菌株在制曲及白酒生產中的實際應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

S.fibuligeraCICC 33077分離于扳倒井芝麻香型白酒高溫大曲，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)。

1.2 試驗試劑

麥芽浸粉瓊脂(malt extract agar，MEA) 培養(yǎng)基、麥芽浸粉肉湯(malt extract broth，MEB) 培養(yǎng)基,北京陸橋技術有限公司。

可溶性淀粉,天津市福晨化學試劑廠；無水葡萄糖,廣東汕頭市西隴化工廠；K2HPO4、KH2PO4,北京化工廠；麥芽浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨,北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.3 試驗設備

FE20型pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司；Multiskan FC型酶標儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；HH3A型恒溫水浴鍋,國華電器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基及主要試劑配制

種子培養(yǎng)基(質量分數(shù))：麥芽浸粉3.586%、大豆蛋白胨1.216%、蛋白胨1.470%、K2HPO41.148%，pH 6.0，121 ℃下滅菌15 min。

葡萄糖標準溶液：準確稱取葡萄糖0.1 g，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度1 g/L的葡萄糖標準溶液。

質量濃度10 g/L可溶性淀粉緩沖液：準確稱取可溶性淀粉1.0 g，加入少量蒸餾水煮沸至透明，冷卻后加入0.2 mol/L pH 5.50磷酸緩沖液10 mL，定容至100 mL。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)試劑：準確稱取DNS 6.3 g、NaOH 21 g，加水，加熱至50 ℃全溶，稱取酒石酸鉀鈉182 g于300 mL水中，加熱溶解并倒入前溶液中，加入重蒸苯酚5 g、無水Na2SO45 g，溶解后定容至1 000 mL，過濾,貯于棕色瓶中放置7 d后使用。

1.4.2 種子液制備

菌株活化：將甘油保藏的S.fibuligeraCICC 33077接種到MEA斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后挑取一環(huán)接種到MEB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。

種子液制備：按照2%接種量將活化后的S.fibuligeraCICC 33077接種于裝液量為50 mL/250 mL種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.4.3 粗酶液制備

取1 g固體發(fā)酵物，加水定容至200 mL，靜置浸提30 min后，于5 000 r/min條件下離心20 min，取上清液為粗酶液。

1.4.4 標準曲線繪制

將配制好的葡萄糖標準溶液分別稀釋為質量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的標準糖液組，在裝有0.5 mL標準糖液的試管中加入1.5 mL DNS試劑，于沸水中煮沸15 min，冷卻，加入10.5 mL蒸餾水，搖勻后在550 nm波長下測吸光值A。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，求出回歸方程。

1.4.5 淀粉酶酶活力的測定方法

使用DNS[23]法測定淀粉酶活力：將1 mL粗酶液加入到9 mL pH 5.5的質量濃度10 g/L淀粉緩沖液中，50 ℃恒溫水浴中精確反應20 min后迅速吸取0.5 mL反應液加入到1.5 mL DNS試劑中，終止反應，后續(xù)處理參照1.4.4。利用葡萄糖標準曲線計算生成的還原糖(以葡萄糖計)量。淀粉酶活力單位定義為：1 mL粗酶液(或1g固體發(fā)酵物)在pH 5.0、50 ℃的條件下，1 h水解質量濃度10 g/L淀粉液生成1 μmol葡萄糖為1個酶活力單位，以μ/mL(μ/g)表示。

1.4.6 產淀粉酶發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基原料確定

分別選取麩皮、高粱、玉米、小麥和稻谷5種原料(除麩皮外，均帶皮粉碎)25 g裝入500 mL三角瓶中，按照干基量的40%加入10 mL水，滅菌后接入10% 種子液，30 ℃培養(yǎng)96 h后，檢測發(fā)酵物淀粉酶活力，選取酶活最高者為后續(xù)試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的原料。

(2)單因素試驗

確定發(fā)酵培養(yǎng)基原料后，分別探究原料添加量、干基含水量、接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間對S.fibuligeraCICC 33077固體發(fā)酵產酶的影響，確定不同因素的適宜范圍及后續(xù)響應面試驗的中心點。

(3)Box-Behenken響應面分析法試驗設計

在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert 10.0.4軟件設計響應面試驗。根據(jù)Box-Behnken試驗的設計原理[24-25]，以淀粉酶酶活力為響應值，選取對菌株產酶影響較大的原料添加量、干基含水量、發(fā)酵溫度和接種量4個因素，設計4因素3水平響應面試驗，并進行回歸分析及顯著性檢驗，以確定產淀粉酶發(fā)酵的最佳條件組合。每個試驗組合做3組平行，取平均值，其中各影響因素水平編碼如表1所示。

從坐標系oxyz所觀察的車輪上的一點，其位置既可以用直角坐標(x，y，z)來描述，也可以用柱坐標(r，y，θ)來確定，此處環(huán)向角θ定義了一個過輪軸線的截面，稱為θ面。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnkenexperiments design

1.4.7 淀粉酶性質初探

(1)酶最適反應溫度測定

在優(yōu)化得到的產淀粉酶最佳條件組合下發(fā)酵72 h，以pH 5.5的質量濃度10 g/L的可溶性淀粉緩沖液為底物，按照上述酶活力的測定方法，分別在30、40、50、60、70 ℃條件下測定發(fā)酵物淀粉酶活力，并以淀粉酶酶活力最高者為100%。

(2)酶最適反應pH值測定

在優(yōu)化得到的產淀粉酶最佳條件組合下發(fā)酵72 h，分別用pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液配制質量濃度10 g/L的可溶性淀粉為底物，按照上述酶活力的測定方法，在最適反應溫度下測定發(fā)酵物的淀粉酶活力，并以淀粉酶酶活力最高者為100%。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基原料確定

淀粉酶是一類水解酶，不同的原料對S.fibuligeraCICC 33077發(fā)酵產酶均有影響。試驗選取麩皮、高粱、玉米、小麥、稻谷為原料進行產酶發(fā)酵，結果表明(圖1)，發(fā)酵培養(yǎng)基以麩皮為原料時，酶活力最高，達到7 000 U/g以上；以高粱、小麥為原料時，酶活力相當，為2 500 U/g左右，而以玉米和稻谷為原料時，淀粉酶活力相對較低。麩皮價格低廉，且所產淀粉酶活力最高，因此選取麩皮為后續(xù)發(fā)酵試驗培養(yǎng)基原料。

圖1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基原料發(fā)酵試驗Fig.1 Fermentation test of different fermentationmedium raw materials

2.2 單因素試驗設計與分析

2.2.1 原料添加量對S.fibuligeraCICC 33077 產酶的影響

圖2 原料添加量單因素試驗Fig.2 Single factor test of raw material amount

2.2.2 含水量對S.fibuligeraCICC 33077 產酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，分別按干基質量的20%、40%、60%、80%、100%、120% 加入一定量的水，接入10% 種子液，30 ℃發(fā)酵96 h后，測定淀粉酶活力，探究干基含水量對菌株發(fā)酵產酶的影響。實驗結果表明，原料水含量在 20%～40%內，隨水含量增加，淀粉酶活力增大，當水含量為40%時，酶活力達到最大值，當水含量超過40%時，淀粉酶活力有下降趨勢。這是因為微生物的一切代謝活動都離不開水，水分含量的高低直接影響微生物對營養(yǎng)物質的利用效率；當培養(yǎng)基干基含水量為40% 時，麩皮濕潤疏松，培養(yǎng)基的顆粒之間存在合適的空隙，利于O2融入、CO2排出和菌體生長繁殖，從而增加產酶量[27]；當含水量過低時，不能維持菌體生長特性，引起細胞新陳代謝不平衡，影響產酶量；而當含水量過高時，物料易結塊成團，多孔性降低，物料內的氣體交換減少，培養(yǎng)基透氣性下降，難以進行通風和散熱，不利于微生物生長和產酶。因此，40%水含量為培養(yǎng)基最適含水量，并以此作為響應面實驗中心點。

圖3 含水量單因素試驗Fig.3 Single factor test of water content

2.2.3 接種量對S.fibuligeraCICC 33077 產酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，按干基質量的40% 加入一定量的水，分別接入10%、20%、30%、40%、50%的種子液，30℃發(fā)酵96 h后，測定淀粉酶活力，探究接種量對于菌株發(fā)酵產酶的影響。實驗結果表明，隨著接種量增加，酶活也相應增大，當種子液接種量為20%時，淀粉酶活力達到最大，當接種量大于20%時，淀粉酶活力反而減小。這是因為接種量過小時，會造成菌體細胞生長量小，菌株到達對數(shù)生長期的時間延滯，從而延長發(fā)酵時間，對產酶有不利影響；而接種量過大，菌體生長過旺，會加快培養(yǎng)基消耗，菌體快速進入穩(wěn)定期和衰亡期，同時大量產熱，造成培養(yǎng)基內部溫度快速升高，對產酶有不利影響[28]。因此選取接種量20%為響應面實驗中心點。

圖4 接種量單因素實驗Fig.4 Single factor test of inoculum dosage

2.2.4 發(fā)酵溫度對S.fibuligeraCICC 33077 產酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，按加入原料質量的40% 加入一定量的水，接入10%種子液，分別于20、25、30、37、42 ℃發(fā)酵96 h后，測定淀粉酶活力，探究發(fā)酵溫度對于菌株發(fā)酵產酶的影響。實驗結果表明，25 ℃條件下菌株產酶能力最強，淀粉酶活力達到11 716 U/g，而溫度過低或過高條件下均不利于菌株發(fā)酵產酶。這是因為溫度不僅影響微生物的生長速率、細胞組成以及營養(yǎng)需求，同時還影響離子的運輸和擴散、細胞膜的滲透壓及表面張力[29]；在一定范圍內，微生物生長速率隨溫度升高而增加，同時產酶也增加；但溫度過高時，菌體雖生長旺盛，但培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質被過多用于菌體自身生長繁殖，產酶速率會相對降低，且酶活性喪失較快[30]。因此對菌株CICC 33077而言，最適產酶發(fā)酵溫度為25 ℃，并以此作為響應面實驗中心點。

圖5 發(fā)酵溫度單因素實驗Fig.5 Single factor test of fermentation temperature

2.2.5 發(fā)酵時間對S.fibuligeraCICC 33077 產酶的影響

取25 g麩皮裝入500 mL三角瓶中，按干基量的40% 加入一定量的水，接入10%種子液，于30 ℃分別發(fā)酵24、48、72、96、120 h后，測定淀粉酶活力，考察發(fā)酵時間對于菌株發(fā)酵產酶的影響。在24～72 h內，隨發(fā)酵時間的延長，產酶不斷增加，72 h后產酶趨于平緩且在96 h后有下降趨勢。這可能是因為在72 h前，基質中的營養(yǎng)物質尚未耗盡，隨著微生物不斷繁殖，產酶逐漸增加，之后基質內營養(yǎng)物質耗盡，微生物開始死亡，產酶趨于平緩，同時隨著時間延長，所產淀粉酶開始失活，因此有下降趨勢。考慮到在72～96 h范圍內淀粉酶活力變化不大，為節(jié)省時間成本，將72 h作為最佳發(fā)酵時間，同時發(fā)酵時間不作為后續(xù)響應面實驗因素。

圖6 發(fā)酵時間單因素實驗Fig.6 Single factor test of fermentation time

2.3 響應面實驗設計與結果分析

利用實驗軟件Design Expert進行實驗設計，根據(jù)表2的試驗結果以淀粉酶活力(Y)為響應值進行回歸擬合分析，得到淀粉酶活力(Y)對原料添加量(A)、含水量(B)、發(fā)酵溫度(C)、接種量(D)的二次多項回歸方程：Y=11 688.07-1 272.38A+1 953.48B-1 228.66C+390.20D-1 986.14AB-343.76AC-1 200.70AD-1 620.62BC-2 762.61BD-810.37CD-3 706.54A2-3 109.39B2-4 033.15C2-1 507.16D2。對回歸模型進行顯著性檢驗及方差分析，結果顯示，模型P值為0.000 2<0.01(表3)，說明擬合回歸方程有意義，模型達到極顯著水平；且失擬項P=0.210 3>0.05，失擬項不顯著，說明實驗數(shù)據(jù)誤差較小，實驗精度高，能夠較好描述實驗結果且用于預測考察因素與淀粉酶活力之間的關系。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注： “*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

根據(jù)方差分析結果及各因素間響應面立體分析圖，原料添加量(A)、發(fā)酵溫度(C)對菌株固體發(fā)酵產酶影響顯著，含水量(B)影響極顯著；同時，原料添加量與含水量交互作用(圖7)、含水量與發(fā)酵溫度交互作用影響顯著(圖8)；含水量與接種量交互作用影響極顯著(圖9)，當含水量一定時，淀粉酶的酶活力隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢。

圖7 原料添加量和含水量交互作用對淀粉酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour polt showing theeffects of raw material amount and water content onamylase activity

圖8 含水量和溫度交互作用對淀粉酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour polt showing the effectsof water content and temperature on amylase activity

圖9 含水量和接種量交互作用對淀粉酶活力影響的響應面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour polt showing theeffects of water content and inoculum dosage onamylase activity

根據(jù)軟件分析計算結果，淀粉酶活力預測最大值是12 506.69 U/g，最優(yōu)條件為原料添加量20 g，含水量51%，發(fā)酵溫度24 ℃，接種量18%。經(jīng)3次平行實驗驗證，發(fā)酵物淀粉酶活力實際值為(12 297±302) U/g，與預測值基本相符，說明該模型可用于該菌株產淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。

2.4 淀粉酶酶學性質研究

2.4.1 酶最適反應溫度測定

淀粉酶最適反應溫度試驗結果如圖10所示，S.fibuligeraCICC 33077所產淀粉酶的最適反應溫度為50 ℃，淀粉酶在30～50 ℃條件下能夠保持60%以上的酶活力，超過60 ℃時，酶活喪失較大。這說明該菌株所產淀粉酶能夠適應大曲發(fā)酵環(huán)境，在大曲發(fā)酵前中期充分發(fā)揮作用，水解大曲原料。

圖10 反應溫度對S.fibuligera CICC 33077淀粉酶活力的影響Fig.10 Effect of reaction temperature on amylase activityof S. fibuligera CICC 33077

2.4.2 酶最適反應pH值測定

淀粉酶最適反應pH值試驗結果如圖11所示，S.fibuligeraCICC 33077所產淀粉酶的最適反應pH值為4.0，在pH 3.0～6.0條件下能夠保持70%以上的淀粉酶活力。這說明該菌株所產淀粉酶在較酸的環(huán)境中具有較好的反應活性，能夠適應大曲發(fā)酵酸性環(huán)境，并在大曲發(fā)酵過程中發(fā)揮作用。

圖11 反應pH值對S.fibuligera CICC 33077淀粉酶活力的影響Fig.11 Effect of reaction pH value on amylase activityof S. fibuligera CICC 33077

3 結論與討論

本研究利用單因素及響應面實驗對S.fibuligeraCICC 33077產淀粉酶條件進行優(yōu)化，菌株淀粉酶活力可達到12 297 U/g，高于目前文獻報道水平[31-32]，說明該菌株產淀粉酶能力強，性能優(yōu)良。同時該菌株淀粉酶性質研究結果表明，其淀粉酶最適反應溫度為50 ℃，最適反應pH值為4.0，表明該菌株所產淀粉酶能夠在大曲發(fā)酵的酸性高溫環(huán)境中發(fā)揮作用，高效降解大曲中的淀粉顆粒，產生大量小分子糖，既能參與到美拉德反應中，生成白酒風味成分或前體物質，豐富大曲風味，又能供其他微生物的生長繁殖，避免曲塊死板，起到促進大曲微生物群落結構更替的作用，具有應用于大曲生產的潛力。

本研究通過對高溫大曲中篩選出的高產淀粉酶S.fibuligera進行產酶條件與酶學性質的研究，為菌株在白酒生產中的開發(fā)利用打下堅實基礎，同時也為穩(wěn)定不同地區(qū)、季節(jié)大曲品質提供可能。