T細(xì)胞受體庫在常見腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展①

王娟娟 張 鍇 劉 莉 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心,武漢 430023)

作為適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞效應(yīng)器，T細(xì)胞通過其表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)以識別和消滅腫瘤細(xì)胞。TCR由胚系基因于胸腺中進(jìn)行V(D)J基因重排而形成，胸腺細(xì)胞經(jīng)由復(fù)雜的陽性選擇和陰性選擇有序分化，發(fā)育成熟組成具有多樣性的T細(xì)胞庫，一個(gè)單獨(dú)T細(xì)胞中TCR的總數(shù)被稱為一個(gè)TCR repertoire或TCR profile。TCR庫會隨著疾病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生變化。每個(gè)TCR鏈都包含3個(gè)高變區(qū)，被命名為complementarity-determining region(CDR1-3)，CDR3因其高度多樣性被作為決定T細(xì)胞克隆類型的區(qū)域。近年來測序技術(shù)的發(fā)展使我們可以更快更準(zhǔn)確的評估TCR CDR3的多樣性，并評估TCR庫的克隆組成，包括TCR庫的大小、庫之間的相似性、V(D)J段使用、核苷酸插入和缺失、CDR3長度等[1]。研究表明，TCR庫在淋巴瘤微小殘留病灶的檢測、移植免疫治療后監(jiān)測、自身免疫疾病的診斷等方面均有價(jià)值[2-4]。TCR多樣性是適應(yīng)性免疫應(yīng)答特異性的基礎(chǔ)，對于腫瘤免疫應(yīng)答分子機(jī)制研究意義重大。有研究報(bào)道了免疫治療前后TCR庫變化與免疫應(yīng)答之間的相關(guān)性，提示TCR庫作為腫瘤免疫治療潛在生物標(biāo)志物的可能性[5]。本文將圍繞TCR庫與常見腫瘤免疫治療之間的關(guān)系展開綜述。

1 TCR概述

TCR是由不精確的體細(xì)胞基因重組產(chǎn)生的極其多樣化的基因編碼的異二聚體蛋白質(zhì)，根據(jù)TCR基因，T細(xì)胞可分為α/βT細(xì)胞和γ/δT細(xì)胞。對于人類而言，大多數(shù)T細(xì)胞是α/βTCR，而γ/δT細(xì)胞占總T細(xì)胞的0.5%～16%(平均約4%)[6]。TCR的多樣性使得受體能夠識別各類抗原，從而激發(fā)出一種有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[7]。

1.1TCR的檢測技術(shù) TCR的檢測方法包括常規(guī)PCR、克隆以及測序。近年來，測序技術(shù)的發(fā)展讓我們能夠更加迅速且準(zhǔn)確地獲取與TCR有關(guān)的海量數(shù)據(jù)。作為人類打開測序的開端，2001年人類基因組測序使用的Sanger技術(shù)是經(jīng)典的一代測序[8]。通過對編碼TCR上可變區(qū)的DNA片段進(jìn)行測序，從而了解TCR的多樣性。但測序成本高、通量低等方面的缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用與推廣。高通量測序又稱第二代測序或下一代測序[9]，是一種大規(guī)模并行測序技術(shù)，能一次并行對幾十萬到幾百萬甚至幾千萬DNA分子進(jìn)行序列測定，降低成本的同時(shí)提高測序速度，并保持了高準(zhǔn)確性。第三代測序方法即單分子測序，可直接檢測單個(gè)堿基信號，最大的特點(diǎn)是無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因其成本較高，尚未廣泛應(yīng)用。

1.2TCR的多樣性 為了應(yīng)對多種病原體，T細(xì)胞必須能夠識別許多不同的非自身肽，因此，T細(xì)胞應(yīng)表達(dá)廣泛多樣的獨(dú)特TCR。TCR的多樣性來源于專門的遺傳多樣化機(jī)制[10]。一方面，在人類中，TCR的基因區(qū)段包括TCRβ鏈的40～48個(gè)功能性TRBV、2個(gè)TRBD、12～13個(gè)TRBJ和2個(gè)TRBC基因以及TCRα鏈的44～46個(gè)TRAV、50個(gè)TRAJ和1個(gè)TRAC基因，多樣性通過在TCR基因重排期間組合不同的基因區(qū)段來介導(dǎo)。另一方面，重組過程中在V、J和D片段之間的連接點(diǎn)添加P(alindromic)和N(on-template)-核苷酸和/或N-核苷酸缺失可導(dǎo)致連接區(qū)突變，多樣性也由此突變產(chǎn)生。多基因片段、組合多樣性、連接多樣性形成了TCR的多樣性，從理論上講，重組機(jī)制產(chǎn)生的潛在多樣性估計(jì)高達(dá)1015[11]。

1.3TCR庫的異質(zhì)性 腫瘤異質(zhì)性是腫瘤治療的主要障礙之一，與腫瘤耐藥性的發(fā)生和腫瘤復(fù)發(fā)均相關(guān)。腫瘤異質(zhì)性不僅存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，還可能存在于TCR庫中。TCR庫的差異一方面存在于腫瘤與正常組織或其他腫瘤之間，另一方面存在于同一腫瘤內(nèi)的不同區(qū)域之間。差異表現(xiàn)在TCR庫的克隆組成、克隆型、CDR3多樣性以及CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增等方面。以結(jié)腸癌為例，研究表明結(jié)腸腫瘤組織與相鄰的健康黏膜組織之間的TCR序列具有顯著差異[12]。一項(xiàng)關(guān)于卵巢癌的研究表明腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)TCR庫的克隆組成在每個(gè)卵巢腫瘤中表現(xiàn)出均一性[13]。而在腎細(xì)胞癌中，在腫瘤的不同區(qū)域TIL TCR庫的克隆組成是有差異的[14]。這些相反的結(jié)果提示源自不同腫瘤的TCR庫的克隆組成表現(xiàn)不同。關(guān)于胰腺癌的研究，通過分析TCR CDR3基因序列發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者與健康對照組之間的TCR無顯著差異[15]，各組之間CDR3的類型和長度相似，這種與正常組織之間差異不顯著的表現(xiàn)與乳腺癌、肺癌等腫瘤不同。此外，Reuben等[16]的研究對來自11個(gè)局灶性肺腺癌的45個(gè)腫瘤區(qū)域中的TCR進(jìn)行了測序，觀察到腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的密度和克隆性存在實(shí)質(zhì)性差異，大多數(shù)T細(xì)胞克隆均局限于單個(gè)腫瘤區(qū)域。TCR庫中的空間差異可能是由不同腫瘤區(qū)域中不同的新抗原驅(qū)動(dòng)。

2 TCR庫與常見腫瘤免疫治療

T細(xì)胞受體介導(dǎo)T細(xì)胞識別不同的腫瘤抗原肽從而啟動(dòng)抗腫瘤免疫的過程，是腫瘤免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。腫瘤免疫治療包括單克隆抗體類免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICB)、治療性抗體、癌癥疫苗、細(xì)胞治療和小分子抑制劑等。隨著免疫療法的巨大成功，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICB)療法獲得了極大關(guān)注。ICB最初被批準(zhǔn)用于惡性黑色素瘤、肺癌，隨著近些年來免疫治療適應(yīng)癥的擴(kuò)大，針對乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤的免疫治療研究浮出水面。接下來將重點(diǎn)闡述不同惡性腫瘤的免疫治療與TCR庫之間的相關(guān)聯(lián)系。

2.1惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM) 關(guān)于TCR庫與腫瘤之間的故事最初從黑色素瘤開始，早在1996年就有研究者分析了基于IFN-α/IL-2的免疫療法對TCR模式的影響[18]。隨后，Robert等[19]關(guān)于黑色素瘤患者的免疫治療研究發(fā)現(xiàn)抗CTLA-4的免疫治療會導(dǎo)致TCR庫的擴(kuò)大，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種擴(kuò)大與毒性增加有關(guān)。但Robert并未發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者和非應(yīng)答者在抗CTLA-4治療的基線TCR多樣性存在任何差異。隨后有研究報(bào)道，TCR的多樣性與抗CTLA-4免疫治療后的臨床獲益具有相關(guān)性，這兩項(xiàng)研究結(jié)果的差異可能是由于使用了不同的CTLA-4檢查點(diǎn)阻斷劑，即tremelimumab和ipilimumab[20,21]。

已有研究向我們證實(shí)了PD-1和CTLA-4抑制對黑素瘤患者外周TCR庫的不同影響，二者雖然都能重塑TCR庫，但是起作用的方式不同[22,23]。由于PD-1的作用機(jī)制，PD-1治療的TCR庫研究主要集中在腫瘤庫，而不是外周庫。Tumeh等[24]通過比較抗PD-1治療(pembrolizumab)基線和給藥后腫瘤活組織檢查的TCR克隆性，發(fā)現(xiàn)臨床應(yīng)答者的樣本在抗PD-1治療后具有超過10倍的克隆擴(kuò)增。然而Kuehm等[25]的最新研究表示免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法會增強(qiáng)小鼠腫瘤浸潤性T細(xì)胞的頻率和效應(yīng)功能，但并不改變TCR多樣性。與之前的研究有所矛盾，因此進(jìn)一步的研究值得我們?nèi)ヌ接?。已有研究通過TCR測序?qū)谏亓龌颊哌M(jìn)行分層，將其應(yīng)用到臨床患者中，從而篩選出可能從免疫治療中獲益的患者[26]。免疫治療與TCR的關(guān)系在黑色素瘤中的研究為進(jìn)一步探索其他瘤種奠定了基礎(chǔ)。

2.2非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 最近的一項(xiàng)研究，證明了肺癌患者中存在獨(dú)特的T細(xì)胞免疫微環(huán)境。該研究分析了15例肺癌患者的肺癌組織和匹配的遠(yuǎn)處非腫瘤肺組織(正常肺組織)中的TCR庫[27]，發(fā)現(xiàn)雖然T細(xì)胞克隆的總體分布在癌組織和正常肺組織之間是相似的，但是在克隆比例、TCR多樣性等方面有顯著差異，且腫瘤中較高的TCR多樣性與較差的臨床獲益顯著相關(guān)。

NSCLC的特征在于突變的逐步出現(xiàn)，其中某些突變促進(jìn)了新抗原的產(chǎn)生，使TCR庫發(fā)生改變。同樣的，TCR庫也在一定程度上反映腫瘤的突變情況。Miyauchi等[28]研究了EGFR基因與TCR庫之間的關(guān)系，該研究收集了39對配對的(正常和腫瘤)肺腺癌組織樣本(其中20個(gè)具有EGFR突變)進(jìn)行TCR測序分析，結(jié)果表明EGFR野生型腫瘤的TCR克隆擴(kuò)增要比EGFR突變型腫瘤的克隆擴(kuò)增更大。最近Joshi等[29]通過研究了TCR庫異質(zhì)性與基因組異質(zhì)性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TCR庫的空間異質(zhì)性反映了肺癌的突變情況。在腫瘤中選擇性擴(kuò)增的TCR序列的數(shù)目在腫瘤內(nèi)部和瘤體之間變化，與非同義突變的數(shù)目相關(guān)。此外，TCR庫被認(rèn)為是免疫治療的潛在預(yù)測生物標(biāo)記物，近期研究表明外周血PD-1+CD8+T細(xì)胞中TCR多樣性和克隆性可以作為患者對免疫治療療效和NSCLC患者生存結(jié)果的非侵入性預(yù)測指標(biāo)[30]。

聯(lián)合治療對TCR庫的影響與治療方式有關(guān)。Wilkins等[31]在NSCLC中發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合抗CTLA-4治療可能重塑了TCR庫，并且針對新的腫瘤抗原出現(xiàn)了新的克隆型。除了放療，靶向治療聯(lián)合免疫治療的研究也有報(bào)道[32]，該研究發(fā)現(xiàn)FGFR抑制劑(erdafitinib)可導(dǎo)致克隆性下降，一方面可能是T細(xì)胞群體具有更均衡的克隆頻率分布，因而克隆數(shù)量更少；另一方面可能是由抗原呈遞細(xì)胞(APC)暴露于腫瘤抗原庫而引發(fā)的免疫反應(yīng)，是治療直接誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)果。與單獨(dú)使用erdafitinib的治療相比，聯(lián)合治療使T細(xì)胞克隆分?jǐn)?shù)和克隆性均顯著增加，這可能與抗PD-1治療推動(dòng)了腫瘤特異性T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增有關(guān)。因此聯(lián)合治療可促進(jìn)T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增以及腫瘤微環(huán)境中的免疫學(xué)變化，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫力和增加存活率。

2.3乳腺癌(breast cancer，BC) 在乳腺癌TCR相關(guān)研究中，癌組織與癌周組織及腋淋巴結(jié)中T細(xì)胞的TCR差異在很大程度上尚未被發(fā)現(xiàn)。Wang等[33]使用多重PCR和高通量測序分析了乳腺癌患者的腫瘤、鄰近非腫瘤組織和腋窩淋巴結(jié)中T細(xì)胞的TCR組成，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中的TCR庫多樣性低于淋巴結(jié)，但高于非腫瘤組織，并且可變基因和連接基因的使用頻率較高。該研究還發(fā)現(xiàn)陽性淋巴結(jié)增強(qiáng)了T細(xì)胞向腫瘤的浸潤和淋巴結(jié)中T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增，乳腺癌的分子表型也可以改變組織間T細(xì)胞庫相似性。關(guān)于乳腺癌免疫治療與TCR關(guān)系的研究也越來越多。最近一項(xiàng)關(guān)于雙重檢查點(diǎn)抑制劑的互補(bǔ)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)免疫治療可以擴(kuò)展獨(dú)特的TCR庫[34]，分析顯示TCR庫在抗CTLA-4治療后顯著變化，但未因添加抗PD-1治療而改變。具體原因有待我們繼續(xù)探討。在臨床上，免疫治療不僅可以單獨(dú)發(fā)揮作用，也可以聯(lián)合其他治療，例如放療、靶向治療或其他免疫療法，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。Rudqvist等[35]發(fā)現(xiàn)乳腺癌的聯(lián)合治療后，不僅CD8/CD4的比率顯著增加，CD8+T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增也較為顯著，而且出現(xiàn)了新的克隆型，CDR3的長度也明顯增加。

2.4其他腫瘤 Sheikh等[36]使用TCRVβCDR3序列的NGS來鑒定接受sipuleucel-T治療的早期前列腺癌患者腫瘤組織及外周血中T細(xì)胞亞群的變化，確定了用sipuleucel-T治療的患者中外周血與腫瘤組織TCR特征有更高的關(guān)聯(lián)性。這些發(fā)現(xiàn)表明sipuleucel-T可能通過增加抗原特異性免疫庫來調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫反應(yīng)，從而減少外周循環(huán)中T細(xì)胞的多樣性。相關(guān)的研究也在結(jié)直腸癌、膀胱癌、宮頸癌等不同腫瘤中開展[37-39]。這些研究或多或少都證明了TCR庫與腫瘤治療之間密切的聯(lián)系，為后續(xù)研究TCR作為生物標(biāo)志物的可行性提供了支持。

3 結(jié)語

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，TCR的相關(guān)分析不僅變得更容易，而且更準(zhǔn)確[40]。免疫治療在不同的環(huán)境下以不同的方式重塑了TCR庫，同樣地，TCR庫也在一定程度上反映了體內(nèi)免疫應(yīng)答狀態(tài)，可作為腫瘤免疫治療的潛在生物標(biāo)志物。但其在更廣泛的研究和臨床應(yīng)用中仍面臨挑戰(zhàn)，首先是獲益人群及治療領(lǐng)域的局限性，如何使更多的患者在免疫治療中獲益，如何應(yīng)對免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如何擴(kuò)大免疫治療適應(yīng)癥等這些問題仍需繼續(xù)探究。其次，雖然TCR庫的測序分析能夠監(jiān)測腫瘤內(nèi)和外周血T細(xì)胞的存在以及數(shù)量和克隆擴(kuò)增情況。然而，僅通過這一信息尚不足以完全反映適應(yīng)性免疫應(yīng)答，仍需要更大規(guī)模的研究來確認(rèn)TCR庫作為預(yù)測標(biāo)志物的可行性及穩(wěn)定性。