哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑降低腎移植受者人巨細胞病毒感染的研究進展

張 帆，邢益平

(南京醫(yī)科大學，江蘇 南京 210029)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是β皰疹病毒家族成員之一，該家族中還包含人皰疹病毒6、7，以及許多動物巨細胞病毒。HCMV DNA基因組大小約為230 kb,是目前人類病毒中最大的[1]。HCMV DNA基因組由其獨特的長序列(UL)和短序列(US)兩部分組成，每一部分都是反向重復序列[2]。HCMV是感染人類的八大皰疹病毒之一，常感染免疫力低下者，尤其是移植術(shù)后患者、晚期艾滋病患者以及新生兒[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin ，mTOR)是酸肌醇-3-激酶(PI3K)家族下游的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)，該激酶可影響HCMV感染的所有階段[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑(mTORi)作為免疫抑制劑用于腎移植術(shù)后患者，可降低HCMV感染事件[4-8]。本文就mTORi降低腎移植受者HCMV感染的研究進展進行綜述。

1 HCMV感染

HCMV一個重要的生物學特性是導致宿主終身潛伏感染，一旦HCMV被激活，可以再次發(fā)病[1]。HCMV潛伏感染的機制可能與主要早期即刻蛋白(major immediate-early protein，MIEP)的表達相關(guān)。MIEP可反作用于宿主細胞基因，通過調(diào)控宿主細胞基因表達水平，進而改變宿主細胞的生理狀態(tài)，從而促進病毒的增殖。HCMV感染的三個階段皆調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶(acid-inositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase，AKT/PKB)/mTOR通路[2]，如在感染成纖維細胞早期，PI3K/AKT/mTOR通路在血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和或整合素參與介導下早期瞬時激活，而持續(xù)性激活則依賴于病毒的MIEP IE72和IE86[9]。PI3K的早期激活是病毒進入宿主所必需的，而后期的持續(xù)性激活則是病毒基因表達和復制的重要保障。

2 腎移植術(shù)后HCMV感染現(xiàn)狀

盡管已有許多預防和治療策略，免疫抑制狀態(tài)下器官移植者HCMV感染仍然是一個嚴重的問題。除了費用增加，發(fā)病率和病死率增高外，HCMV感染也可能與急性排斥反應，減弱移植物功能和降低長期生存率有關(guān)。在未預防性使用抗病毒藥物的情況下，10%～20%的腎移植術(shù)后患者會出現(xiàn)癥狀性HCMV感染，高達50%的患者表現(xiàn)為無明顯癥狀的病毒激活狀態(tài)。盡管使用纈更昔洛韋或更昔洛韋可有效預防HCMV感染，但遲發(fā)性HCMV感染還是會發(fā)生在預防性抗病毒之后[10-11]。Helanter?等[10]報道，預防性使用抗病毒藥物3個月，停藥后18%～31%的腎移植患者出現(xiàn)遲發(fā)性HCMV感染。有證據(jù)表明移植術(shù)后抗病毒達6個月可降低遲發(fā)性HCMV感染發(fā)生率，但Helanter?等[10]研究發(fā)現(xiàn)，預防性使用纈更昔洛韋長達6個月，仍有48%的患者出現(xiàn)遲發(fā)性HCMV感染；Arthurs等[11]研究也提及，預防性使用抗病毒藥物92 d后仍有遲發(fā)性HCMV感染的可能。因此，目前的抗病毒藥物不足以滿足人們的需求，鑒于HCMV獨特的生命周期，必須考慮新的抗病毒方案。

3mTOR

mTOR是PI3K家族下游AKT，是參與細胞內(nèi)多個信號通路的重要物質(zhì)，影響細胞的生長、增殖、代謝、自噬、血管生成等諸多重要過程[9]。mTORi進入細胞后，在胞漿內(nèi)與FK結(jié)合蛋白12(FK binding protein-12，F(xiàn)KBP-12)結(jié)合形成復合物，進而與 mTOR 結(jié)合，抑制mTOR活性，使p70S6 激酶脫磷酸化而失活，從而抑制蛋白質(zhì)的合成及細胞周期循環(huán)[12]。因此，mTORi可抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖、分化及抗體的形成，同時也可抑制非免疫細胞(成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞和平滑肌細胞)的增殖[13]。mTOR的組成和功能如下。

3.1 mTORC1 mTORC1的主要功能是通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯，以控制蛋白質(zhì)合成。在胞內(nèi)營養(yǎng)不足時，mTORC1被腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)以結(jié)節(jié)性硬化復合物 (tuberous sclerosis complex, TSC)相關(guān)抑癌基因抑制[14]。當營養(yǎng)充足時，AMPK不被激活，AKT磷酸化并抑制TSC，導致mTORC1活化并提高蛋白翻譯[15]。mTORC1通過使eIF4F復合物和S6激酶磷酸化調(diào)節(jié)起始翻譯。eIF4E通常以低磷酸化狀態(tài)與eIF4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)結(jié)合，從而阻止翻譯起始復合物形成[16]。mTORC1磷酸化4E-BP1，降低其與eIF4E的親和力，允許eIF4F復合物的形成，并通過促進核糖體向5’端移動以增加翻譯量。eIF4F水平與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成水平直接相關(guān)。S6K磷酸化會激活其他翻譯因子，從而增加翻譯掃描，抑制蛋白翻譯抑制劑，并刺激氨基酸添加到新生肽鏈中[16]?？傊?，在生長因子或營養(yǎng)充足情況下，mTORC1是蛋白翻譯的主要調(diào)控因子。

3.2 mTORC2 關(guān)于mTORC2的研究資料較少，推測mTORC2主要在磷酸化和激活AKT中起重要作用。

4 mTOR通路在HCMV感染中作用

mTOR通路在HCMV感染中起重要作用。通常，在細胞應激階段，如在HCMV感染時mTOR活性降低。AMPK作為mTOR抑制劑，在HCMV感染時上調(diào)，但在被感染細胞中，這種關(guān)系似乎并不相關(guān)[17]。HCMV多功能蛋白UL38(protein UL38)與TSC1/2結(jié)合，通過破壞AMPK的負調(diào)節(jié)作用激活mTORC1。因此，在HCMV感染后通過提高磷酸化水平和增加eIF4E蛋白量來促進相關(guān)病毒復制蛋白質(zhì)的翻譯[18]。阻斷eIF4F復合物形成，可減少病毒復制，支持mTOR激活在HCMV感染復制階段具有重要作用。

mTOR在HCMV感染潛伏期的作用目前知之甚少。既往發(fā)現(xiàn)mTOR可以使一種轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子(KRAB-associated protein 1，KAP-1)磷酸化， KAP-1磷酸化的藥理作用可以激活處于潛伏期的HCMV，表明為維持HCMV感染潛伏期，可能需要抑制mTOR[19]。在單核細胞感染靜止期間，HCMV以一種PI3K/AKT依賴的方式激活mTOR。盡管mTOR活性增加，但HCMV的裂解復制并未啟動，推測可能需要一個閾值水平驅(qū)動復制，或者需要能與mTOR信號通路結(jié)合的其他因素驅(qū)動復制。

在細胞應激階段，熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock transcription factor-1,HSF1)[20]負責表達應激相關(guān)蛋白，此通常與帽結(jié)構(gòu)介導的翻譯無關(guān)。在HCMV感染的單核細胞中，存在從HSF1到mTOR的正反饋環(huán)，其中抑制HSF1活性可降低mTOR活性。

在HCMV感染單核細胞期間，mTOR和HSF1之間獨特的相互作用刺激產(chǎn)生抗凋亡mRNA的蛋白合成，如髓細胞白血病-1(myeloid leukemia cell-1，Mcl-1)蛋白、X染色體連鎖凋亡抑制基因(XIAP)、熱休克轉(zhuǎn)錄蛋白27(heat shock transcription protein 27，HSP27)，上述蛋白在生長因子處理后的細胞中不產(chǎn)生或微量產(chǎn)生,因此，可解釋在細胞應激時HCMV感染能激活mTOR[19]的原因。與之前研究[20]一致，發(fā)現(xiàn)C10(一種選擇性的Mcl-1小分子抑制劑)抑制Mcl-1可顯著誘導感染單核細胞的凋亡和死亡。但是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，失去Mcl-1對加速未感染單核細胞的凋亡影響很小。表明未感染的單核細胞在維持正常免疫監(jiān)視功能的同時，可能選擇性地清除感染HCMV的單核細胞。小分子抑制劑對XIAP的抑制也會導致感染單核細胞的死亡，但對未感染細胞的影響很小。因此，這組上調(diào)的蛋白代表了一種新的細胞抗病毒靶點，旨在選擇性地清除HCMV感染的單核細胞，同時允許未感染的單核細胞維持其正常功能。潛伏感染的CD34+干細胞活性也高度依賴于Mcl-1，因此，Mcl-1抑制劑有可能消除靜止和潛伏狀態(tài)下的感染細胞。

總而言之，PI3K/AKT/mTOR通路在HCMV感染的三個階段都具有重要作用[2]：(1) 確保在裂解感染過程中滿足病毒生產(chǎn)代謝的需求；(2)促進細胞向潛伏期感染的轉(zhuǎn)錄；(3)維持被感染單核細胞的生存。因此，PI3K/AKT信號通路的抑制在抑制HCMV復制以及清除感染細胞的宿主方面具有雙重作用，這一作用對移植患者的長期預后十分重要。

5 mTORi對HCMV感染的影響

依維莫司(EVR)、西羅莫司(SRL)是哺乳動物mTORi，具有免疫抑制和抗增殖作用。EVR已被證明可有效預防急性同種異體移植排斥反應。聯(lián)合使用EVR，可以使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑(CNI)的副作用最小化，同時保持CNI藥物效果和保護腎功能。臨床數(shù)據(jù)還表明，與霉酚酸酯(MMF)相比，EVR與降低CMV疾病發(fā)生有關(guān)[21]。HCMV復制依賴于宿主細胞中2種mTOR途徑中的1種，并且體外研究支持mTORi能夠降低HCMV感染[22-23]。在心臟移植術(shù)后，與使用MPA相比，使用EVR可降低HCMV事件(病毒血癥，臨床癥狀和感染)的發(fā)生率[24]。

多項研究[24-25]結(jié)果顯示，與MPA以及標準劑量TAC組患者相比，接受EVR和減少劑量TAC組患者中HCMV感染的發(fā)生率顯著降低，接受EVR的腎移植受者可能不需要進行HCMV感染的預防，只有接受急性排斥治療的患者或早期停用EVR的患者應進行常規(guī)的HCMV感染預防，此為一種顯著節(jié)約成本的替代策略。

H?cker等[25]研究顯示，HCMV高危(D+/R-)患者中采用EVR和低劑量CSA方案與接受標準CNI方案的患者相比，HCMV感染率和病毒復制水平均明顯降低；基于EVR的免疫抑制方案使HCMV復制發(fā)生風險比標準的CNI方案低83%；在HCMV復制高風險的兒童腎同種異體移植受者中，與標準劑量CNI方案相比，由EVR和低劑量糖皮質(zhì)激素(cyclosporin, CSA)組成的免疫抑制治療可使HCMV感染率和復制水平明顯降低。

6 mTORi未來應用展望

盡管有大量臨床研究證實，mTORi能降低腎移植受者HCMV感染事件，但 Cristelli等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在HCMV高危(D+/R-)且接受了兔源抗胸腺球蛋白誘導和他克莫司治療的腎移植受者隊列中，接受mTORi的患者HCMV感染/HCMV病的發(fā)生率未顯著下降。mTORi對HCMV感染發(fā)生率的影響在HCMV高危(D+/R-)且未接受預防性抗病毒治療的腎移植患者中沒有在D-/R+腎移植受者中明顯。

mTORi相較于其他免疫抑制，對腎、神經(jīng)的毒性非常小，但也有其相關(guān)不良反應，如高脂血癥、口腔潰瘍、貧血等[13]，故在使用mTORi時需警惕藥物不良反應的發(fā)生，同時當mTORi與其他免疫抑制相互組合時產(chǎn)生的不良反應需進一步研究探討。此外 Cristelli等[26]考慮mTORi效應的大小可能與HCMV相關(guān)特異性記憶細胞的存在有關(guān)。但有關(guān)mTOR信號通路對漿細胞的分化和功能影響知之甚少。動物試驗研究顯示，mTOR信號通路在抗體反應和漿細胞分化的早晚期皆發(fā)揮著重要的作用。

Bak等[27]通過CD3/CD28交聯(lián)反應測定SRL對幼稚T細胞和HCMV特異性T細胞的影響，發(fā)現(xiàn)SRL對幼稚T細胞和HCMV特異性CD8+T細胞有超出免疫抑制劑應用范圍的選擇性作用，可顯著改善HCMV特異性效應記憶T細胞功能，對幼稚T細胞產(chǎn)生一定負性影響。

綜上所述，有關(guān)HCMV感染對CD4+T細胞以及CD8+T細胞的mTOR信號通路的影響值得更加深入地研究。