牛結(jié)核病流行現(xiàn)狀與診斷技術(shù)研究

李少晗，崔尚金，秦彤

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)北京科學觀測站，北京 100193）

牛結(jié)核病 （Bovine Tuberculosis） 是由牛型結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium）引起的一種慢性消耗性人畜共患病。在我國，牛結(jié)核病屬于二類動物疫病。結(jié)核病作為全球性的健康問題，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，在世界范圍內(nèi)有三分之二的人、即20億人口被其感染，每年導(dǎo)致800萬人發(fā)病，200萬～300萬人死亡。我國的結(jié)核病流行一直十分嚴重，其嚴重性僅次于印度，居世界第二位[1]。

牛結(jié)核病的傳染流行不僅阻礙著奶牛業(yè)的發(fā)展，而且還關(guān)乎人類生命健康。楊醉宇等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，患結(jié)核病的牛中有9.5%是由人結(jié)核分枝桿菌感染引起的，而在患結(jié)核病的病人中有10.6%是由牛分枝桿菌感染引起的，所以人、牛之間存在一定的互感性。早在1960年世界衛(wèi)生組織 （WHO） 專家委員會第七次會議就指出：在那些還存在牛結(jié)核病流行的國家中，人類始終受到該病的威脅，除非消滅牛結(jié)核病，否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的[3]。

1 流行病學研究

1.1 傳染源及傳播途徑

奶?；疾≈?，結(jié)核分枝桿菌可隨鼻液、涎液、糞便和乳汁等排出體外。傳播途徑可以分為四種類型[4]：①空氣傳播。牛結(jié)核病主要通過呼吸道進行傳播，規(guī)?；B(yǎng)殖場的養(yǎng)殖密度很大，空氣傳播導(dǎo)致發(fā)病的概率最高。②經(jīng)口傳播。牛結(jié)核分枝桿菌具有很強的體外存活能力，牛結(jié)核桿菌耐干燥、耐濕冷、耐酸堿，在干痰中可以存活10個月，可在水中存活5個月。動物將病原菌排出體外，會污染飼料和飲水，病牛的牛奶也是重要的傳染源。③撕咬傳播?；疾游锏耐僖汉捅且褐薪Y(jié)核桿菌含量很高，處于發(fā)情期的動物會為了爭奪伴侶互相撕咬造成傳播。④垂直傳播。懷孕的母?？梢越?jīng)過胎盤傳播給胎兒，造成新出生的小牛感染結(jié)核桿菌。

1.2 易感動物及感染途徑

奶牛對牛結(jié)核分枝桿菌最易感，山羊、綿羊、豬、人和靈長類動物都對其易感。犬可以作為牛結(jié)核分枝桿菌的中間宿主。病牛產(chǎn)生飛沫，污染空氣環(huán)境，牛及人可通過呼吸感染。健康牛進食被污染后的牧草和飲水后經(jīng)消化道感染。人主要是通過消化道被感染，如吃未經(jīng)檢疫或檢疫不合格非正規(guī)廠家的結(jié)核病患牛的肉制品，或是飲用未經(jīng)巴氏消毒或煮沸的結(jié)核病患牛的奶。某些養(yǎng)殖場為了減少經(jīng)濟損失，將病牛的牛奶喂牛犢造成犢牛感染。

1.3 流行病學調(diào)查

1985年、1987年兩次全國奶牛抽樣調(diào)查中，牛結(jié)核病患病率分別為5.38%和5.43%。2001年對全國26個省市奶牛進行的調(diào)查中，其中有些省份的奶牛結(jié)核病患病率高達10.18%；2002年全國多個省市調(diào)查表明，患病率超過1%的省份有10個，個別省高達7%。張喜悅等[5]2016年利用實驗室制備的TB γ－干擾素 ELISA 診斷試劑盒對我國北方33個奶牛場進行結(jié)核病檢測，結(jié)果顯示個體陽性率為13.99%，群陽性率為51.51%，其中牧區(qū)、郊區(qū)和農(nóng)區(qū)的個體陽性率分別為0、13.32%和23.81%，牧區(qū)的陽性率顯著低于郊區(qū)和農(nóng)區(qū)。韓猛等[6]2010～2012年通過IFN-γ釋放試驗對山東省不同地區(qū)規(guī)?；膛鲋械? 678頭奶牛進行牛結(jié)核病流行病學調(diào)查，結(jié)果表明2010、2011和2012年年平均陽性率分別為35.42%、29.27%和25%。郭開彬[1]2008年左右利用經(jīng)典PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗對四川省成都市雙流縣1 283頭奶牛進行結(jié)核病檢測，其陽性率為25.57%，并且調(diào)查發(fā)現(xiàn)縣城內(nèi)養(yǎng)殖場和距離大都市較近的大型養(yǎng)殖場陽性檢出率明顯高于距離城市區(qū)較遠或位于偏遠丘區(qū)鎮(zhèn)的小型養(yǎng)殖場。陽愛國等[7]2012年對四川省奶牛結(jié)核病調(diào)查結(jié)果顯示平均陽性率為1.56%。2016～2017年，陽愛國等再次對四川省主要奶牛養(yǎng)殖地區(qū)結(jié)核病進行調(diào)查，共調(diào)查了81個養(yǎng)殖場（戶），其中包括15個規(guī)模場、17個適度規(guī)模場、49個散養(yǎng)戶，結(jié)果顯示陽性場占4.94%，規(guī)模場的個體陽性率為0.08%，適度規(guī)模場及散養(yǎng)戶的個體陽性率為0.14%。石琴，袁立崗等[8]在2012～2018年每年的4月份和10月份，利用結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗對新疆烏魯木齊市近郊的6個奶牛養(yǎng)殖小區(qū)進行奶牛結(jié)核病流行病學監(jiān)測，連續(xù)7年累計檢測奶牛56 668頭，結(jié)果顯示，平均陽性率由2012年的1.49%下降到2018年的0.33%，并且有2個奶牛養(yǎng)殖小區(qū)達到了國家標準結(jié)核病凈化水平，取得了預(yù)期的防控效果。但仍有少數(shù)奶牛養(yǎng)殖小區(qū)結(jié)核病陽性率偏高，需要繼續(xù)實施嚴格的防控措施，爭取完成該地區(qū)奶牛結(jié)核病的凈化。王云霞等[9]對1996～2005年陜西漢中市奶牛結(jié)核病的檢測數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示伴隨著該地區(qū)奶牛存欄數(shù)的不斷上升，奶牛結(jié)核病陽性檢出率亦有所上升，10年內(nèi)在1997～1998年和2000～2001年兩個時間段漢中市陽性檢出率有所下降，但10年內(nèi)總體是呈上升趨勢的。通過以上流行病學調(diào)查說明不同地區(qū)奶牛結(jié)核病發(fā)病率不同，存在著明顯的地域差異，近些年來總體流行呈上升趨勢。

1.4 流行原因及分析

1.4.1 養(yǎng)殖場位置、規(guī)模

郭開彬等的調(diào)查結(jié)果顯示，距離中心城市區(qū)或者副城市區(qū)較近的、發(fā)展較早、交通發(fā)達便利、牛只流動頻繁的養(yǎng)殖場其結(jié)核病陽性率明顯高于發(fā)展慢、規(guī)模小、偏遠鄉(xiāng)鎮(zhèn)的養(yǎng)殖場。陽愛國[7]的調(diào)查結(jié)果顯示規(guī)模場的陽性率低于適度規(guī)模場和散養(yǎng)戶，這是由于規(guī)模場較適度規(guī)模及散養(yǎng)戶在圈舍選址、建設(shè)布局等方面設(shè)計更加科學，隔離、消毒等措施實施更加到位，廠區(qū)管理制度更加標準、嚴格。通過張喜悅等[5]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在北方地區(qū)牧區(qū)的陽性率顯著低于郊區(qū)和農(nóng)區(qū)，可能是因為牧區(qū)牛飼養(yǎng)密度相對較小，并且在放牧飼養(yǎng)條件下，牛只運動量較大，可以增強機體免疫力，同時牧區(qū)氣溫干燥、日照時間長，由病畜排出的結(jié)核桿菌不能長期存活，所以感染率通常較低[10]。

1.4.2 養(yǎng)殖場的消毒、管理及環(huán)境因素

某些養(yǎng)殖場( 戶) 結(jié)核病流行的主要原因可歸結(jié)為：工作人員進入場區(qū)不洗澡、不更換衣服、不換膠靴等；場內(nèi)僅采用噴霧方式消毒，消毒工作不到位；共用擠奶器；飼料飲水質(zhì)量不合格；糞便沒有無害化處理造成土壤污染；混飼養(yǎng)其他動物等。2017年北京市密云區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場結(jié)核病陽性率高達29.5%，調(diào)查發(fā)現(xiàn)其感染因素可能是飼喂從疫區(qū)購進的牧草[11]。

1.4.3 奶牛流動及隔離情況

養(yǎng)殖場引進或者銷售奶牛較頻繁，多數(shù)奶牛場無專用的隔離場或隔離場建設(shè)不合理，部分奶牛場引進牛只時未經(jīng)檢疫就直接混群飼養(yǎng)，很容易造成不同地區(qū)疫病的傳播感染。

1.4.4 員工認識與技術(shù)培訓(xùn)水平

部分奶牛養(yǎng)殖場內(nèi)員工學歷較低、年齡較大，對結(jié)核病的危害認識嚴重不足，專業(yè)技術(shù)水平偏低，場內(nèi)缺少專業(yè)相關(guān)的駐場獸醫(yī)，鄉(xiāng)鎮(zhèn)技術(shù)人員技術(shù)不扎實等，也是造成牛結(jié)核病流行的因素之一。

1.4.5 政府監(jiān)管、處理措施

目前相關(guān)養(yǎng)殖場和業(yè)務(wù)部門對該疾病的檢測積極性不夠高，檢測技術(shù)不達標，沒有堅持每年春、秋兩次對奶牛檢測進行全面覆蓋。我國規(guī)定，只要結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗為陽性，就應(yīng)嚴格執(zhí)行撲殺和無害化處理。但由于試驗時受環(huán)境溫度、濕度、試劑質(zhì)量及操作人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗等因素影響，試驗結(jié)果難免有誤差，可能出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象，應(yīng)配合使用γ-干擾素體外釋放ELISA方法。目前，我國相關(guān)政府部門對無害化處理的結(jié)核病陽性牛給予6 000元/頭的補助，但現(xiàn)在一頭成年高產(chǎn)奶牛市場價格在15 000元以上，一頭奶牛按年產(chǎn)5t鮮奶、1t鮮奶3 500元計算，年生產(chǎn)效益至少17 500元，因此農(nóng)戶無法承受淘汰處理帶來的經(jīng)濟損失，存在隱瞞不上報繼續(xù)治療飼養(yǎng)或者私自銷售的現(xiàn)象。

2 主要診斷檢測技術(shù)

2.1 細菌學檢測方法

細菌學檢測主要包括涂片抗酸染色法和細菌分離培養(yǎng)方法。涂片抗酸染色法簡單、快速，借助顯微鏡便可進行，不受環(huán)境的限制，但是這種方法對結(jié)核桿菌的準確檢出率較低，容易出現(xiàn)假陽性[12]。細菌分離培養(yǎng)通常采取痰液等呼吸道分泌物作為病料進行培養(yǎng)，由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時間長，一般需要8周時間，且有10%～20%的病例可能培養(yǎng)失敗，而且存在實驗室操作人員接觸活菌的危險，所以一般不采用此方法。

2.2 免疫學檢測方法

免疫學診斷主要包括結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ體外釋放ELISA試驗、免疫膠體金技術(shù)等方法，目前此類方法應(yīng)用最為廣泛。

牛結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，在機體免疫初期誘發(fā)細胞免疫，細胞免疫隨病情的加重而減弱。隨著機體抵抗能力的降低，結(jié)核分枝桿菌開始向外擴散，進入血液和體液中，誘導(dǎo)機體發(fā)生體液免疫，體液免疫隨病情的加重而增強。結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)是檢測細胞免疫的方法，IFN-γ體外釋放ELISA是檢測體液免疫的方法，從理論上講，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)與IFN-γ體外釋放ELISA方法的陽性結(jié)果并不一定吻合。因此，實際檢測中只采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)或IFN-γ體外釋放ELISA方法是不合理的，并不能檢測出全部的陽性牛，也可能會造成假陽性結(jié)果。應(yīng)以結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測為主，以牛結(jié)核γ-干擾素ELISA試驗檢測進行復(fù)核，以提高檢測準確率，避免產(chǎn)生假陽性。

2.2.1 PDD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)

PDD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗是目前臨床上用于牛結(jié)核病檢測最常用的方法，也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）對牛結(jié)核病檢疫的指定方法。此方法操作簡單，非專業(yè)的基層工作者也能掌握。但是工作量大、檢測時間長，而且實際操作中的人為以及非人為的因素造成的誤差都會使該方法的敏感性和特異性降低。非典型分枝桿菌感染、某些寄生蟲病和藥物作用等非特異性因素均可造成皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)假陽性，但是這些非特異性因素產(chǎn)生的體液免疫水平很低，所以IFN-γ體外釋放ELISA試驗?zāi)軌蚺懦@些因素的影響。

2.2.2 IFN-γ體外釋放試驗

該方法比結(jié)核菌素PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)的敏感性更高。IFN-γ體外釋放ELISA試驗不僅避免了分析試驗結(jié)果時的主觀性，而且相較于周期較長的檢測方法，如細菌培養(yǎng)、結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)等，一次采集血液即可完成檢測，可有效降低工作量，同時檢測也更加快速、準確、高效。奶牛結(jié)核病檢疫中，許多皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)檢測為陽性的牛撲殺剖檢后看不到典型的結(jié)核性病理變化，有的復(fù)檢也不再出現(xiàn)陽性反應(yīng)，由此導(dǎo)致誤殺了假陽性的牛，造成很大的經(jīng)濟損失。ELISA試驗正好彌補了這一缺點，在感染后期細胞免疫水平降低，進入體液免疫階段后，ELISA試驗的準確檢出率要比變態(tài)反應(yīng)高得多，而且試驗結(jié)果與剖檢結(jié)果也較為符合。

2.2.3 免疫膠體金技術(shù)

該方法具有操作簡單、耗時短、特異性強、靈敏度高、可直觀判斷結(jié)果、結(jié)果易于長期保存、無需特殊儀器設(shè)備和試劑等優(yōu)點，免疫膠體金技術(shù)特別適用于野外工作、大面積普查或大批量時間緊的檢測。由于免疫膠體金技術(shù)起步較晚，市面上用于臨床診斷的膠體金相關(guān)試劑盒還不多，但該技術(shù)擁有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景是毋庸置疑的[13]。只是由于膠體金技術(shù)是通過檢測疾病后期體液免疫產(chǎn)生的抗體來得出結(jié)果的，故對早期感染病例檢出率不高。

2.3 分子生物學方法

該類型主要包括核酸探針、PCR和DNA圖譜等方法。這些方法具有敏感度高、特異性強等優(yōu)點，成為目前應(yīng)用于結(jié)核病檢測的新方法。但由于分子生物學檢測需要特殊、昂貴的儀器設(shè)備，操作技術(shù)相對于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和ELISA試驗較為復(fù)雜，對實驗室條件和操作人員的要求較高，因此只適用于實驗室研究，還不能夠用于基層的推廣應(yīng)用。張曼等[14]選取了牛結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的插入序列IS6110基因序列設(shè)計引物，建立了牛結(jié)核病的PCR檢測方法。IS6110基因是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一個轉(zhuǎn)座基因，在分枝桿菌屬其他菌種中不存在，因此利用該序列作為擴增靶序列，可以將結(jié)核分枝桿菌與其他細菌區(qū)分開來。

3 展望

牛結(jié)核病是一種慢性消耗性人畜共患病，目前其在全世界廣泛分布，在人和家畜間傳染性較強，嚴重危害人類健康和奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，場內(nèi)要做好嚴格的消毒、隔離工作、采取嚴格的免疫、驅(qū)蟲等措施，每年積極配合春、秋兩季的結(jié)核病篩查，發(fā)現(xiàn)陽性病例，要立即上報，執(zhí)行撲殺無害化處理，并對可疑牛及檢測陰性牛做好隔離、監(jiān)督工作，同時配合藥物預(yù)防。在研究環(huán)節(jié)，研究者應(yīng)積極開發(fā)靈敏度高、特異性強的核酸探針、PCR等新型檢測方法是未來重要的研究方向。期待有更加高效、準確、快速并且方便使用的檢測方法，為人與牛結(jié)核病的防控以及進一步的凈化提供幫助。