分子生物學(xué)方法在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

高 樂

（中科輻環(huán)境檢測（北京）有限公司，北京 100020）

根據(jù)微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，環(huán)境學(xué)家和生態(tài)學(xué)家研究了解微生物在生態(tài)系統(tǒng)聚集中的動態(tài)變化。研究方法的進(jìn)步加速了研究人員對微生物的了解。近十幾年來，微生物研究方法不斷發(fā)展，特別是高通量測量技術(shù)、基因組學(xué)和單細(xì)胞水平的二次離子交換法等。納米材料的光譜學(xué)結(jié)合熒光，隨著研究方法的發(fā)展，微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的作用可以更加有效。

1 環(huán)境微生物多樣性分析

在許多微生物生態(tài)學(xué)研究中，首先是對所研究環(huán)境中的微生物進(jìn)行分析，傳統(tǒng)的微生物研究方法是采集環(huán)境樣品，然后進(jìn)行繁殖。然而，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法很難得到，因此對微生物多樣性的分析受到限制。獲得目標(biāo)基因的PCR 產(chǎn)物后，可根據(jù)需要選擇以下方法進(jìn)行微生物多樣性分析。

1.1 梯度凝膠電泳（PGGE）和末端限制性片段長度（T-RFLP）多態(tài)性

DGGE 和T-RFLP 是環(huán)境中微生物多樣性分析的早期分子，梯度凝膠電泳主要用于分析500bp 片段，克隆庫和測序旨在獲得系統(tǒng)開發(fā)中感興趣的條帶或物種的信息，但對于復(fù)雜的微生物群落。例如，土壤的T-RFLP 分辨率高于梯度凝膠電泳。

1.2 微陣列基因

芯片用于分析樣品組成和微生物多樣性已有近20年的歷史，經(jīng)過一代又一代的改進(jìn)。一般來說，微電路和微陣列用于識別系統(tǒng)芯片、研究功能遺傳學(xué)和功能多樣性，微處理器用于將DNA 與已知的短序列樣本混合。確保系統(tǒng)的開發(fā)或功能，或通過系統(tǒng)開發(fā)或同時運行。用熒光標(biāo)記的PCR 產(chǎn)物或隨機引物將樣品序列（靶片段的DNA 或RNA）與探針雜交后，可根據(jù)熒光探針的序列匹配率計算微生物多樣性和信息豐富度。

基因微陣列法特別適用于鑒定不同時間、地點和過程中具有代表性的微生物或微生物群落之間的差異。除了功能微陣列，它還可以量化C，N，S 和P 循環(huán)的變化，有機污染物的降解，以及應(yīng)激反應(yīng)。本研究利用三代系統(tǒng)芯片（16sRNA基因芯片，可提供60000個不同OTUs 的信息）對土壤中不同的實驗性微生物和產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行了研究，以及研究了多樣性及其與土壤甲烷通量的關(guān)系。該方法不僅可以檢測出目標(biāo)社區(qū)在不同時間、不同地點、不同氮水平下的治療方法，而且可以檢測出社區(qū)中的少數(shù)民族。然而，克隆篩選方法的改變或高通量測序的深度不夠，這些微生物的差異可以忽略不計。分析了393個功能基因土壤微生物組成及功能基因多樣性。在熱帶雨林中發(fā)現(xiàn)了與碳、氮、磷循環(huán)有關(guān)的功能基因。包括相關(guān)微生物基因在內(nèi)的碳循環(huán)相關(guān)基因是簡單和困難的底物，典型對應(yīng)分析和多元回歸樹分析結(jié)果表明，不同地區(qū)土壤速效氮含量與土壤微生物功能基因組存在顯著差異，代謝勢與土壤有效氮含量之間存在顯著相關(guān)性[1]。

1.3 高通量測序

該測序已應(yīng)用數(shù)十年，測序質(zhì)量高，序列長度可達(dá)750～1000bp。這種方法不能測量混合序列，因此有必要構(gòu)建克隆庫。將目標(biāo)序列轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞（一般為大腸桿菌）培養(yǎng)基中形成單一菌株，然后對目標(biāo)序列進(jìn)行測序，在環(huán)境樣品中微生物多樣性高，耗時長，成本高。

在過去的十年里，測序方法有了很大的改進(jìn)。Sanger 測序法是基于同一核苷酸的四種不同顏色而無熒光的方法。當(dāng)DNA 聚合酶合成互補鏈時，每次核苷酸加成都會釋放出相應(yīng)的熒光，捕獲到的熒光信號通過專門的計算機軟件進(jìn)行處理，得到被測DNA 的序列信息。換句話說，合成測序也被稱為第二代測序。對目的基因的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。一個反應(yīng)產(chǎn)生數(shù)萬到數(shù)百萬個序列，大大增加了測序的廣度和深度。Miseq/hiseq 測序是兩種高通量測序方法，通過在每個樣本上標(biāo)記引物來識別不同的樣本序列。它可以同時分析多個環(huán)境樣本，獲得大量的序列。芯片樣品定量PCR 可同時擴增2304個PCR產(chǎn)物，并可在一個反應(yīng)中同時完成序列庫PCR。PCR 產(chǎn)物可直接用于第二代測序分析，結(jié)合第二代測序5h 后才能獲得微生物群落組成和豐度信息，簡化了第二代測序樣品的制備過程。目前，454焦磷酸測序仍在許多研究中使用[2]。

2 環(huán)境微生物的功能性質(zhì)和基因表達(dá)分析

除了了解生物多樣性和群落組成外，通常還需要分析這些微生物的功能特性，例如：它們的兼容性和功能性，以及它們與生態(tài)系統(tǒng)能量和營養(yǎng)流的相互作用。廣泛使用的微生物功能分析方法包括可持續(xù)同位素。將微生物DNA 或RNA與功能基質(zhì)、微生物基因組學(xué)和宏觀分析相結(jié)合的標(biāo)記，以及確定微生物對象類型和功能的單細(xì)胞研究方法。

2.1 同位素標(biāo)記與核酸相結(jié)合

穩(wěn)定同位素標(biāo)記結(jié)合DNA，或在水、土壤、沉積物和其他生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)微生物的類型和功能，一直是微生物生態(tài)學(xué)研究的主要目的。近二十年來，環(huán)境微生物在種類和功能方面取得了很大的成就，但這是一個薄弱環(huán)節(jié)。穩(wěn)定同位素和放射性同位素技術(shù)是微生物生態(tài)學(xué)的重要進(jìn)展。它將微生物物種與生物技術(shù)聯(lián)系起來。穩(wěn)定同位素剖面（SIP）使用穩(wěn)定的同位素基質(zhì)（如C、N 等）。微生物標(biāo)記物（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂脂肪）使用這些亞基類（PLFA）標(biāo)記物用于鑒定活躍環(huán)境中的微生物及其在群落水平上的相互作用[3]。

以“同位素標(biāo)記空氣中的二氧化碳”為水稻根際標(biāo)記，分析了根際土壤根系分泌物的代謝活性，發(fā)現(xiàn)根際土壤中的水稻集群，說明該古生菌在植物分泌物或殘渣產(chǎn)甲烷過程中起著重要作用。用C-甲苯標(biāo)記物分析海洋沉積物表明，重DNA模塊比輕RNA 成分更重要。理論上，485bp 的c-DNA 酶片段占優(yōu)勢，屬于脫硫單胞菌。除Ⅱ型芐基還原酶外，還有Ⅱ型苯并可追溯酶，已鑒定出各種厭氧電子受體的遺傳密碼和相關(guān)的最終氧化酶基因，表明該菌株具有代謝潛力。

2.2 基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄

從已知生物體中提取的微生物基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組DNA 或RNA 不需要在目標(biāo)片段中添加PCR 擴散和序列，以獲得數(shù)百個隨機中斷片段的完整遺傳信息，也稱為鳥槍測序。與基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，基因組學(xué)宏觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)反映了整個群落的特點?；蚪M學(xué)不僅提供各種微生物群落的分類學(xué)數(shù)據(jù)，而且提供所有微生物的遺傳信息，基因組學(xué)有兩個目的：一是分析微生物群落的潛在功能，確定隨機序列的短序列和基因功能的定量。其次，這些基因的功能部分可以與其他基因結(jié)合，作為分類的參考材料。一般基因持有者測量的基因與已發(fā)表或注釋的基因進(jìn)行比較，并直接與信息進(jìn)行比較，現(xiàn)有參考數(shù)據(jù)庫中包含的信息。實時反映微生物群落中的基因表達(dá)，包括樣本中哪些生物目前處于活躍狀態(tài)，RNA 在微生物細(xì)胞和土壤樣本中保存的DNA 少得多。因此，從環(huán)境樣本中提取RNA 理論上是生物基因表達(dá)的一種圖像。在目前的模型中，人們往往通過深入的宏觀經(jīng)濟研究來了解復(fù)雜微生物的動態(tài)。

2.3 細(xì)胞水平研究

與DNA 或RNA 結(jié)合，以識別微生物物種和成分。群落水平中微生物種類和組分的功能是相關(guān)的，但單細(xì)胞微生物的代謝活性水平與不同微生物細(xì)胞的代謝活性水平不同，改進(jìn)的單細(xì)胞成像方法、穩(wěn)定同位素和放射性同位素標(biāo)記以及熒光原位雜交，這是一種指示微生物數(shù)量、類型和功能的方法，以及一些微生物視覺交互圖。

同位素質(zhì)譜儀可以檢測任何穩(wěn)定的半衰期同位素。常用的生物分析方法是分析樣品中的C、N、P、S、H 和鹵素元素，并用來描繪復(fù)雜微生物群落中微生物細(xì)胞的代謝活動。此外，在計算細(xì)胞吸收系數(shù)時，分析了環(huán)境中元素的代謝[4]。

拉曼光譜和納米二次離子質(zhì)譜具有微米級甚至納米級的分辨率，可以用來測定純作物細(xì)胞或生態(tài)微生物的代謝活性，從而確定系統(tǒng)發(fā)育的信息。該方法主要適用于水、微生物純培養(yǎng)或濃縮培養(yǎng)等相對簡單的環(huán)境。土壤微生物研究這些方法的應(yīng)用提高了對微生物種類與環(huán)境關(guān)系的認(rèn)識。作為單細(xì)胞非破壞性物種，拉曼魚在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用很少。結(jié)果表明，該根瘤為假單胞菌，對地表水有明顯的吸收和同化作用，單核細(xì)胞中含有C，這表明，該方法在同時檢測微生物種類和功能的同時，具有鑒定微生物細(xì)胞代謝異質(zhì)性的潛力。與拉曼魚相比，納米魚在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用更為廣泛，在研究微生物的碳、氮和硫循環(huán)方面已被證明是有用的。研究了富營養(yǎng)化湖泊中的三種厭氧光合細(xì)菌以及富營養(yǎng)化湖泊中的氯網(wǎng)格細(xì)菌和染色細(xì)菌。結(jié)果表明，氮和碳分別占70%和40%。根據(jù)N2標(biāo)記實驗和納米芯片分析的經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)這些顆粒與厭氧甲烷相吻合，可用于生物固氮，固定化的氮可以輸送到非固氮、硫還原菌。這項研究不僅揭示了全球碳、氮、硫循環(huán)之間的相互作用，而且也顯示了將同位素標(biāo)記技術(shù)與納米材料相結(jié)合，產(chǎn)生微生物生理成分和視覺過程的可能性。

3 結(jié)論與展望

微生物調(diào)控的生物地球化學(xué)過程影響生態(tài)系統(tǒng)功能微生物與生態(tài)因子的相互作用是必不可少的。分子生物學(xué)方法的發(fā)展和進(jìn)步促進(jìn)了環(huán)境微生物的研究，但不同的方法有其固有的局限性。方法的選擇和應(yīng)用應(yīng)根據(jù)具體的研究情況而定。宏觀組學(xué)，如高通量測序和單細(xì)胞水平，以及傳統(tǒng)的方法如DGGE 和T-RFLP 研究，都在迅速發(fā)展。近年來，分析的廣度、深度和分辨率都有了很大的提高，顯示出前所未有的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。然而，這些方法也存在一些問題：①高通量測序通常產(chǎn)生數(shù)百個堿基或更短的序列，因此很難形成完整的基因；即使得到所有這些堿基，由于許多基因的功能尚不清楚，很難精確地從序列到功能進(jìn)行映射。②細(xì)胞水平的研究方法，對同位素標(biāo)記物的拉曼檢測，其光譜偏差應(yīng)達(dá)到10atom%；脫水和其他措施也可能影響樣品制備和固化過程中微生物細(xì)胞的同位素組成。另外，由于選擇和PCR 本身存在的問題，可能會對微生物產(chǎn)生誤解。例如，生物信息學(xué)分析產(chǎn)生的錯誤序列（嵌合體）被移除，此外，獲得的信息可以很容易地被PCRs 放大，增加的種群大多是優(yōu)勢種群。