冷凍消融免疫效應(yīng)的研究進(jìn)展*

段樺 王丹 連巖巖 周天 胡凱文 綜述 姜敏 審校

癌癥是全球185 個(gè)國家中70 歲以下人群的主要死亡原因，在歐美國家位居第1 位，在中國位居第2位，嚴(yán)重影響全人類健康［1］。越來越多的證據(jù)表明，癌癥是一種全身性的慢性疾病。絕大多數(shù)病例確診時(shí)已處于晚期，能夠接受手術(shù)切除的病例不足20%，約90%患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。癌癥最佳治療策略應(yīng)同時(shí)兼顧兩個(gè)方面：局部和全身。一方面實(shí)現(xiàn)局部精準(zhǔn)打擊，減輕瘤負(fù)荷；另一方面控制或消滅遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶或潛在轉(zhuǎn)移灶［2］。

冷凍消融術(shù)是運(yùn)用廣泛的腫瘤微創(chuàng)手段，局部消瘤作用確切、不良反應(yīng)小、安全性高。與手術(shù)、放療、熱消融相比，冷消融能夠最大程度地保留瘤灶抗原活性，從而更有效地激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，甚至誘發(fā)“遠(yuǎn)位效應(yīng)”，即遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶減小或消失，這對于晚期癌癥的治療極其重要?？梢娎鋬鱿谛g(shù)能夠兼顧局部消瘤和全身免疫效應(yīng)兩個(gè)方面，且療效確切、不良反應(yīng)小。以冷消融術(shù)為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療也已廣泛用于肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤。

研究表明遠(yuǎn)位效應(yīng)并不常見，而且冷凍消融術(shù)還可能導(dǎo)致免疫抑制或免疫無應(yīng)答，這與癌癥類型、壞死/凋亡比例、冷凍參數(shù)等有較強(qiáng)的相關(guān)性。如何利用、加強(qiáng)全身免疫效應(yīng)并誘導(dǎo)遠(yuǎn)位效應(yīng)是治療腫瘤尤其是晚期腫瘤的關(guān)鍵。

1 冷凍消融術(shù)的免疫效應(yīng)機(jī)制

冷凍消融術(shù)借助液氮或低溫探頭末端快速減壓的氬氣進(jìn)行組織凍結(jié)，并通過反復(fù)凍融循環(huán)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。已知的4 種抗腫瘤生物學(xué)機(jī)制包括直接細(xì)胞損傷、血管損傷和缺血、細(xì)胞凋亡和免疫效應(yīng)［2］。免疫效應(yīng)的產(chǎn)生與抗原釋放有關(guān)。冷凍消融后殘余瘤灶的壞死物質(zhì)持續(xù)釋放入血，致敏樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs），激活T 淋巴細(xì)胞，并作為體液免疫的抗原刺激B細(xì)胞，從而激活細(xì)胞免疫和體液免疫，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。

在實(shí)際操作過程中，冷凍消融以療效最大化為出發(fā)點(diǎn)，力求根治性消融。冰球邊緣（0℃線）必須超出病灶邊緣至少1 cm，以使-20℃區(qū)域達(dá)到整個(gè)病灶［3］。已知能夠增加細(xì)胞損傷的冷凍參數(shù)包括快速凍結(jié)、緩慢解凍、降低冷凍溫度、延長最低溫度持續(xù)時(shí)間以及多次凍融循環(huán)［4］。與冷凍消融療效最大化不同，冷凍免疫效應(yīng)受癌種、壞死凋亡比例等因素影響，二者對冷凍參數(shù)的要求有出入，前者著眼于局部消瘤效果，后者著眼于全身和瘤內(nèi)免疫狀態(tài)的變化，是局部和全身的概念，如何平衡好二者的關(guān)系值得深入研究。

2 冷凍消融術(shù)在不同癌種中的免疫效應(yīng)

冷凍免疫現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于20 世紀(jì)60年代，Yantorno 首次發(fā)現(xiàn)冷凍兔精囊腺后體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體［5］。隨后Soanes觀察到1例前列腺癌肺轉(zhuǎn)移患者接受冷凍治療后原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶均消失，另1例前列腺癌頸椎轉(zhuǎn)移患者冷凍后頸椎轉(zhuǎn)移灶消失。冷凍免疫反應(yīng)的概念，指的是冷凍消融后腫瘤組織壞死并釋放抗原，從而刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，達(dá)到清除殘留癌細(xì)胞的目的［5］。研究表明，不同癌種對于冷凍治療的免疫應(yīng)答不完全相同，這與腫瘤異質(zhì)性有很大關(guān)系［4-5］。

2.1 前列腺癌

最早的冷凍免疫現(xiàn)象即來自前列腺癌。目前冷凍消融術(shù)可用于Ⅰ期以及放療后局部復(fù)發(fā)性前列腺癌的搶救性治療?；A(chǔ)研究方面，Yang等［6］建立小鼠前列腺癌雙側(cè)腹股溝移植模型，干預(yù)右側(cè)腫瘤后觀察左側(cè)腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果與手術(shù)組和對照組相比，冷凍組小鼠的腫瘤生長抑制最明顯，生存期最長，肺轉(zhuǎn)移率也最低。同時(shí)CD4+T、CD8+T、Th1/Th2 比值、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和NK細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)，證實(shí)冷凍消融能夠通過激發(fā)免疫效應(yīng)發(fā)揮遠(yuǎn)位效應(yīng)。

但并非所有研究都得到陽性結(jié)果，Hoffmann等［7］冷凍前列腺癌大鼠后進(jìn)行癌細(xì)胞復(fù)接種，盡管在血清中發(fā)現(xiàn)了特異性抗體，但對腫瘤的繼發(fā)性生長無明顯影響，其認(rèn)為冷凍效果可能僅局限于細(xì)胞和血管層面的變化，如何將冷消融免疫效應(yīng)放大、并轉(zhuǎn)化為生存獲益需要更多的研究來證實(shí)。

2.2 腎癌

冷凍消融在腎癌中的免疫效應(yīng)較明顯。歐洲泌尿外科協(xié)會(huì)推薦冷消融治療直徑＜4 cm、T1a 期尤其是高齡或不能耐受手術(shù)的腎癌。Kato 等［8］證實(shí)冷凍消融可以引起腫瘤組織和全身的免疫反應(yīng)。研究收集22例腎癌患者冷凍消融前和冷凍消融后3個(gè)月的腫瘤組織和14 例患者的血液標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)消融后腫瘤組織中抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）浸潤增多，T 細(xì)胞發(fā)生克隆性增殖。冷凍后組織內(nèi)CD4+、CD8+、顆粒酶A、CD11c 的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，CD8+/FOXP3 比值明顯升高，可見冷凍消融通過抗腫瘤T細(xì)胞的寡克隆擴(kuò)增，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

Matin 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，無論是正常組織還是腫瘤組織，冷凍消融的物理屬性都能誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，使免疫抑制狀態(tài)得以緩解或逆轉(zhuǎn)。在小鼠腎癌模型中，荷瘤組小鼠未見明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，而冷凍正常小鼠腎臟組和冷凍荷瘤小鼠腎臟組都可見明顯的炎癥反應(yīng)。浸潤細(xì)胞主要為中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+、CD8+T，IFN-γ的表達(dá)也增加。

2.3 乳腺癌

冷凍消融術(shù)是治療單灶性導(dǎo)管癌的有效方法，即使是Ⅳ期乳腺癌，冷凍消融術(shù)也是一種安全有效的方法［10］。一項(xiàng)乳腺癌冷凍免疫的研究來自Sabel［11］。在小鼠MT-901乳腺癌模型中，與手術(shù)組相比，冷凍組Th1型細(xì)胞因子（IL-12、IFN-γ）明顯升高，Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）無明顯變化。腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)特異性T淋巴細(xì)胞增多，脾臟NK細(xì)胞活性增加。干預(yù)2周后小鼠左側(cè)皮下再次接種MT-901細(xì)胞株，結(jié)果手術(shù)組腫瘤再發(fā)生率為86%，冷凍組僅為16%。在冷凍組小鼠左側(cè)皮下接種RENCA腎癌細(xì)胞系后，約80%出現(xiàn)新發(fā)腫瘤，可見冷消融不僅能夠激活免疫效應(yīng)發(fā)揮腫瘤抑制作用，而且具有高度特異性。

2.4 肺癌

盡管還沒有隨機(jī)對照試驗(yàn)證實(shí)經(jīng)皮冷消融術(shù)與手術(shù)治療早期肺癌的療效差異，但是冷消融治療已經(jīng)被認(rèn)為是治療ⅠA期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的可行選擇。體外實(shí)驗(yàn)表明，肺癌細(xì)胞經(jīng)冷凍處理后能夠激活單個(gè)核細(xì)胞［12］，并作為腫瘤抗原致敏DC 誘導(dǎo)CTL，發(fā)揮靶細(xì)胞殺傷作用［13］。在NSCLC的臨床研究中，宋光等［14］研究發(fā)現(xiàn)，氬氦冷凍后CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+、IFN-γ 均顯著增多，CD8+T、IL-6顯著降低，表明氬氦刀能夠改善肺癌患者的免疫狀態(tài)，發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。

2.5 肝癌

有研究認(rèn)為，與射頻消融或微波消融相比，肝臟腫瘤冷凍消融的意義有限，因此研究相對較少［14］。現(xiàn)有的研究結(jié)果也具有一定爭議。20 世紀(jì)70年代，有研究認(rèn)為與手術(shù)組相比，冷凍消融組并未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫應(yīng)答現(xiàn)象［15］。但在后續(xù)的研究中，Osada等［16］發(fā)現(xiàn)接受冷凍治療的13 例肝癌患者中，有5 例患者出現(xiàn)冷凍免疫反應(yīng)，外周血IFN-γ/IL4 比值升高。李前進(jìn)等［17］觀察到冷消融后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞活性較術(shù)前明顯升高，但CD8+細(xì)胞活性較術(shù)前明顯下降。

2.6 膠質(zhì)瘤

膠質(zhì)瘤是最早使用冷凍消融治療的腫瘤之一，療效明確，能夠產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應(yīng)。Yin等［18］研究發(fā)現(xiàn)氬氦刀冷凍后DC 表面的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80/CD86等標(biāo)記物明顯上調(diào)。He等［19］將發(fā)現(xiàn)荷瘤組小鼠的腫瘤引流區(qū)淋巴結(jié)中存在免疫耐受型DC，而與手術(shù)組相比，氬氦刀能明顯恢復(fù)免疫耐受DC的功能，并觸發(fā)T細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤免疫。

2.7 黑色素瘤

與其他腫瘤不同，研究表明冷凍消融在黑色素瘤可能發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。Kudo-Saito 等［20］建立小鼠黑色素瘤模型，發(fā)現(xiàn)冷凍后瘤內(nèi)、脾臟、骨髓中活化白細(xì)胞黏附分子（activated leukocyte adhesion molecules，ALCAM）表達(dá)均明顯增加，ALCAM 陽性細(xì)胞通過抑制IFN-γ 產(chǎn)生以及減弱腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞毒性而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用。當(dāng)ALCAM 被單克隆抗體封閉后，CD8+T 的細(xì)胞毒性明顯增加，腫瘤生長和轉(zhuǎn)移明顯變慢，因此ALCAM 表達(dá)增加可能是免疫抑制的分子機(jī)制之一。但最新研究表明當(dāng)將冷凍消融與胞嘧啶鳥苷聯(lián)合時(shí)能夠顯著增加腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)量，并產(chǎn)生更多干擾素γ［21］。

2.8 肉瘤

多數(shù)研究都表明，冷凍消融術(shù)在纖維肉瘤中也主要發(fā)揮免疫抑制作用。Yamashita等［22］發(fā)現(xiàn)與手術(shù)相比，冷凍組大鼠抗腫瘤免疫功能明顯滯后。將冷凍組大鼠的殘余腫瘤組織切除后，腫瘤轉(zhuǎn)移明顯減少，而將冷凍后壞死腫瘤組織移植到手術(shù)組大鼠體內(nèi)，則腫瘤轉(zhuǎn)移明顯增加?？梢娎鋬鱿诓粌H導(dǎo)致免疫功能抑制，并能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Sabel等［23］也發(fā)現(xiàn)，冷凍消融后小鼠對繼發(fā)性腫瘤的抵抗力明顯降低，繼發(fā)性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移率增加。Shibata等［24］發(fā)現(xiàn)，冷凍消融能夠加速纖維肉瘤模型小鼠的肺轉(zhuǎn)移，且對再種植的腫瘤無抑制生長作用，并認(rèn)為冷凍后免疫抑制可能由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）引起。

在其他類型肉瘤中，冷凍消融的免疫學(xué)效應(yīng)似乎更好一些。如Kawano 等［25］建立小鼠骨肉瘤模型，將冷凍后腫瘤組織與DC 體外共培養(yǎng)后移植到小鼠體內(nèi)，小鼠血清干擾素水平升高，肺轉(zhuǎn)移灶減少，轉(zhuǎn)移灶中CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，說明冷凍后腫瘤組織致敏了DC，從而使得抗腫瘤免疫應(yīng)答能力明顯增強(qiáng)。此外，在肌肉瘤和癌肉瘤的研究中也能檢測到冷凍手術(shù)引發(fā)的免疫效應(yīng)［26］。

可見冷凍消融術(shù)在不同癌種間，甚至是同一癌種的不同研究中發(fā)揮的免疫效應(yīng)是不同的，說明冷凍免疫效應(yīng)與腫瘤異質(zhì)性密切相關(guān)。此外，免疫效應(yīng)還受到多種因素干擾，如壞死/凋亡比例、冷凍參數(shù)等，下面對研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的影響因素做出介紹。

3 冷凍消融術(shù)免疫效應(yīng)的其他影響因素

3.1 壞死、凋亡面積比例

冷凍消融后導(dǎo)致的細(xì)胞壞死或凋亡可引起完全不同的抗腫瘤免疫效應(yīng)，因此組織壞死與凋亡面積的比例是決定免疫狀態(tài)的關(guān)鍵因素［27］。有研究認(rèn)為，細(xì)胞壞死后內(nèi)容物仍在，并能分泌DNA、RNA、熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）等危險(xiǎn)信號，這些危險(xiǎn)信號具有免疫刺激作用，能夠致敏DC以充分激活T細(xì)胞，從而導(dǎo)致特異性免疫反應(yīng)［28］。但細(xì)胞凋亡后其碎片被巨噬細(xì)胞或DC 吞噬，并不釋放DNA、RNA和HSP等危險(xiǎn)信號，無法激活DC。未成熟的DC可能觸發(fā)免疫抑制信號，從而導(dǎo)致T細(xì)胞失活［29］。

由于冰球內(nèi)的溫度降低速度不同，腫瘤中心區(qū)表現(xiàn)為凝固性壞死，周圍區(qū)域則表現(xiàn)為凋亡。因此在冷凍治療過程中，增加壞死面積、減少凋亡面積是免疫最大化的重要因素。

3.2 冷凍范圍

現(xiàn)代冷凍理論強(qiáng)調(diào)完全性消融，冰球邊緣要超出病灶邊緣1 cm，但研究表明不同消融范圍的免疫學(xué)效應(yīng)差異很大。Sabel等［23］建立小鼠MRMT-1肝癌模型，發(fā)現(xiàn)不完全冷凍組小鼠存活時(shí)間明顯長于對照組，而完全冷凍組生存時(shí)間未延長，并有3例死亡。與對照組相比，完全冷凍組小鼠對再次接種更敏感，而不完全冷凍組小鼠則能明顯抑制再次接種腫瘤的生長，可見冷凍范圍可能是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。

另一項(xiàng)研究的結(jié)果與之類似。Urano等［30］建立小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤模型，分為對照組（冷凍正常肝組織）、小體積冷凍組（冷凍1個(gè)病灶）、大體積冷凍組（冷凍3個(gè)病灶），結(jié)果發(fā)現(xiàn)小體積冷凍組癌結(jié)節(jié)數(shù)量最少，并顯著低于對照組和大體積冷凍組。脾臟轉(zhuǎn)移方面，依然是小體積組最低（134.7±28.1），而對照組（158.2±25.3）和大體積組（156.3±9.4）基本相當(dāng)。提示較少數(shù)量的冷凍可能更有利于控制腫瘤轉(zhuǎn)移，冷凍數(shù)量太多反而發(fā)揮負(fù)向作用。有研究認(rèn)為，當(dāng)大量腫瘤被冷凍時(shí)，產(chǎn)生大量免疫復(fù)合物反而可能導(dǎo)致“高區(qū)域耐受性”，即抗原超載可能導(dǎo)致免疫抑制［31］。

3.3 冷凍速度

研究表明，不同冷凍速率的免疫效應(yīng)差異明顯［31］。Sabel 等［32］建立轉(zhuǎn)移性乳腺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)與手術(shù)切除相比，高冷凍速率可顯著增加腫瘤引流區(qū)淋巴結(jié)（tumor draining lymph nodes，TDLN）中腫瘤特異性T細(xì)胞數(shù)量，減少肺轉(zhuǎn)移，提高生存率。然而，低冷凍速率組中Treg細(xì)胞增加，肺轉(zhuǎn)移增加，生存率明顯降低。推測其原因可能為高冷凍速率導(dǎo)致細(xì)胞以壞死為主，從而激活免疫反應(yīng)，而低冷凍速率則導(dǎo)致細(xì)胞以凋亡為主，從而出現(xiàn)免疫抑制。

3.4 冷凍循環(huán)次數(shù)

目前，主流的冷凍循環(huán)次數(shù)為2 次，研究認(rèn)為能夠達(dá)到最佳消融效果，盡管消融最佳參數(shù)和免疫最佳參數(shù)并不完全一樣，但研究發(fā)現(xiàn)2次循環(huán)也能達(dá)到最佳免疫效應(yīng)。Takahashi 等［33］建立小鼠肺癌、黑色素瘤雙側(cè)種植模型，進(jìn)行左側(cè)腫瘤冷凍，測量對側(cè)腫瘤體積，并按照1、2、3 次循環(huán)次數(shù)分組，發(fā)現(xiàn)2 次循環(huán)組腫瘤生長速度最慢，瘤周CD4+T和CD8+T細(xì)胞浸潤比例最高。2 次循環(huán)組小鼠存活率也最高，與1 次組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與3次組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，2次循環(huán)組瘤周灌洗液中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12β、IFN-γ、TNF-α 最高，可見2 次循環(huán)可能是最佳參數(shù)，能最有效激活抗腫瘤免疫細(xì)胞，增加促炎細(xì)胞因子分泌，有效抑制腫瘤生長。

3.5 不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)

有學(xué)者認(rèn)為，冷消融導(dǎo)致的免疫效應(yīng)與時(shí)間有很強(qiáng)的相關(guān)性。Si［34］等納入20 例前列腺癌患者，發(fā)現(xiàn)術(shù)后4 周外周血TNF-α 和IFN-γ、Th1/Th2 比值均明顯升高，但術(shù)后8 周時(shí)明顯下降，提示冷凍消融的免疫增強(qiáng)效應(yīng)不具備持久性。Misao［35］等建立小鼠乳腺癌模型，發(fā)現(xiàn)干預(yù)后1～3 周內(nèi)手術(shù)組再種植抑制率較高，但在此后至10周內(nèi)，冷凍消融組明顯高于手術(shù)組（80%vs. 18%），且局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯降低?？梢娒庖咭种坪兔庖咴鰪?qiáng)可能存在一定時(shí)間差。

4 冷凍消融術(shù)免疫效應(yīng)增強(qiáng)策略

盡管與其他治療方法相比，冷消融具有最佳免疫效應(yīng)，并能引起遠(yuǎn)位效應(yīng)，但不幸的是，這種效應(yīng)很少發(fā)生，因此如何增強(qiáng)冷消融的免疫效應(yīng)是實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)位效應(yīng)、治療晚期腫瘤的關(guān)鍵。腫瘤免疫療法的實(shí)質(zhì)是激活免疫系統(tǒng)，冷凍消融可以作為體內(nèi)疫苗接種工具來加強(qiáng)免疫療法的影響。初步研究證實(shí)當(dāng)冷凍消融與免疫調(diào)節(jié)療法結(jié)合時(shí)，這種效應(yīng)可能會(huì)增強(qiáng)［36］。

4.1 增加壞死面積，減小凋亡面積

壞死誘導(dǎo)免疫增強(qiáng)，凋亡導(dǎo)致免疫抑制，壞死、凋亡之間的平衡是調(diào)控免疫效應(yīng)的關(guān)鍵因素。最近的研究集中在兩種方法上，一是借助計(jì)算機(jī)模型繪制等溫線，進(jìn)行術(shù)中冰球的溫度實(shí)時(shí)監(jiān)測，將冰凍區(qū)域進(jìn)行可視化成像，以此預(yù)估達(dá)到-40℃以下的腫瘤體積，從而在消融過程中形成實(shí)時(shí)反饋［37］；二是借助分子佐劑來增加冰球外圍組織的冷凍敏感性，包括鹽、防凍蛋白和一些氨基酸等［38］。由于冰晶的存在，這些佐劑會(huì)造成額外的直接細(xì)胞損傷。但如何選擇合適的劑量，在保證起效的同時(shí)不造成周圍正常組織的損傷，仍存在技術(shù)瓶頸。

4.2 細(xì)胞過繼療法

經(jīng)典的細(xì)胞過繼療法（adoptive cell therapies，ACTs）指從患者的腫瘤或外周血中分離免疫細(xì)胞，進(jìn)行體外擴(kuò)增后重新輸注回體內(nèi)，以達(dá)到根除腫瘤的目的。目前，ACT主要用于T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的DC［39］。一項(xiàng)冷凍聯(lián)合同種異體NK 細(xì)胞免疫治療晚期肝癌的研究表明［38］，聯(lián)合組中位無進(jìn)展生存期明顯高于單純冷消融組（9.1 個(gè)月vs. 7.6 個(gè)月），應(yīng)答率和疾病控制率也均優(yōu)于單純冷凍組。免疫狀態(tài)方面，聯(lián)合組患者NK細(xì)胞、Th1型因子水平明顯升高，Th2型因子無明顯變化。在晚期腎細(xì)胞癌和晚期NSCLC中也觀察到同樣的現(xiàn)象［41-42］。

4.3 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）可以刺激DC表達(dá)腫瘤抗原，已廣泛用于癌癥免疫治療，與冷凍消融聯(lián)合可增強(qiáng)抗腫瘤作用。一項(xiàng)納入6例晚期腎癌患者的臨床研究表明［43］，冷凍消融干預(yù)肺轉(zhuǎn)移灶聯(lián)合GMCSF霧化吸入能夠誘導(dǎo)全身性細(xì)胞和體液免疫。在4例患者中觀察到腫瘤特異性CTL增殖和Th1細(xì)胞因子增多。而且臨床應(yīng)答似乎與免疫反應(yīng)大小有關(guān)。在晚期激素難治性前列腺癌患者中也發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞腫瘤特異性T細(xì)胞反應(yīng)增加。在小鼠皮下膠質(zhì)瘤模型中，脾臟分泌IFN-γ增加，CD8+T細(xì)胞殺傷作用顯著增強(qiáng)，并在第7天達(dá)到高峰［44］。

4.4 免疫檢查點(diǎn)抑制劑

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4（CTLA-4）和程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（PD-1）是最經(jīng)典的免疫檢查位點(diǎn)，主要表達(dá)在T細(xì)胞上。研究證實(shí)冷凍消融和免疫治療的聯(lián)合治療可能有利于增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效果［45］。

伊匹單抗（ipilimumab）是CTLA-4 檢查點(diǎn)抑制劑，一項(xiàng)臨床研究將早期可手術(shù)乳腺癌患者分為3組，分別于術(shù)前接受單純冷凍消融、ipilimumab 以及二者聯(lián)合治療，觀察免疫狀態(tài)變化和對手術(shù)延遲的影響。研究發(fā)現(xiàn)3種治療模式都不會(huì)造成手術(shù)延遲，并且聯(lián)合治療組可能具有更好的瘤內(nèi)和全身免疫效果，聯(lián)合治療與Th1 型細(xì)胞因子、CD4+和CD8+T 細(xì)胞的活化與增殖以及治療后腫瘤內(nèi)效應(yīng)T 細(xì)胞與Treg細(xì)胞比值的持續(xù)升高有關(guān)［45］。在另一項(xiàng)臨床研究中，11 例肝細(xì)胞癌患者接受CTLA-4 抑制劑tremlimumab 聯(lián)合冷凍消融治療后，腫瘤組織中CD8+T 細(xì)胞出現(xiàn)積聚［46］。在小鼠前列腺癌模型中，聯(lián)合組小鼠不僅腫瘤明顯縮小，病灶內(nèi)CD4+、CD8+T 細(xì)胞出現(xiàn)高度浸潤，瘤內(nèi)效應(yīng)T細(xì)胞與調(diào)Treg的比值也顯著升高［47］。

目前，關(guān)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑無效的一種機(jī)制是腫瘤內(nèi)特異性T 細(xì)胞浸潤不足。而冷凍消融能夠引起瘤內(nèi)免疫狀態(tài)的變化，有利于加強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑效應(yīng)，二者具有協(xié)同增效的理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)支持，但如何進(jìn)行組合尚沒有定論，是下一步的研究方向［48］。

5 Toll樣受體激動(dòng)劑

先天性免疫細(xì)胞表達(dá)Toll 樣受體激動(dòng)劑（Tolllike receptor，TLR），TLR信號能夠觸發(fā)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)變，促進(jìn)從免疫耐受向免疫激活狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)IFN-γ 和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)［49-50］。

咪喹莫特是一種Toll 樣受體激動(dòng)劑，Nomikos等［51］將其與冷凍消融聯(lián)合治療56 例基底細(xì)胞癌患者，發(fā)現(xiàn)CD3+細(xì)胞密度在治療后第12～16 天明顯升高。CD68+細(xì)胞密度也持續(xù)升高并保持在較高水平。而冷凍治療后Treg 細(xì)胞數(shù)量明顯下降，并持續(xù)到治療周期的第28天，可見免疫狀態(tài)發(fā)生明顯變化，聯(lián)合治療增強(qiáng)了免疫效應(yīng)。

6 結(jié)語與展望

冷凍消融技術(shù)進(jìn)入中國已20年，無論是單獨(dú)運(yùn)用，亦或是聯(lián)合其他治療，在不同分期的多個(gè)癌種中發(fā)揮著重要作用。除具有明確的局部抗腫瘤作用外，大多數(shù)研究均表明冷凍消融能夠激發(fā)全身或瘤內(nèi)的免疫反應(yīng)，甚至誘導(dǎo)遠(yuǎn)處病灶消失。但也有部分實(shí)驗(yàn)表明存在免疫無應(yīng)答或免疫抑制的情況。這與癌癥類型、壞死凋亡面積比例、冷凍參數(shù)如范圍、速率、數(shù)量等有關(guān)，因此應(yīng)明確最佳冷凍免疫參數(shù)極其重要，是冷凍消融抗腫瘤作用的進(jìn)一步延伸。