混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕工藝優(yōu)化

吳正可，劉國(guó)華，李陽(yáng)，鄭愛娟，常文環(huán)，陳志敏，蔡輝益

混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕工藝優(yōu)化

吳正可，劉國(guó)華，李陽(yáng)，鄭愛娟，常文環(huán)，陳志敏，蔡輝益

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/生物飼料開發(fā)國(guó)家工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【目的】通過(guò)優(yōu)化菜籽粕混菌固態(tài)發(fā)酵工藝以提高菜籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為發(fā)酵菜籽粕在我國(guó)畜牧養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論參考?！痉椒ā恳云胀ú俗哑蔀樵?，采用嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母3種菌株，以硫甙降解率（X%)、總酸增加率(Y%)、多肽增加率(Z%)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并采用加權(quán)法以M為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)（其中M = 0.7×X + 0.15×Y + 0.15×Z）評(píng)價(jià)發(fā)酵效果。其中，試驗(yàn)一以3株菌的不同添加量為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（34）三因素三水平正交試驗(yàn)，探究各菌株添加量及不同的菌株組合方式對(duì)發(fā)酵效果的影響；在試驗(yàn)一的基礎(chǔ)上配置混菌發(fā)酵液，以發(fā)酵溫度、料水比、發(fā)酵時(shí)間、接種量為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L16（45）四因素四水平正交試驗(yàn)，探究混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的最佳工藝，并結(jié)合最佳工藝進(jìn)行中試驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】(1) 試驗(yàn)一對(duì)以總變化率M為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果顯示混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕最佳混菌組合為嗜酸乳桿菌:釀酒酵母:枯草芽孢桿菌為=1﹕3﹕2，在該條件下，硫甙降解率為23.5%，總酸增加率為179.2%，多肽增加率為375.0%。(2) 在試驗(yàn)一的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)試驗(yàn)二并對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的最佳工藝條件為溫度：33℃、料水比：1﹕1、時(shí)間：84h、接種量：6%，在該工藝條件下進(jìn)行中試驗(yàn)證測(cè)得硫甙降解率為48.8%，總酸增加率為499.7%，多肽增加率為148.4%，總變化率為131.4%，符合試驗(yàn)預(yù)期；對(duì)各單因素的方差分析結(jié)果顯示1水平溫度（31℃）總變化率顯著低于其他水平（< 0.05)，2水平溫度（33℃）總變化率高于3水平（35℃）和4水平（37℃），但差異不顯著（> 0.05)；2水平（1﹕1）的料水比總變化率高于其他水平，差異未達(dá)到顯著水平（>0.05)；3水平（84 h）的發(fā)酵時(shí)間總變化率高于其他水平，但差異未達(dá)到顯著水平（>0.05)；接種量各水平之間對(duì)總變化率的影響差異不顯著（> 0.05)。(3)在該最佳工藝條件下，微生物固態(tài)發(fā)酵增加了菜籽粕粗蛋白含量（從37.05％到40.90％)并降低了粗纖維濃度（從17.47%到16.72%）；發(fā)酵菜籽粕氨基酸組成分析表明發(fā)酵增加了菜籽粕中各種氨基酸的含量，尤其是Asp，Thr，Ser，Glu，Pro，Ala和Lys；發(fā)酵后菜籽粕硫甙含量從36.08 μmol·g-1降至18.48 μmol·g-1；發(fā)酵增加了菜籽粕中多肽含量（從0.84%到2.09%）和總酸含量（從1.01%到6.05%）；菜籽粕發(fā)酵前后粗脂肪含量相似（4.31%和4.39%）。【結(jié)論】通過(guò)本發(fā)酵工藝對(duì)菜籽粕進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵可有效降解菜籽粕中的硫甙，并提高菜籽粕中多肽和總酸的含量，菜籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到有效改善。

菜籽粕；混菌；固態(tài)發(fā)酵；正交設(shè)計(jì)

0 引言

【研究意義】蛋白質(zhì)是動(dòng)物飼糧中的重要組成部分，一般由豆粕提供。近年來(lái)，隨著中國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展及養(yǎng)殖體量的進(jìn)一步擴(kuò)大，常規(guī)飼料原料尤其是蛋白原料供應(yīng)緊缺，限制著中國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)豆粕使用量為7 230萬(wàn)t，其中95%來(lái)自于美國(guó)、巴西等國(guó)家的進(jìn)口。在當(dāng)前蛋白飼料原料競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈的國(guó)際背景下，中國(guó)傳統(tǒng)玉米-豆粕型動(dòng)物飼糧結(jié)構(gòu)將會(huì)發(fā)生變化，新型蛋白飼料資源的開發(fā)迫在眉睫，引入菜籽粕等雜粕的多元化飼糧配方將會(huì)成為中國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的新常態(tài)[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】菜籽粕是油菜籽在榨油過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其粗蛋白質(zhì)含量在35%—45%，但由于菜籽粕中含有硫甙、單寧、植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，且粗纖維含量較高（11%—14%），限制了其在動(dòng)物飼糧中的飼用價(jià)值[2-3]。硫甙是菜籽粕中毒性最強(qiáng)的抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠直接影響動(dòng)物甲狀腺發(fā)育，降低動(dòng)物生產(chǎn)性能，影響動(dòng)物免疫力[4]。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)微生物固態(tài)發(fā)酵能有效的降低菜籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，在替代豆粕方面具有較高的開發(fā)價(jià)值[5]。ROZAN等使用少孢根霉菌固態(tài)發(fā)酵處理菜籽粕40h后可降解菜籽粕中47%的硫甙[6]；DRAZBO 等的研究表明用6-植酸酶固態(tài)發(fā)酵菜籽粕可顯著降低菜籽粕中硫甙含量并可在一定程度上提高火雞生長(zhǎng)性能[7]。【本研究切入點(diǎn)】目前關(guān)于發(fā)酵菜籽粕的研究雖有大量報(bào)道，但對(duì)發(fā)酵效果的研究主要集中在硫甙的降解，發(fā)酵條件不一，發(fā)酵效果差異較大，菜籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的開發(fā)還有較大的空間。基于本課題組在微生物發(fā)酵飼料的大量前期工作上，本試驗(yàn)擬通過(guò)兩個(gè)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)探究不同菌株添加量及各發(fā)酵參數(shù)對(duì)發(fā)酵效果的影響，兼顧發(fā)酵菜籽粕硫甙的降解及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的改善，深度挖掘發(fā)酵菜籽粕的飼用價(jià)值。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確各因素對(duì)發(fā)酵菜籽粕效果的影響，得出混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕最佳發(fā)酵工藝，為微生物發(fā)酵菜籽粕的過(guò)程控制及規(guī)模應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2016年10月至2017年6月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所農(nóng)業(yè)部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

菌種：嗜酸乳桿菌由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏，枯草芽孢桿菌與釀酒酵母由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。菜籽粕為普通菜籽粕，購(gòu)自北京金盛祥科技發(fā)展有限公司，其營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白37.05%，粗纖維17.47%，粗脂肪4.31%，多肽0.84%，總酸1.01%，硫甙36.08 μmol·g-1。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種發(fā)酵培養(yǎng)液的制備 將菌株平板劃線培養(yǎng)，于各菌株平板上挑取單菌落于10mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，一定條件下（其中，嗜酸乳桿菌37℃恒溫靜置培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌37℃、200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)；釀酒酵母30℃、200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)）培養(yǎng)24h后，按1%的接種量接種于150mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)21h后制成各單菌發(fā)酵培養(yǎng)液。

1.3.2 發(fā)酵步驟 取50g菜籽粕裝入250mL的錐形瓶中，將菌種和無(wú)菌水以一定的比例接入到發(fā)酵底物中，攪拌均勻，在試驗(yàn)條件下恒溫靜置發(fā)酵，每隔12h翻料一次，發(fā)酵結(jié)束后45℃低溫烘干，粉碎過(guò)40目篩待測(cè)。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵后菜籽粕中硫甙降解率（X%)、總酸增加率（Y%）、多肽增加率（Z%）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用加權(quán)法以M為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)（其中M=0.7*X+0.15*Y+ 0.15*Z）探究3種菌株的添加量及不同組合比例對(duì)發(fā)酵菜籽粕的影響[8]，各菌株設(shè)置3個(gè)水平并設(shè)計(jì)L9(34) 三因素三水平正交試驗(yàn)（表1）。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在確定混菌組合比例的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化菜籽粕發(fā)酵工藝條件，以M為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)（其中M=0.7×X+0.15×Y+0.15×Z），以發(fā)酵溫度、料水比、時(shí)間、接種量為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L16（45）四因素四水平正交試驗(yàn)（表2）。

表2 L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 最優(yōu)條件中試發(fā)酵發(fā)菜籽粕

參照前期優(yōu)化條件，按1.3所述方法，采用安裝有單向呼吸閥的發(fā)酵袋恒溫靜置中試發(fā)酵菜籽粕40kg，每隔12h翻料一次，發(fā)酵袋為普通發(fā)酵袋，購(gòu)自北京百旺通達(dá)科技有限公司。發(fā)酵結(jié)束后45℃低溫烘干，粉碎過(guò)40目篩，測(cè)定發(fā)酵后菜籽粕中硫甙、總酸、多肽、蛋白質(zhì)及氨基酸含量。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

參照文獻(xiàn)[9]，采用氯化鈀比色法測(cè)定菜籽粕發(fā)酵前后硫甙的含量；采用杜馬斯全自動(dòng)定氮儀測(cè)定樣品粗蛋白含量；參照GB/T 22492-2008 大豆肽粉的測(cè)定方法測(cè)定多肽含量[10]；參照文獻(xiàn)[11]采用滴定法測(cè)定發(fā)酵前后總酸含量（結(jié)果以乳酸計(jì)）；采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定發(fā)酵前后菜籽粕氨基酸含量變化。每個(gè)指標(biāo)測(cè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)軟件SPSS19.0中的一般線性模型分析，結(jié)合Duncan法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值表示，以＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同混菌比例對(duì)總變化率的影響

對(duì)以總變化率M為指標(biāo)的正交試驗(yàn)進(jìn)行極差分析（表3），結(jié)果顯示當(dāng)3株菌組合比例為嗜酸乳桿菌﹕釀酒酵母﹕枯草芽孢桿菌=1﹕3﹕2時(shí)，總變化率M最大?？莶菅挎邨U菌對(duì)總變化率的影響最大，釀酒酵母次之，嗜酸乳桿菌的影響最小。正交試驗(yàn)中包含該最佳組合，且總變化率為99.55%，明顯高于其他處理，由此將后期混菌組合設(shè)為嗜酸乳桿菌﹕釀酒酵母﹕枯草芽孢桿菌=1﹕3﹕2。

表3 混菌接種量L9（34）正交試驗(yàn)

2.2 混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕工藝優(yōu)化

混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕工藝優(yōu)化L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。通過(guò)極差分析可知，最佳發(fā)酵工藝條件為溫度：33℃、料水比：1﹕1、時(shí)間：84h、接種量：6%，在該工藝下，總變化率理論上最高。溫度對(duì)總變化率的影響最大，時(shí)間和料水比次之，接種量對(duì)總變化率的影響最小。

2.2.1 不同因素和水平對(duì)總變化率M的影響 由表5可知，1水平溫度（31℃）總變化率顯著低于其他水平（< 0.05），2水平溫度（33℃）總變化率要高于3水平（35℃）和4水平溫度（37℃），但無(wú)顯著差異（> 0.05）。2水平的料水比（1﹕1）總變化率高于其他水平（> 0.05）。3水平發(fā)酵時(shí)間（84h）總變化率高于其它水平，差異不顯著（> 0.05）。接種量各水平對(duì)總變化率的影響差異不顯著（> 0.05）。

2.2.2 不同因素和水平對(duì)硫甙降解率的影響 由表6可知，1水平溫度下（31℃）硫甙降解率顯著低于其他水平（< 0.05），2水平溫度下（31℃）硫甙降解率最高?？傋兓孰S料水比水平的提高而增加，但無(wú)顯著差異（> 0.05)。隨時(shí)間的延長(zhǎng)，硫甙降解率呈升高的趨勢(shì)，4水平時(shí)間（96h）的硫甙降解率高于其他水平，但差異不顯著（> 0.05)。接種量各水平對(duì)硫甙降解率無(wú)顯著影響（> 0.05)。

表4 混菌發(fā)酵多因素試驗(yàn)結(jié)果

表5 不同因素和水平對(duì)總變化率M的影響

同列數(shù)據(jù)標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（<0.05）。下同

Valves in the same row with different small letter mean significant difference (<0.05). the same as below

表6 不同因素和水平對(duì)硫甙降解率的影響

2.2.3 不同因素和水平對(duì)總酸和多肽增加率的影響 不同因素和水平對(duì)總酸和多肽增加率的影響方差分析見表7和表8。由表可知，溫度對(duì)總酸增加率的變化呈先升高后降低的趨勢(shì)，在2水平溫度（33℃）時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于1水平溫度（31℃）（<0.05)。料水比對(duì)總酸增加率的影響亦先升高后降低。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為3水平時(shí)（84h）總酸增加率達(dá)到最大。接種量和料水比對(duì)總酸增加率的影響差異不顯著（> 0.05)。1水平的料水比（1:0.8）多肽增加率最高，發(fā)酵時(shí)間和接種量對(duì)多肽增加率無(wú)顯著影響（> 0.05)。

表7 不同因素和水平對(duì)總酸增加率的影響

表8 不同因素和水平對(duì)多肽增加率的影響

2.3 中試驗(yàn)證試驗(yàn)

參照混菌發(fā)酵多因素結(jié)果，設(shè)定試驗(yàn)因素為溫度：33℃、料水比：1﹕1、時(shí)間：84h、接種量：6%，中試發(fā)酵40kg菜籽粕，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得硫甙降解率為48.79%，總酸增加率為499.65%，多肽增加率為148.37%，總變化率為131.36%，接近于試驗(yàn)組中最高的總變化率134.04%。

2.4 最佳發(fā)酵條件下菜籽粕氨基酸及其他營(yíng)養(yǎng)成分含量變化

中試發(fā)酵后氨基酸含量變化見表9。由表可知發(fā)酵菜籽粕粗蛋白較發(fā)酵前提高了5.26%，絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸均有較大程度的提高。

3 討論

3.1 各菌株添加量及不同組合比例對(duì)發(fā)酵菜籽粕效果的影響

本試驗(yàn)采用三因素三水平正交試驗(yàn)探究各菌株添加量及比例對(duì)發(fā)酵菜籽粕效果的影響。本試驗(yàn)所用的嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母均列入我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料添加劑品種目錄》[12]，符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于飼料微生物添加劑的相關(guān)規(guī)定。嗜酸乳桿菌對(duì)總變化率的影響顯著（< 0.05），且隨著嗜酸乳桿菌接種量的增高，總變化率呈降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)檫^(guò)多的乳酸菌在發(fā)酵前期產(chǎn)生大量的有機(jī)酸降低了基質(zhì)pH，在一定程度上抑制了枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的生長(zhǎng)[13-14]。嗜酸乳桿菌與枯草芽孢桿菌及釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中存在協(xié)同及共生作用[15]。發(fā)酵前期，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母利用發(fā)酵體系中的蛋白及碳水化合物的能力較強(qiáng)，能夠快速分解蛋白質(zhì)形成更易被動(dòng)物和微生物利用的多肽和氨基酸，促進(jìn)了嗜酸乳桿菌的增殖，同時(shí)進(jìn)一步降低發(fā)酵基質(zhì)pH，有效的抑制雜菌的污染[16]。隨著發(fā)酵體系內(nèi)氧氣的消耗及pH的降低，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，釀酒酵母也從有氧發(fā)酵進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵。孫林等的研究顯示嗜酸乳桿菌和蠟樣芽胞桿菌對(duì)發(fā)酵菜籽粕的交互作用達(dá)到顯著水平[17]。蔣玉琴等使用不同比例的乳酸菌、酵母菌、少孢根霉發(fā)酵菜籽粕效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵[18]。

表9 發(fā)酵菜籽粕氨基酸及其他營(yíng)養(yǎng)成分變化（風(fēng)干基礎(chǔ)）

3.2 不同因素及水平對(duì)發(fā)酵菜籽粕效果的影響

溫度是影響發(fā)酵效率的重要因素。每種微生物都有其最適生長(zhǎng)溫度，多菌株形成的微生物區(qū)系亦有其最適溫度范圍，超過(guò)或低于其最適溫度均不利于微生物的生長(zhǎng)[19]。其次，溫度能直接影響微生物源蛋白酶及纖維素酶活性，從而間接影響發(fā)酵效果。微生物發(fā)酵是一個(gè)代謝產(chǎn)熱的過(guò)程，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵飼料內(nèi)部產(chǎn)熱過(guò)快造成熱量聚集，不利于微生物的生長(zhǎng)[20]。高冬余等的研究表明，溫度對(duì)發(fā)酵菜籽粕效果的影響達(dá)到極顯著的水平，且在一定范圍內(nèi)發(fā)酵效果隨溫度的升高而降低[21]。發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵菜籽粕效果的另一個(gè)重要因素[22]。選擇合適的發(fā)酵時(shí)間，不但能有效的提高發(fā)酵效率，還能減少發(fā)酵過(guò)度而產(chǎn)生不必要的浪費(fèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的增加，總變化率呈先增高后降低的趨勢(shì)，這說(shuō)明微生物發(fā)酵菜籽粕并非是時(shí)間越久越好。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)大量的微生物會(huì)優(yōu)先利用被分解的小分子蛋白合成自身微生物菌體蛋白，發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)的多肽含量也是先增高后降低?？偹岷侩S時(shí)間變化不大，這主要是不同微生物相互作用維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的結(jié)果[3]。料水比是影響微生物活性的重要因素，水分過(guò)高會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)黏性增加并減少基質(zhì)內(nèi)氣體交換，但能促進(jìn)基質(zhì)內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分和菌體的流動(dòng)性[23]；而基質(zhì)水分過(guò)低會(huì)影響乳酸菌的活性，菌體生長(zhǎng)受到抑制，酶的產(chǎn)量減少[24]。本試驗(yàn)最佳料水比為1﹕1，這一研究結(jié)果與肖萌等的報(bào)道類似[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，接種量對(duì)總變化率及其他指標(biāo)的影響不顯著，這可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各接種量最終都會(huì)達(dá)到一個(gè)基質(zhì)容量?jī)?nèi)的最大微生物量[25]。

3.3 發(fā)酵對(duì)菜籽粕氨基酸含量的影響

動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率是評(píng)價(jià)蛋白原料質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。原料中蛋白分子量越小，多肽含量越高，氨基酸組成越平衡，越容易被動(dòng)物消化吸收[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵處理不僅提高了菜籽粕中多肽的含量，粗蛋白及各氨基酸含量也均有不同水平的提高，其主要原因是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物消耗碳水化合物產(chǎn)生的“濃縮效應(yīng)”，導(dǎo)致粗蛋白和氨基酸含量提高。同時(shí)大部分必需氨基酸含量提高的比例要高于粗蛋白提高的比例，其原因可能是微生物分泌的轉(zhuǎn)氨酶利用轉(zhuǎn)氨基作用將非必需氨基酸合成為動(dòng)物的必需氨基酸，同時(shí)微生物還能利用飼料中的各種非蛋白氮合成蛋白氮，提高各種氨基酸的比例。精氨酸是動(dòng)物體內(nèi)生物學(xué)功能最多的一種氨基酸，在體內(nèi)物質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用，同時(shí)精氨酸含量升高還有促進(jìn)動(dòng)物對(duì)其他氨基酸吸收利用的作用[27]。酪氨酸可在體內(nèi)酪氨酸羧化酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?、腎上腺素、去甲腎上腺素等物質(zhì)，對(duì)體內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)有重要的作用[28]。賴氨酸是畜禽日糧中的第一限制性氨基酸，賴氨酸含量的提高有助于促進(jìn)日糧氨基酸平衡并提高蛋白利用效率[29]。低蛋白日糧和氨基酸平衡是近年來(lái)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，促進(jìn)原料氨基酸平衡可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)原料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，減少不必要的氮排放對(duì)環(huán)境污染帶來(lái)的影響[30]。本研究結(jié)果表明，發(fā)酵菜籽粕可以提高菜籽粕多肽和各種氨基酸的含量，有助于促進(jìn)原料氨基酸平衡，為低蛋白日糧和氨基酸平衡的研究提供一種新的理論和方法。

4 結(jié)論

混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度33℃，料水比1﹕1，發(fā)酵時(shí)間84h，接種量6%，其中混菌組合方式為嗜酸乳桿菌﹕枯草芽孢桿菌﹕釀酒酵母=1﹕3﹕2。在該工藝條件下，發(fā)酵菜籽粕硫甙降解率為48.79%，總酸增加率為499.65%，多肽增加率為148.37%，總變化率為131.36%。通過(guò)對(duì)菜籽粕發(fā)酵工藝優(yōu)化，降低了菜籽粕中硫甙的含量并改善菜籽粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高了菜籽粕中多肽和總酸的含量，具備一定的益生價(jià)值。該發(fā)酵工藝時(shí)間短，效率高，操作簡(jiǎn)單，易于推廣，發(fā)酵后可以直接添加在家禽和家畜飼料中，但發(fā)酵菜籽粕對(duì)家禽和家畜生產(chǎn)性能的影響及最適用量還需進(jìn)一步的研究。

[1] 蔡輝益, 張姝, 鄧雪娟, 劉國(guó)華,常文環(huán), 閆海潔. 生物飼料科技研究與應(yīng)用. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2014, 26(10): 2911-2923.

CAI H Y, ZHANG S, DENG X J, LIU G H, CHANG W H, YAN H J. Research and application of biological feed technology., 2014, 26(10): 2911-2923. (in Chinese)

[2] YANG X, CHEN H, GAO H L, LI Z H. Bioconversion of corn straw by coupling ensiling and solid-state fermentation., 2001, 78(3): 277-280.

[3] EL-BATAL A L, KAREM H A. Phytase production and phytic acid reduction in rapeseed meal byduring solid state fermentation., 2001, 34(8): 715-720.

[4] 楊玉娟，姚怡莎，秦玉昌，邱靜，李軍國(guó)，李俊，谷旭. 豆粕與發(fā)酵豆粕中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子調(diào)查分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(3): 573-580.

YANG Y J, YAO Y S, QIN Y C, QIU J, LI J G, LI J, GU X. Investigation and analysis of main AFN in soybean meal and fermented soybean meal., 2016, 49(3): 573-580. (in Chinese)

[5] ASHAYERIZADEH A, DASTAR B, SHAMS S M, SADEGHI M A, ZEREHDARAN S. Effects of feeding fermented rapeseed meal on growth performance, gastrointestinal microflora population, blood metabolites, meat quality, and lipid metabolism in broiler chickens., 2018, 216(18):183-190.

[6] ROZAN P, VILLAUME C, BAU H M, SCHWERTZ A, NICOLAS J P, MEJEAN L. Detoxication of rapeseed meal by: a first step towards rapeseed protein concentrate.1996, 31(1): 85-90.

[7] DRAZBO A, OGNIK K, ZAWORSKA A, FERENC K, JANKOWSKI J. The effect of raw and fermented rapeseed cake on the metabolic parameters, immune status, and intestinal morphology of turkeys., 2018, 97(11): 3910-3920.

[8] 朱少華, 曲露, 李小定, 劉平，王萌，劉碩. 菜籽粕固態(tài)分步發(fā)酵的工藝研究. 中國(guó)油脂, 2014, 39(7):37-41.

ZHU S H, QU L, LI X D, LIU P, WANG M, LIU S. Two-step solid fermentation process of rapeseed meal., 2014, 39(7):37-41. (in Chinese)

[9] 劉絢霞，楊莉. 分光光度法測(cè)定油菜籽中硫代葡萄糖甙. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002(6): 5-7.

LIU X X, YANG L. Determination of glucosinolate in rapeseed meal by spectrophotometry., 2002(6): 5-7. (in Chinese)

[10] GB/T 22492. (2008). 大豆肽粉. 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). 北京.

GB/T 22492. (2008). Soy peptides powder. Beijing: Standardization Administration of the People's Republic of China. (in Chinese)

[11] 安華明, 劉明, 楊曼, 樊衛(wèi)國(guó). 刺梨有機(jī)酸組分及抗壞血酸含量分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44(10): 2094-2100.

AN H M, LIU M, YANG M, FAN W G. Analysis of main organic acid compositions intratt., 2011, 44(10): 2094-2100. (in Chinese)

[12] 飼料添加劑品種目錄(2013). 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公報(bào), 2014, (1):1-4.

Variety Catalogue of Feed Additives (2013). Gazette of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China. 2014, (1):1-4. (in Chinese)

[13] 劉玉婷，吳明陽(yáng)，靳艷玲，沈維亮，方揚(yáng)，趙海. 鼠李糖乳桿菌利用甘薯廢渣發(fā)酵產(chǎn)乳酸的研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(9): 1767-1777.

LIU Y T, WU M Y, JIN Y L, SHEN W L, FANG Y, ZHAO H. Lactic acid fermentation byfrom sweet potato residue., 2016, 49(9): 1767-1777.

[14] COUTO S R, SANROMAN M A, Application of solid-state fermentation to food industry. A review., 2006, 76(3): 291-302.

[15] 王赫, 朱風(fēng)華, 陳甫, 徐進(jìn)棟, 邊學(xué)偉, 張瑞星, 朱連勤. 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵飼料中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、乳酸菌和乳酸含量的影響. 中國(guó)家禽, 2017, 39(10): 27-31.

WANG H, ZHU F H, CHEN F. XU J D, BIAN X W, ZHANG R X, ZHU L Q. Effects of different fermentation time on main nutrients, lactic acid bacteria and lactic acid in feed fermented with lactic acid bacteria., 2017, 39(10): 27-31. (in Chinese)

[16] KASPRZAK M M, HOUDIJK G M, OLUKOSI O A, APPLEYARD H, KIGHTLEY S P J, CARRE P, WISEMAN J. The influence of oil extraction process of different rapeseed varieties on the ileal digestibility of crude protein and amino acids in broiler chickens.2017, 227: 68-74.

[17] 孫林, 李呂木, 張邦輝, 許平輝, 付宏赟, 徐寶同. 多菌種固態(tài)發(fā)酵去除菜籽粕中的植酸. 中國(guó)油脂, 2008, 24(08): 60-63.

SUN L, LI L M, ZHANG B H, XU P H, FU H Y, XU B T. Removal of phytic acid from rapeseed meal by solid state fermentation with multi-strains., 2008, 24(08): 60-63. (in Chinese)

[18] 蔣玉琴, 李榮林, 張玳華, 邵明誠(chéng), 高家驊. 復(fù)合菌脫毒菜籽餅粕及其應(yīng)用:Ⅰ不同處理?xiàng)l件下復(fù)合菌體系發(fā)酵對(duì)菜籽粕硫甙的降解. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1999, 15 (2): 104-106.

JIANG Y Q, LI R L, ZHANG D H, SHAO M C, GAO J H. Detoxication of rapeseed meal with multi-microbial solution and its applicationⅠ. effect of fermentation of multi-microbial solution on the degradation of rapeseed meal glucosinolate under different conditions., 1999, 15(2): 104-106. (in Chinese)

[19] 肖萌，王遠(yuǎn)亮. 雙低菜籽粕混菌固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 43(9): 1-8.

XIAO M, WANG Y L. Fermentation of double lower rapeseed meal by mixed solid culturing., 2015, 43(9): 1-8. (in Chinese)

[20] Li D, Xi P, Gong L, FAN S J, HUANG C H. Determination of apparent ileal amino acid digestibility in rapeseed meal and cake processed at different temperatures using the direct and difference method with growing Pigs., 2002, 56(5): 339-349.

[21] 高冬余, 李呂木, 許發(fā)芝, 張邦輝, 吳勝華. 微生物固態(tài)厭氧發(fā)酵菜籽粕的研究. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36 (03): 75-79.

GAO D Y, LI L M, XU F Z, ZHANG B H, WU S H. Study on solid -state anaerobic fermentation of rapeseed meal with microorganism.2010, 36 (03): 75-79. (in Chinese)

[22] 劉長(zhǎng)松, 潘忠禮, 何榮海, 宋金彩. 混菌固態(tài)發(fā)酵菜粕對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及免疫功能的影響. 中國(guó)家禽, 2015, 37(24): 24-27.

LIU C S, PAN Z L, HE R H, SONG J C. Effects of mixed bacteria solid-state fermented rapeseed meal on growth performance, serum biochemical parameters and immune function of broilers., 2015. 2015, 37(24):24-27. (in Chinese)

[23] 詹湉湉, 柯芙容, 陳慶達(dá), 張少華, 許麗惠, 王全溪, 王長(zhǎng)庚. 發(fā)酵時(shí)間和料水比對(duì)豆粕發(fā)酵的影響. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然版), 2015, 44(2):193-197.

ZHAN T T, KE F R, CHEN Q D, ZHANG S H, XU L H, WANG Q X, WANG C G. Effects of fermentation time and material-water ratio on soybean meal fermentation., 2015, 44(2):193-197. (in Chinese)

[24] GRUBB C D, ABEL S. Glucosinolate metabolism and its control.2006, 11(2): 89-100.

[25] 王芳, 李學(xué)文, 廖亮, 黃瑜, 侯俊楠, 楊晶, 謝元, 唐如鍇, 李丹. 響應(yīng)面法優(yōu)化油菜籽粕中硫苷酶解工藝及其降解產(chǎn)物抑菌作用的初步研究. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(5): 264-268.

WANG F, LI X W, LIAO L, HUANG Y, HOU J N, YANG J, XIE Y, TANG R K, LI D. Optimization of enzymatic hydrolysis condition of glucosinolates from rapeseed meal by response surface methodology and the preliminary research of its bacteriostasis., 2017, 38(5): 264-268. (in Chinese)

[26] 付敏, 何軍, 余冰, 鄭萍, 黃志清, 毛湘冰, 虞潔, 陳代文. 混菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)菜籽餅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的影響. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2013, 25(7): 1579-1586.

FU M, HE J, YU B, ZHENG P, HUANG Z Q, MAO X B, YU J, CHEN D W. Effects of mixed microbial solid-State fermentation on nutrient values and anti-nutritional factor contents of rapeseed cake., 2013, 25(7): 1579-1586. (in Chinese)

[27] MO W, W, WU X J, JIA G, ZHAO H, C,HEN X L, TANG J Y, WU C M, CAI J Y, TIAN G, WANG J, LIU G M. Roles of dietary supplementation with arginine or N-carbamylglutamate in modulating the inflammation, antioxidant property, and mRNA expression of antioxidant-relative signaling molecules in the spleen of rats under oxidative stress.2018(3):322-328.

[28] WASTON A, WAYMAN J, KELLY R, FEUGIER A, BIOGE V. Increased dietary intake of tyrosine upregulates melanin deposition in the hair of adult black-coated dogs., 2018(4): 422-428.

[29] ZHONG H, YIN Y, CHEN X. The effect of various proportions of Canola type rape-seed oil meal on amino acid digestibility and nutrient metabolism of layer chicken ration.1997, 29(3): 107-109.

[30] 張桂杰，魯寧，譙仕彥. 低蛋白質(zhì)平衡氨基酸飼糧對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能、胴體品質(zhì)及腸道健康的影響. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2012, 24(12): 2326-2334.

ZHANG G J, LU N, QIAO S Y. Effects of low protein diets balanced with amino acids on growth performance, carcass characteristic and intestinal health of growing pigs.2012, 24(12): 2326-2334. (in Chinese)

Optimization of Solid State Fermentation for Rapeseed Meal with Mixed Strains

WU ZhengKe, LIU GuoHua, LI Yang, ZHENG AiJuan, CHANG WenHuan, CHEN ZhiMin, CAI HuiYi

(Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center of Biological Feed/Key Laboratory of Feed Biotechnology of Agricultural Ministry, Beijing 100081)

【Objective】The aim of this study was to optimize the solid state fermentation conditions for rapeseed meal with mixed strains and to improve the feeding value of rapeseed meal. It would provide a reference for the application of fermented rapeseed meal in animal husbandry in China.【Method】The rapeseed meal used in this study was conventional rapeseed meal. Three strains of,andwere used, and the glucosinolates degradation rate (X%), total acid increase rate (Y%), polypeptide increase rate (Z%) were used as evaluation indexes. Method M was used as the comprehensive evaluation index (M=0.7*X+0.15*Y+0.15*Z). In the experiment one, the effects of different strains addition levels and the best mixed ratio of the three strains in fermented rapeseed meal were investigated through L9(34) three-factors and three-levels orthogonal array design methods. Based on the result of experiment one, an L16(45) four-factors and four-levels of orthogonal array design experiment was designed to explore the optimal conditions of mixed strains solid state fermentation of rapeseed meal, and the fermentation temperature, feed water ratio, time, and inoculation quantity were selected as experimental factors. 【Result】The results showed as follow: (1) L9(34) orthogonal array design showed that the optimal mixed strains ratio of fermented rapeseed meal were::= 1:3:2. Under these condition, the contents of glucosinolates was degraded by 23.5%, the total acid and polypeptide increase rate were 179.2% and 375.0%, respectively. (2) Based on the result of experiment one, the range analysis of experiment two showed that the optimal conditions of mixed strains solid state fermentation of rapeseed meal were as follows: fermentation temperature was 33 °C, feed water ratio was 1:1, time was 84h and inoculation quantity was 6%. The pilot test of this conditions showed that the contents of glucosinolates was degraded by 48.8%, the total acid increase rate was 499.7%, the polypeptide increase rate was 148.4%, and the total change rate M was 131.4%. The results were in line with our expectation. The lowest total change rate M was noted when the temperature was 31 °C, and the total change rate M in temperature 33 °C was higher than 35 °C and 37 °C, but the difference between groups was not significant (> 0.05). The higher M was also noted when feed water ratio was 1:1.0 and fermentation time was 84h. No significant differences in M were observed between conditions in different levels of inoculation quantity. (3) The fermentation of rapeseed meal by mixed strains also increased the content of CP (37.05% vs. 40.90%) and decreased the concentration of crude fiber (17.47% vs. 16.72%). The amino acid composition of rapeseed meal and fermented rapeseed meal showed that fermentation increased the content of several amino acids in rapeseed meal, especially Asp, Thr, Ser, Glu, Pro, Ala, and Lys. The greatest change caused by fermentation was for glucosinolates, which decreased from 36.08 μmol·g-1to 18.48 μmol·g-1. The fermentation of rapeseed meal increased the content of polypeptides (from 0.84% to 2.09%) and increased the content of total acid (from 1.01% to 6.05%) compared to unfermented rapeseed meal. The concentration of crude fat was similar in rapeseed meal and FRSM (4.31% and 4.39%).【Conclusion】The optimal fermentation conditions could effectively degrade the glucosinolates and increase the content of polypeptide and total acid in rapeseed meal, so the nutritional value of rapeseed meal was significantly improved.

rapeseed meal; mixed strains; solid state fermentation; orthogonal design

2018-08-02；

2019-09-20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-42）

吳正可，E-mail：wzk199107@163.com。通信作者劉國(guó)華，E-mail：liuguohua@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）