百合酵素自然發(fā)酵過程中有機(jī)酸及其體外抗氧化活性的變化

方晟，陳犇，沙如意，毛建衛(wèi),3*

1(紹興文理學(xué)院 元培學(xué)院，浙江 紹興,312000) 2(浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州,310023) 3(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興,312000)

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料，經(jīng)多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性發(fā)酵產(chǎn)品，可有效清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基，在預(yù)防和治療因自由基誘發(fā)的疾病和抗衰老方面具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。食用植物酵素既保持了植物自身營養(yǎng)成分、也含有乳酸菌等有益微生物及其代謝產(chǎn)生的功能性小分子物質(zhì)等，其中有機(jī)酸是一項重要指標(biāo)，對酵素產(chǎn)品的特有風(fēng)味及抗氧化等功能性作用有重要影響[3-4]。目前酵素品類繁多，但品質(zhì)差別大，且相關(guān)科學(xué)研究支撐不足，亟需深入開展酵素發(fā)酵過程功能組分和功效研究，進(jìn)而用標(biāo)準(zhǔn)化手段規(guī)范傳統(tǒng)工藝，保證酵素品質(zhì)。

百合為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物，是國家衛(wèi)計委公布的首批“藥食同源”植物之一，其食用、藥用部位均為卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、百合(L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker)和細(xì)葉百合(L.pumilumDC.)的肉質(zhì)鱗葉，藥理實驗表明，其具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、消炎等作用[5-6]。目前百合在功能性食品和藥品領(lǐng)域的深入開發(fā)較少，主要用于鮮食或加工成百合干、百合淀粉、百合飲料等，附加值相對較低[7]。從食用安全性和保健功效考慮，百合是開發(fā)食用酵素的優(yōu)良植物資源，但目前未見關(guān)于百合酵素的研究報道。本研究以百合為主要原料制備食用植物酵素，探討對其自然發(fā)酵過程中體外抗氧化活性、有機(jī)酸組成及含量的變化規(guī)律，以期為百合酵素產(chǎn)品的開發(fā)及精準(zhǔn)制備提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮百合，蘭州米家山百合有限責(zé)任公司；發(fā)酵糖液，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室。

α,α-二苯基-β-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、硝基四氮咪唑藍(lán)(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、K2HPO4、H3PO4、甲醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、水楊酸鈉、FeSO4、HCl，均為分析純，上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；TU-1810紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司； PHS-3C酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Allegra X-12R型冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；SW-CJ-1B超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 百合酵素的制備

用去離子水清洗百合表面去除雜質(zhì)，自然晾干。百合和發(fā)酵糖液按質(zhì)量比3∶5混勻后，加入到已滅菌的玻璃瓶中密封，室溫下避光發(fā)酵。發(fā)酵過程中，分別在第5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90天取樣，樣品于10 000 r/min離心10 min后，保留上清液待測。

1.3.2 超氧自由基清除能力的測定

采用PMS/NADH體系還原NBT法[8]，50 μL樣品加入到950 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)，然后加入1 mL 120 μmol/L的PMS(用0.1 mol/L的PBS配制，pH 7.4)，1 mL 936 μmol/L的NADH(用0.1 mol/L的PBS配制，pH 7.4)和1 mL 300 μmol/L的NBT(用0.1 mol/L的PBS，pH 7.4配制)。在環(huán)境溫度下反應(yīng)5 min。以去離子水為參比溶液。在560 nm處測定吸光度，如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.3 羥自由基清除能力的測定

采用Fenton法[9]，335 μL樣品加入到1.4 mL 6 mmol/L的H2O2，加入0.6 mL 20 mmol/L的水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L的FeSO4，37 ℃下恒溫水浴1 h。以去離子水為參比溶液，在562 nm下測定吸光度，如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH甲醇溶液顯色法[10]，40 μL樣品加入到4 mL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液中，再加入450 μL,50 mmol/L的Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4)，25℃下恒溫水浴30 min。以去離子水為參比溶液。在517 nm處測定吸光度，如公式(3)所示：

(3)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.5 ABTS自由基清除能力的測定

采用ABTS過硫酸鉀顯色法[11]，用7 mmol/L的ABTS(用5 mmol/L的PBS配制，pH 7.4)，加入過硫酸鉀，最終濃度為2.45 mmol/L，在室溫下黑暗放置12～16 h。使用前把ABTS自由基用PBS稀釋成在734 nm下吸光度為(0.7±0.02)。取10 μL樣品加入到5 mL上述稀釋液中，在30 ℃下反應(yīng)5 min。以去離子水為參比溶液。在734 nm處測定吸光度，如公式(4)所示：

(4)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.6 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法[12]，30 μL樣品加入到2.5 mL H3PO4緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，然后加入2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀，50 ℃反應(yīng)30 min，再加入100 g/L三氯乙酸2.5 mL，在3 000 r/min下離心10 min，立即取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 1 g/L FeCl3。以去離子水為參比溶液。在700 nm處測定吸光度。

1.3.7 有機(jī)酸含量的測定

有機(jī)酸含量的測定采用高效液相色譜法，參考SCHERER等[13]的方法進(jìn)行。HPLC分離條件：色譜柱為Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)，流動相為0.01 mol/L的KH2PO4溶液(用磷酸調(diào)pH=2.7)，流速1 mL/min，柱溫20 ℃，檢測波長210 nm。待測樣品用0.01 mol/L的KH2PO4溶液(pH 2.7)稀釋5倍，0.22 μm微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

全部試驗均平行進(jìn)行3次，試驗結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、聚類分析及相關(guān)性分析，采用Origin 8.6軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合酵素發(fā)酵過程中體外抗氧化活性的變化

2.1.1 發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化

超氧自由基在活性氧物質(zhì)如H2O2、單線態(tài)氧的形成中起重要作用，主要損害細(xì)胞膜，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及亞微結(jié)構(gòu)，并引起一系列有害的生化反應(yīng)[14]。如圖1所示，百合酵素的超氧自由基清除能力在發(fā)酵初期出現(xiàn)波動后，于發(fā)酵30 d時顯著提高(P<0.05)，并保持緩慢上升的趨勢，在發(fā)酵70 d達(dá)到最高后保持穩(wěn)定，發(fā)酵90 d時為91.83 %，相較發(fā)酵初期提升27.02 %，說明延長發(fā)酵時間有利于百合酵素對超氧自由基清除能力的提高。蔣增良等[15]研究發(fā)現(xiàn),葡萄酵素自然發(fā)酵過程中對超氧自由基的清除能力呈先增加后略微降低再增加的趨勢，第56天時達(dá)到最大，清除率為65.22 %，相較發(fā)酵前增加了12.8 %。

圖1 發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力的變化Fig.1 Changes in superaxide radical scavenging ability during fermentation注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.1.2 發(fā)酵過程中羥自由基清除能力的變化

羥自由基是生物體內(nèi)極具反應(yīng)性的自由基，它幾乎能與活細(xì)胞中任何生物大分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速度極快，在自由基病理學(xué)上被認(rèn)為具有高度的損傷性[16]。圖2表明，百合酵素的羥自由基清除能力在發(fā)酵5～30 d先升高后降低，于發(fā)酵40 d時顯著上升達(dá)到最高(P<0.05)，為55.72 %，相較發(fā)酵5 d時提高414.49 %，隨后下降至42.50 %并趨于穩(wěn)定。陳嶺等[17]對石斛花發(fā)酵液發(fā)酵過程中羥自由基清除能力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)56 d時清除能力最高，達(dá)到43.5%。羥自由基清除能力的提高可能是酵素中有機(jī)酸、多糖等物質(zhì)綜合作用的結(jié)果，包永春[18]通過分析發(fā)現(xiàn)，乳酸、蘋果酸和酒石酸均具有清除羥自由基的能力；也有研究表明酵母壁上的多糖具有一定的羥自由基清除能力[16]。

圖2 發(fā)酵過程中羥自由基清除能力的變化Fig.2 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation

2.1.3 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基，在乙醇溶液中顯深紫色，能吸收抗氧化物的電子而引起樣品顏色的改變，其褪色程度與接受電子數(shù)成正比[19]。DPPH自由基清除能力是評價抗氧化性的常用方法，實驗驗證其具有良好的敏感性[20]。如圖3所示，百合酵素的DPPH自由基清除能力在15～25 d由31.19 %迅速上升至66.21 %(P<0.05)，增幅達(dá)到112.31 %，之后變化幅度減小，并呈先上升后下降的趨勢(P<0.05)，于發(fā)酵60 d時達(dá)到最高的78.93 %，90 d時下降至66.20 %。周偏等[21]研究表明諾麗酵素在自然發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力在54 d時達(dá)到峰值，為71.22 %，與本實驗研究結(jié)果相似。

圖3 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.3 Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation

2.1.4 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化

由圖4可知，百合酵素的ABTS自由基清除能力在發(fā)酵5～50 d呈不規(guī)則變化，且變化明顯；發(fā)酵50 d后呈先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)，于發(fā)酵70 d時達(dá)到最高，為35.18 %，相較發(fā)酵5 d時提高了188.12 %，可見發(fā)酵時間對百合酵素的ABTS自由基清除能力有較大影響。陳小偉等[22]發(fā)現(xiàn)延長發(fā)酵時間有利于提高咖啡果皮酵素對ABTS自由基的清除能力，發(fā)酵第48天時達(dá)到91.74 %，與本研究結(jié)果不同。ABTS自由基是一種過氧化氫酶的底物，羅澤江等[14]研究表明，有機(jī)酸、維生素和酚類物質(zhì)具有清除ABTS自由基的能力，其作用取決于分子質(zhì)量、芳香環(huán)數(shù)量和羥基取代基等。

圖4 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.4 Changes in ABTS radical scavenging ability during fermentation

2.1.5 發(fā)酵過程中還原力的變化

由圖5可知，百合酵素的還原力在發(fā)酵15～30 d出現(xiàn)波動后，隨發(fā)酵進(jìn)行持續(xù)上升(P<0.05)，于發(fā)酵60 d時達(dá)到最高的0.96，相較發(fā)酵5 d時增加了122.48 %，之后略有降低(P<0.05)，但在發(fā)酵90 d時回升至0.94。還原力的大小不僅與自由基的清除有關(guān)，還與過氧化物降解等因素有關(guān)[23]?？梢姲l(fā)酵時間增加有利于提升百合酵素的還原力。蔣增良等[15]試驗結(jié)果與本研究相似，葡萄酵素的還原力在自然發(fā)酵過程中呈上升趨勢，在56 d后達(dá)到 0.367，與未發(fā)酵之前相比，提高了17.2 %。

圖5 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.5 Changes in reducing power during fermentation

2.2 百合酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸的變化

圖6為有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖，圖7、圖8分別為發(fā)酵5 d和90 d時百合酵素樣品有機(jī)酸HPLC色譜圖，由圖6～圖8可知，百合酵素共含有8種有機(jī)酸，抗壞血酸、馬來酸和沒食子酸未檢出。百合酵素的總有機(jī)酸含量隨發(fā)酵進(jìn)行持續(xù)上升(P<0.05)，至發(fā)酵60 d時達(dá)到(16.642±0.58) g/L，相較發(fā)酵5 d時的(5.670±0.02) g/L增長193.50 %，90 d時下降至(15.266±0.30) g/L。草酸、L-蘋果酸、莽草酸、乳酸、醋酸、琥珀酸含量在發(fā)酵過程中的變化趨勢類似，均隨發(fā)酵時間增加顯著升高，至60～80 d達(dá)到最高后趨于穩(wěn)定或略有下降，發(fā)酵90 d時其含量較5 d時分別提高194.50 %、44.58 %、31.77 %、133.46 %、207.83 %和2 938.67%；而L-酒石酸和檸檬酸含量呈不規(guī)則變化。發(fā)酵過程中，乳酸、醋酸的含量遠(yuǎn)高于其他種類有機(jī)酸(P<0.05)，發(fā)酵90 d時分別為(5.347±0.21) g/L和(4.179±0.07) g/L，占總有機(jī)酸含量的62.40 %。發(fā)酵各時段不同有機(jī)酸含量平均值排序為：乳酸>醋酸>L-蘋果酸>琥珀酸>草酸>檸檬酸>莽草酸>L-酒石酸。

1-草酸，2-L-酒石酸，3-L-蘋果酸，4-莽草酸，5-抗壞血酸，6-乳酸，7-醋酸，8-檸檬酸，9-琥珀酸，10-馬來酸，11-沒食子酸圖6 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of organic acids standard

圖7 發(fā)酵5 d百合酵素樣品有機(jī)酸的HPLC色譜圖Fig.7 Organic acids HPLC chromatogram of lilium Jiaosu after 5 d fermentation

圖8 發(fā)酵90 d百合酵素樣品有機(jī)酸的HPLC色譜圖Fig.8 Organic acids HPLC chromatogram of lilium Jiaosu after 90 d fermentation

表1 百合酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量變化 單位：g/L

注:同列數(shù)據(jù)末尾不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同行數(shù)據(jù)末尾不同數(shù)字表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 發(fā)酵過程中有機(jī)酸變化時間特性的聚類分析

采用類間平均鏈鎖法(between groups linkage)對百合酵素不同發(fā)酵時間的有機(jī)酸含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖9所示，在歐式平方距離15處，12個不同發(fā)酵時間的百合酵素樣品可以聚為3類。第1類發(fā)酵階段為5～10 d，其特點是百合酵素的有機(jī)酸含量處于較低水平，可能是發(fā)酵初期微生物還處于適應(yīng)期，破解細(xì)胞壁的酶類物質(zhì)及代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸較少[22]；第2類發(fā)酵階段為15～60 d，其特點是隨發(fā)酵時間延長,有機(jī)酸含量顯著上升，可能是因為隨著植物材料的降解，環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)更為豐富，產(chǎn)酸微生物大量繁殖而生成乳酸、醋酸等次生代謝產(chǎn)物；第3類由70、80、90 d組成，聚集了有機(jī)酸含量較高且變化趨于平緩的階段，可能原因是糖類物質(zhì)大量消耗，使產(chǎn)酸菌利用有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖[23]。

圖9 百合酵素發(fā)酵時間聚類樹狀圖Fig.9 Dendrogram obtained from clustering analysis of fermentation time of lilium Jiaosu

2.4 發(fā)酵過程中有機(jī)酸種類特性的聚類分析

對百合酵素發(fā)酵過程不同種類有機(jī)酸進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖10所示，在歐式平方距離15處，8種有機(jī)酸可以分為2類。第1類由L-蘋果酸、醋酸、草酸、琥珀酸、莽草酸和乳酸組成，聚入此類的有機(jī)酸含量較高或中等，發(fā)酵過程中總體呈明顯上升趨勢；第2類由L-酒石酸和檸檬酸組成，其特點是屬于低含量有機(jī)酸，且隨發(fā)酵進(jìn)行呈不規(guī)則變化。

圖10 百合酵素有機(jī)酸種類聚類樹狀圖Fig.10 Dendrogram obtained from clustering analysis of organic acid species of lilium Jiaosu

2.5 有機(jī)酸含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性

根據(jù)表2，百合酵素發(fā)酵過程中5種體外抗氧化性指標(biāo)均與乳酸和L-蘋果酸含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其中還原力、DPPH自由基清除能力和超氧自由基清除能力與乳酸和L-蘋果酸含量呈極強(qiáng)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)0.819～0.902)；除ABTS自由基清除能力外，其余4種體外抗氧化性指標(biāo)均與草酸、醋酸含量具有極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，其中，還原力、DPPH自由基和超氧自由基清除能力與草酸和醋酸含量呈極強(qiáng)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)0.849～0.945)。說明發(fā)酵過程中乳酸、醋酸等對百合酵素體外抗氧化性有明顯作用。

表2 有機(jī)酸與抗氧化活性之間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients between organic acids and antioxidant activity

注：ABTS-ABTS自由基清除能力；DPPH-DPPH自由基清除能力；HR-羥基自由基清除能力；SR-超氧自由基清除能力；RP-還原力;**表示在0.01水平上呈極顯著性相關(guān)，*表示0.05水平上呈顯著性相關(guān)。

3 結(jié)論

目前關(guān)于百合酵素的研究鮮有報道，本文對百合酵素發(fā)酵過程有機(jī)酸及體外抗氧化活性變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，發(fā)酵過程中超氧自由基清除能力和還原力總體呈上升趨勢，羥自由基和DPPH自由基清除能力呈先上升后下降的趨勢，ABTS自由基清除能力呈不規(guī)則變化。百合酵素有機(jī)酸組成及含量豐富，以乳酸和醋酸為主，此外還含有草酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、莽草酸、檸檬酸及琥珀酸；除L-酒石酸和檸檬酸含量呈不規(guī)則變化外，其余各有機(jī)酸總體變化趨勢相同，均隨發(fā)酵進(jìn)行上升，60～80 d達(dá)到最高后趨于穩(wěn)定或降低。在類間距離15處，聚類分析將發(fā)酵過程分為3類，即適應(yīng)期、增長期和平緩期；將有機(jī)酸分為2類，即呈上升趨勢且含量較高的有機(jī)酸，以及呈不規(guī)則變化的有機(jī)酸；聚類分析的結(jié)果較好地反映出發(fā)酵過程各類有機(jī)酸的差異性，為百合酵素發(fā)酵階段的調(diào)控提供了良好的理論參考。相關(guān)性分析表明，發(fā)酵過程中乳酸、醋酸等有機(jī)酸是影響百合酵素抗氧化活性的重要因素，但百合酵素中可能同時存在多糖、游離氨基酸等活性物質(zhì)，因此有必要對百合酵素中有機(jī)酸與其他功能成分的聯(lián)合抗氧化作用進(jìn)行研究。食用植物酵素的傳統(tǒng)制備工藝采用自然發(fā)酵，屬混菌發(fā)酵過程，除以純培養(yǎng)方法獲取個體優(yōu)勢菌種外，有必要開展對發(fā)酵過程微生物整體群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律的研究，明確對有機(jī)酸變化起主導(dǎo)作用的核心微生物菌群，為百合酵素發(fā)酵階段的理性調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。