轉(zhuǎn)錄組中LncRNA在牛上的研究進(jìn)展

龔龑，劉士釗，馬海明

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南普菲克生物科技有限公司，長沙 414000）

自20世紀(jì)70年代以來，蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄一直是分子遺傳學(xué)研究的重點。很多物種的基因組在轉(zhuǎn)錄過程中均產(chǎn)生數(shù)量巨大的非編碼RNA（ncRNA0），早期其被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的“垃圾”和翻譯過程中的“噪聲”，但伴隨越來越多的ncRNA被鑒定，逐漸證明其在機體發(fā)育和病理等過程中均有調(diào)控作用。第一個長鏈非編碼RNA（LncRNA）于1990年被發(fā)現(xiàn)，其轉(zhuǎn)錄物缺少長的開放閱讀框，表明RNA本身是功能性的，而不是編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物[1]。同樣，對X染色體失活至關(guān)重要的Xist也在1991年被發(fā)現(xiàn)，并證明其也缺乏編碼蛋白能力[2]。2002年，日本科學(xué)家在對小鼠的全長cDNA進(jìn)行人工注釋時，確定了大部分不能編碼蛋白的核酸序列為長鏈非編碼RNA，由此拉開了長鏈非編碼RNA的研究序幕[3]。如今在基因組測序技術(shù)飛速發(fā)展的帶動下，整個轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究進(jìn)展也得到了快速發(fā)展，而利用二代和三代高通量測序技術(shù)，使得大量的lncRNA被發(fā)現(xiàn)和鑒定。

1 LncRNA分類及其生物學(xué)功能

長鏈非編碼RNA的長度大于200個核苷酸，大部分的lncRNA具有3’-poly-A尾和 5'-7甲基鳥苷帽，其結(jié)構(gòu)與mRNA相似，均由RNA聚合酶II合成[4]。Lnc RNA可以折疊成多種二級結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)其與DNA、RNA和蛋白質(zhì)的相互作用。根據(jù)基因組的位置可以將lncRNA分為基因間lncRNA、內(nèi)含子lncRNA和反義lncRNA。其中，基因間長鏈非編碼RNA位于編碼或非編碼基因之間；內(nèi)含子長鏈非編碼RNA位于蛋白編碼基因的內(nèi)含子中；反義長鏈非編碼RNA則是從編碼基因的相反鏈轉(zhuǎn)錄而來，其轉(zhuǎn)錄起始位點位于宿主基因的下游，轉(zhuǎn)錄本通常與相應(yīng)mRNA序列有重疊[5]。大多數(shù)的lncRNA（＞60%）是上游反義RNA，位于活性蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點附近，可能從啟動子中產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄的IncRNA/mRNA基因?qū)Α＿€有相當(dāng)一部分的lncRNA（大約20%）位于增強子區(qū)域。余下的lncRNA（大約5%）來自于與注釋基因重疊的正義和反義轉(zhuǎn)錄本，或者（大約5%）來自于未注釋的區(qū)域，這些lncRNA有時也被稱為基因間lncRNA[6]。

LncRNA在細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期、代謝、凋亡、分化和維持等多個過程中發(fā)揮著生物學(xué)功能：①通過作為分子支架參與染色質(zhì)修飾和機構(gòu)重塑；②增強子衍生的lncRNA通過使染色體成環(huán)控制增強子與同源啟動子之間的聯(lián)系；③可以與剪接因子（SFs）和諸如SR或hnRNP蛋白這一類剪接調(diào)節(jié)劑相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)RNA的可變剪接；④含有與miRNA序列互補的位點，從而隔離它們并阻止其與mRNA結(jié)合，起到拮抗miRNA的作用，其方式類似海綿，也因此成為“海綿效應(yīng)”；⑤反義lncRNA可以對相對應(yīng)的正義轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄有促進(jìn)或抑制作用；⑥直接對mRNA的衰減有調(diào)控作用[7]。

2 LncRNA在牛上的研究進(jìn)展

長鏈非編碼RNA通過對基因印記、染色質(zhì)重塑、剪接調(diào)控、細(xì)胞分化調(diào)控、mRNA降解和翻譯的調(diào)控來發(fā)揮其生物學(xué)功能。它們從轉(zhuǎn)錄噪聲到成為新的基因表達(dá)調(diào)控因子，在基因調(diào)控的各個方面，包括表觀遺傳調(diào)控、X染色體失活、基因組印跡、核和細(xì)胞質(zhì)販運、轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接等都發(fā)揮了調(diào)控作用。尤其近年來，lncRNA的研究成為熱點，但主要集中在對人和小鼠的神經(jīng)性疾病、腫瘤、胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化等的影響方面，而在家畜上的研究則相對滯后。目前，IncRNA在家畜上的研究主要集中在細(xì)胞分化、脂肪合成、胚胎及肌肉發(fā)育的調(diào)控方面。盡管IncRNA缺乏編碼能力，但許多l(xiāng)ncRNA在各種生物過程中都發(fā)揮著功能作用，這為基因組復(fù)雜的結(jié)構(gòu)組織和功能增加了一個新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.1 與肌肉發(fā)育相關(guān)的lncRNA研究

牛肉為人類提供了優(yōu)質(zhì)的動物蛋白，肌肉的發(fā)育是肉牛養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)性狀。Liu等通過對海福特肉牛的背部、肩胛部、肋間和臀部的肌肉組織進(jìn)行RNA測序，鑒定和篩選了7 188條lncRNA序列，發(fā)現(xiàn)這些lncRNAs在開放閱讀框和表達(dá)水平上與其他哺乳動物lncRNAs有相似特征。確定了IncRNA的染色體位置和全局表達(dá)模式，還檢測到36個Inc RNAs、62個miRNAs和12個mRNA之間與肌肉發(fā)育相關(guān)的Inc RNA-miRNA-mRNA的重要相互作用關(guān)系，提供了牛骨骼肌特有的IncRNA的表達(dá)模式[8]。隨后，Yue等又在這四個部位的肌肉組織中鑒定出高表達(dá)量的lncRNA-YYW。在成肌細(xì)胞分化過程中，IncRNA-yyw的表達(dá)逐漸增加，其過表達(dá)增加了細(xì)胞周期中DNA合成階段的細(xì)胞數(shù)目，上調(diào)了肌原性標(biāo)記物肌生成素和肌球蛋白重鏈的表達(dá)。通過微陣列分析表明lncRNA-yyw正向調(diào)節(jié)生長激素1及其下游基因akt1和pik3cd在牛成肌細(xì)胞中的表達(dá)。LncRNA-yyw還通過過表達(dá)證實了可以促進(jìn)GH1的表達(dá)，進(jìn)一步上調(diào)了其下游基因，促進(jìn)了成肌細(xì)胞的增殖[9]。Choi等通過對韓牛的骨骼肌和脂肪組織研究，根據(jù)表達(dá)水平的差異，識別了12個與剪切力相關(guān)和6個與體重相關(guān)的lnRNAs，這是在韓牛種群育種策略中兩個重要的性狀。同時，還識別出在牛轉(zhuǎn)錄物中的11個lncRNAs，其中4個與肌肉功能相關(guān)[10]。利用配對末端RNA測序，檢測利木贊肉牛胸最長肌，發(fā)現(xiàn)一些在肌肉中表達(dá)的lncRNA位于肉質(zhì)性狀的數(shù)量性狀位點內(nèi)，說明在調(diào)節(jié)牛肉品質(zhì)方面lncRNA可能存在功能作用[11]。

2.2 與泌乳相關(guān)的lncRNA研究

在不同的日糧添加過程中，可以改變奶牛的產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)。在日糧的變化中，lncRNA的調(diào)節(jié)功能也發(fā)生了變化，這是受到了日糧變化的影響。在奶牛精料中分別添加5%的亞麻籽油和紅花油進(jìn)行飼喂試驗，然后活體取乳腺組織樣，進(jìn)行RNA測序。結(jié)果在總共鑒定的4 955個lncRNAs（325個已知的和4 630個新的）中，亞麻籽油組和紅花油組中潛在的順式靶基因分別為59個和494個。lncRNA的順式靶基因的富集分析表明，其在免疫功能、核酸代謝和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、Notch、cAMP和TGF-β信號通路中起到了重要的作用。兩個處理組分別鑒定了32個和21個差異表達(dá)的lncRNA，其中有6個潛在的順式lncRNA基因（KCNF1、STARD13、BCL6、NxPE2、HHIPL2和MMD）在不同日糧中，對乳腺功能發(fā)揮了調(diào)控作用[12]。lncRNA對產(chǎn)奶的調(diào)控，還受到了外界環(huán)境的影響。當(dāng)處于熱應(yīng)激中，奶牛整個機體都會產(chǎn)生反應(yīng)，最終體現(xiàn)在采食量和泌乳量的下降。以往對哺乳動物熱應(yīng)激分子機制的研究主要集中在蛋白質(zhì)編碼基因和短鏈非編碼RNA的調(diào)控作用上?，F(xiàn)在通過RNA測序技術(shù)研究了熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛的lncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在奶牛乳腺中3 763個已知和24 795個新的lncRNAs，其中上調(diào)的有156個，下調(diào)的有18個。通過順式作用分析有16 474個lncRNAs在編碼蛋白基因附近。這也說明了在熱應(yīng)激狀態(tài)下lncRNA對乳腺功能發(fā)揮了調(diào)控功能[13]。

成母牛的生產(chǎn)周期，主要分為泌乳期和干奶期，通過對lncRNA的研究也發(fā)現(xiàn)了不同的生產(chǎn)階段存在著轉(zhuǎn)錄差異。Yang等從干奶期和泌乳期荷斯坦牛的乳腺組織中鑒定出差異表達(dá)的3 746個lncRNAs和2 890個基因。靶基因的功能富集分析表明，這些lncRNAs參與了與哺乳相關(guān)的信號途徑，包括細(xì)胞周期、JAK-STAT、細(xì)胞黏附和PI3K-Akt信號通路。同時還發(fā)現(xiàn)與哺乳相關(guān)的miR-221可能與lncRNA TCONS_00040268、TCONS_00137654、TCONS_00071659和TCONS_00000352相互作用，說明這些lncRNAs可能在哺乳周期發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能[14]。而在奶牛泌乳高峰期和泌乳末期，通過對奶牛乳腺組織采樣研究分析，發(fā)現(xiàn)在鑒定的1 000個lncRNAs中，有117個在泌乳高峰期和泌乳末期呈差異表達(dá)。牛lncRNA較短，外顯子數(shù)較少，表達(dá)水平明顯低于蛋白質(zhì)編碼基因。差異表達(dá)的lncRNAs中有72個與340個蛋白編碼基因共表達(dá)，主要是與脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝有關(guān)，包括過氧化物酶體增殖物激活受體和5’腺苷激活的蛋白激酶信號通路。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有12個lncRNAs與泌乳性能相關(guān)，并發(fā)揮了重要作用[15]。

Zeng等對牛奶中的外泌體用RNA測序技術(shù)研究，首次發(fā)現(xiàn)牛奶中含有l(wèi)ncRNA，經(jīng)鑒定3 475個新的和6個注釋的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)了外泌體中的lncRNA與其他哺乳動物的長度、外顯子數(shù)和開放閱讀框的共有特征，然而不同的是其表達(dá)量卻高于mRNA。選擇其中高表達(dá)的12個lncRNAs進(jìn)行GO和KEGG分析，表明這些lncRNAs有調(diào)節(jié)免疫功能及成骨細(xì)胞生成、神經(jīng)發(fā)育、生殖、細(xì)胞增殖和細(xì)胞-細(xì)胞通信的功能。這些高表達(dá)的lncRNAs在牛奶外泌體中的表達(dá)水平在不同的泌乳階段表現(xiàn)出不同的變化，說明在泌乳不同階段發(fā)揮了不同的功能[16]。

2.3 與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化相關(guān)的lncRNA研究

在牛的卵母細(xì)胞和早期胚胎中發(fā)現(xiàn)的大量的Inc RNA分子中，選擇了在細(xì)胞質(zhì)中的3個候選基因，發(fā)現(xiàn)與多核糖體相關(guān)，其中一個基因與卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞相關(guān)。在成熟卵母細(xì)胞中敲除相關(guān)轉(zhuǎn)錄本會提高發(fā)育率，使得囊胚更大。通過對這些囊胚的轉(zhuǎn)錄組和甲基化分析，發(fā)現(xiàn)有的基因?qū)δ遗叩拇婊詈苤匾f明lncRNA對于卵母細(xì)胞的發(fā)育有調(diào)控作用[17]。

通過分析胎兒期和成年期牛骨骼肌組織中Inc RNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了13 580個IncRNAs候選基因。其中許多l(xiāng)ncRNAs在兩個發(fā)育階段有表達(dá)差異。在所有下調(diào)的IncRNAs中表達(dá)水平最高的IncRNA-MDNCR，可以與miR-32結(jié)合，GosB是miR-32的靶基因，可以促進(jìn)牛原代成肌細(xì)胞的分化。MDNCR的過表達(dá)可以消除miR-32的作用進(jìn)而增加GosB的表達(dá)量，說明MDNCR通過海綿作用miR-133a促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖[18]。而lncRNA-FAM200B在胚胎、新生犢牛和成年牛的骨骼肌中均有不同程度的表達(dá)。牛骨骼肌中的FAM200B含有2個外顯子共472個核苷酸，在啟動子區(qū)富含sp1轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)肌源性調(diào)節(jié)因子MYoD和DNA序列的結(jié)合。在成肌細(xì)胞增殖和分化階段，F(xiàn)AM200B的表達(dá)趨勢與MYoG和MYf5的表達(dá)趨勢呈正相關(guān)，表明FAM200B是肌肉發(fā)育的正調(diào)控因子[19]。在Sun等同樣的研究中發(fā)現(xiàn)了401個lncRNAs在三個發(fā)育階段之間的差異表達(dá)。其中IncMD在成肌細(xì)胞分化過程中逐漸上調(diào)。而lncMD沉默則降低了兩個成熟的肌源性標(biāo)記——肌球蛋白重鏈(MHC)和肌原蛋白(Myog)的表達(dá)。LncMD是miR-125b的分子海綿，胰島素樣生長因子2(IGF2)是miR-125b在牛中的直接靶點。IncMD水平與牛肌肉組織IGF2 mRNA水平呈正相關(guān)[20]。

LncRNA還參與了組織脂肪發(fā)生，脂肪酸、膽固醇和磷脂代謝和轉(zhuǎn)運，以及高密度和低密度脂蛋白（HDLs和LDLs）的形成。LncRNA還針對一些在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)[21]。與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的ADNCR是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。它通過靶向mir-204發(fā)揮作用，在mRNA和蛋白質(zhì)水平上顯著調(diào)節(jié)靶SIRT1基因在前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)，從而抑制脂肪的發(fā)生[22]。LncRNA-ADNCR通過作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)對miR-204起作用而抑制脂肪細(xì)胞的分化，由于ADNCR在牛前脂細(xì)胞中表達(dá)量的下調(diào)從而增強miR-204靶基因SIRT 1的表達(dá)。SIRT 1通過與NCoR與SMART對接而抑制PPARγ活性[23]。

雄性種系干細(xì)胞（mGSCS）的自我更新和分化為持續(xù)精子發(fā)生提供了基本功能。GDNF、bFGF、csf 1、EGF等生長因子能維持MGSCS的自我更新。IGF-1可激活A(yù)KT和ERK信號通路的磷酸化，在調(diào)節(jié)牛MGSCS的增殖和凋亡中起重要作用。在IGF-1受體（IGF-1R）被IGF-1R特異性抑制劑阻斷后，MGSCS的增殖率降低，而凋亡率增加。LncRNA H19通過IGF-1信號通路參與MGSCS的增殖和凋亡調(diào)控，當(dāng)H19被干擾時，生精小管中的細(xì)胞數(shù)減少[24]。

2.4 與疾病相關(guān)的lncRNA研究

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中造成經(jīng)濟(jì)損失最大的常見疾病。LncRNA在人類乳腺發(fā)育及乳腺疾病上有廣泛深入的研究，但是在奶牛乳房炎上的研究卻較少。Tong等通過CPAT、CNCI、CPC和hmmscan分析軟件在886個未知基因間的轉(zhuǎn)錄本中，鑒定了184個lncRNAs，與2016年的非編碼數(shù)據(jù)庫和家畜長鏈非編碼數(shù)據(jù)庫（ALDB）進(jìn)行比對，在牛乳腺中發(fā)現(xiàn)了112個新的lncRNAs。研究發(fā)現(xiàn)36個lncRNAs位于172個乳相關(guān)QTLs中，重要的是在臨床乳腺炎QTL區(qū)發(fā)現(xiàn)有1個lncRNA，說明lncRNA對奶牛乳房炎可能存在調(diào)控作用[25]。Ma等通過建立兩種炎癥性牛乳腺腺泡細(xì)胞（mac-t）模型，然后感染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，發(fā)現(xiàn)奶牛乳房組織和炎癥細(xì)胞中l(wèi)inc-Xist的表達(dá)異常增加，Xist沉默可顯著增加大腸桿菌或金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。此外，Xist基因敲除還能抑制細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞在炎癥條件下的凋亡；Xist可抑制大腸桿菌或金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的NF-Kb磷酸化和NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生。NF-KB途徑的激活可以促進(jìn)Xist的表達(dá)，Xist的表達(dá)還可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)NF-KB炎癥途徑[26]。

犢牛病毒性腹瀉（BVDV）可以導(dǎo)致犢牛出現(xiàn)高熱和腹瀉，死亡率較高，對犢牛危害極大，同時還可以導(dǎo)致母牛出現(xiàn)流產(chǎn)。Ma等通過牛腎細(xì)胞（MDBK）感染BVDV病毒，然后進(jìn)行測序分析。在感染后的3個階段共有1 236個IncRNA轉(zhuǎn)錄本和3 261個mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了差異調(diào)節(jié)。在感染過程中，發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)[27]。

通過對印度瘤牛角質(zhì)磷狀癌細(xì)胞中的差異表達(dá)與腫瘤相關(guān)編碼基因的分析，發(fā)現(xiàn)了有59個差異顯著的表達(dá)基因和19個lncRNAs。使用相關(guān)分析鑒別了共表達(dá)的mRNA-LNCaNAs，確定了聯(lián)合表達(dá)的mRNAIcRNAs與其在角癌中的調(diào)控作用之間的關(guān)系。證實7個上調(diào)lncRNA（XLOC_000016、XLOC_002198、XLOC_002851、XLOC_007383、XLOC_010701、XLOC_010272和XLOC_011517）和一個下調(diào)lncRNA（XLOC_011302）與11個角蛋白家族蛋白、角蛋白相關(guān)蛋白家族、角質(zhì)蛋白、絲氨酸家族蛋白和金屬硫蛋白相關(guān)的基因之間有正相關(guān)聯(lián)系，并通過細(xì)胞生長、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞遷移等方式在鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[28]。

3 小結(jié)與展望

目前，盡管lncRNA在家畜上的研究還處于起步階段，但是近年來相關(guān)研究開展迅速，尤其在肉牛、奶牛等反芻動物的生產(chǎn)性能、繁殖、細(xì)胞分化、疾病、育種等方面進(jìn)行了大量的研究。但是，對于lncRNA的研究深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如mRNA和micRNA，lncRNA的物種數(shù)據(jù)庫相關(guān)的數(shù)據(jù)還是不夠，今后應(yīng)該列為重要研究內(nèi)容。