全氟辛烷磺酸對斑馬魚肝臟影響機(jī)制的代謝組學(xué)研究

姚丹，吳昊，江敏,3,*

1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306 3. 上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)屬于全氟化合物(fluorinated organic compounds, FOCs)，是一種持久性有機(jī)污染物，因其具有良好的表面活性、疏水性、疏油性，自1949年由3M公司研制以來，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活用品[1-3]。PFOS化學(xué)結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定，在生物體內(nèi)難以被代謝排出，具有生物蓄積性，并且可遠(yuǎn)距離傳播[4-5]。迄今為止在世界各地環(huán)境(如大氣、水體、沉積物)[6-10]、動物[11-12]，甚至人的血清[13-14]、母乳[15]、臍帶血[16]中，PFOS都有檢出。已有大量研究表明PFOS會對生物心臟、肺、肝臟等多種臟器產(chǎn)生毒性作用，具有潛在的生態(tài)風(fēng)險[17-24]。肝臟作為生物體主要的有毒物質(zhì)代謝器官，同樣是PFOS主要的靶器官，PFOS可在肝臟中蓄積，導(dǎo)致肝臟腫大、損傷。潘若雷等[25]研究發(fā)現(xiàn)PFOS可引起三角帆蚌肝胰腺顯著的氧化損傷，且長期的PFOS暴露會造成肝胰腺細(xì)胞實質(zhì)性損傷；王玲[26]實驗表明PFOS暴露會引起小鼠肝臟內(nèi)脂肪含量升高，肝糖原含量降低。黨紅蕾等[27]研究顯示PFOS能引起半滑舌鰨肝細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞生物膜系統(tǒng)，從而使細(xì)胞增殖和多種代謝途徑受到抑制。

代謝組學(xué)(metabonomics)技術(shù)通過比較藥物作用前后生物體液或組織代謝表達(dá)的變化，能較全面地反映生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律，并且有著僅通過生物的較少組織樣品便可獲得大量信息的優(yōu)勢[28-29]。Kariuki等[30]運用代謝組學(xué)分析大型蚤(Daphniamagna)的PFOS暴露亞致死毒性，結(jié)果表明PFOS可破壞大型蚤的能量代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，并確定了用于PFOS暴露下大型蚤健康評價的幾種敏感代謝物指標(biāo)。Yu等[31]利用代謝組學(xué)研究小鼠的大腦和肝臟發(fā)現(xiàn)，全氟辛酸(PFOA)會影響大腦中神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素和谷氨酸的濃度，導(dǎo)致肝臟的炎癥，影響脂肪酸β氧化和生物合成。近年來，代謝組學(xué)已在藥物機(jī)理[32-33]、臨床診斷[34-35]、物種差異研究[36]、毒理學(xué)[37-38]、營養(yǎng)學(xué)[39-40]等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，未見運用代謝組學(xué)探究全氟辛烷磺酸對魚類低劑量的毒性機(jī)理的報道。本實驗將模式生物斑馬魚置于不同PFOS暴露濃度水平下，取肝臟進(jìn)行代謝組學(xué)檢測與分析，以篩選顯著性差異代謝物和分析相關(guān)代謝通路，為在代謝組學(xué)層面探究PFOS對水生生物肝臟毒性機(jī)理提供新的思路。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗斑馬魚購自上海奇溢自然旗艦店，魚齡3個月，體長(1.4 ± 0.2) cm，為同批親本所育。

所用儀器包括：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，7890A/5975)；全自動樣品快速研磨儀(上海凈信科技，Tissuelyser-24)；Eppendorf離心機(jī)(Centrifuge 5810 R)；高速離心濃縮儀(Labogene ScanSpeed40)；恒溫混勻儀(杭州瑞誠儀器有限公司，TS100)。

實驗藥品如下：全氟辛烷磺酸鉀(Sigma-Aldrich公司，98%)；HPLC級甲醇(Sigma-Aldrich公司)；HPLC級水(Sigma-Aldrich公司)；N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA，含1%TMS)(上海安譜實驗科技股份有限公司)；吡啶(分析純，Sigma-Aldrich公司)；甲氧基胺鹽酸鹽(分析純，Sigma-Aldrich公司)；2-氯苯丙氨酸(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 實驗方法

正式實驗前，斑馬魚于80 L水體中(水箱體積67 cm×50 cm×41 cm)暫養(yǎng)一周。一周后選取健康、活潑的斑馬魚80條，分為4組，分別為對照組和PFOS濃度為10、100、250 μg·L-1的實驗組，每組20條，每箱水體20 L(水箱為聚乙烯材質(zhì)，體積(47 cm×32 cm×25.5 cm)。實驗前斑馬魚12 h禁食，實驗為期40 d。養(yǎng)殖用水為充分曝氣除氯的自來水，控制水溫(25±2) ℃，光照:黑暗時間為14 h∶10 h，全天候充氣以維持水中溶解氧處于飽和水平，每天定時喂食薄片飼料(寵物家族)2次，喂食30 min后半換水以保持PFOS含量的穩(wěn)定，實驗期間及時清理殘餌和死亡斑馬魚。實驗結(jié)束時各組斑馬魚死亡數(shù)分別為0、3、2和4尾。第40天早上取樣。將斑馬魚置于冰上冷凍麻醉，迅速取其肝臟，每組取12尾魚，每3尾斑馬魚的肝臟混合作為1個樣品(即每組4個樣品)，樣品分別置于離心管中，液氮冷凍。在裝有樣品的離心管內(nèi)分別加入20 μL 0.3 mg·mL-12-氯苯丙氨酸(內(nèi)標(biāo))和800 μL甲醇水提取液(V甲醇∶V水=4∶1)，在全自動樣品研磨儀上勻漿處理后置于-20 ℃冰箱靜置10 min，取出后1 000 r·min-1離心5 min，吸取600 μL上清液于進(jìn)樣瓶中，置于高速離心濃縮儀3 h揮干溶液。在裝有揮干樣品的進(jìn)樣瓶中分別加入100 μL 15 mg·L-1甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液和N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺溶液，之后置于恒溫混勻儀78 ℃衍生化1 h，衍生化結(jié)束后于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣檢測。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Algilent，7890A/5975)檢測使用DB-17MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣體積為2 μL，進(jìn)樣溫度為260 ℃，不分流進(jìn)樣；采用程序升溫，初始溫度為60 ℃，以10 ℃·min-1的速度3 min升到315 ℃，270 ℃吹掃3 min，載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，恒定流速3.0 mL·min-1；質(zhì)譜接口溫度280 ℃，EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu；以全掃描模式獲得總離子流色譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀獲得的總離子流色譜圖原始數(shù)據(jù)由Agilent Mass Hunter Workstation (Qualitative Analysis B.07.00)、MS定量分析軟件進(jìn)行峰對齊和峰積分等處理，最終獲得一個含有化合物編號、保留時間和響應(yīng)值的Excel表格。將表格中的數(shù)據(jù)整理成含有實驗組編號、化合物編號、響應(yīng)值的Excel表格，所得表格導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)將數(shù)據(jù)標(biāo)度化、中心化處理，利用正交信號校正技術(shù)過濾代謝物變量信息并篩選出差異代謝物。

1.5 代謝物的鑒定及代謝途徑的分析

將上述軟件篩選得到的差異代謝物，對照相應(yīng)出峰時間，利用MSD ChemStation Data Analysis Application軟件查詢數(shù)據(jù)庫NIST Mass spectral Database，得到高匹配度的化合物，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)圖，查詢ChemSpider的Structure Search (http://www.chemspider.com/StructureSearch.aspx)版塊，HMDB (http://www.hmdb.ca)，KEGG (http://www.genome.jp/kegg/compound)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化學(xué)分子式結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行確定。將鑒定得到的代謝物整理出實驗組名稱、代謝物名稱、響應(yīng)值Excel表格，導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0在線分析軟件(http://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)，對全氟辛烷磺酸影響的代謝通路進(jìn)行分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 代謝物圖譜分析

此次實驗共獲得177個代謝物編號，將不同濃度PFOS暴露下含有實驗組編號、化合物編號、響應(yīng)值的斑馬魚肝臟數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件，首先在PCA狀態(tài)下分析對照組與3個實驗組肝臟組織的代謝譜，可得圖1。圖1顯示，肝臟數(shù)據(jù)矩陣空間分布對照組與實驗組均完全分開，表明從代謝水平上可以觀察到PFOS暴露所產(chǎn)生的影響。隨后，在OPLS-DA條件下對肝臟組織數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，可得圖2(a.R2X=0.848，Q2=0.752；b.R2X=0.815，Q2=0.824；c.R2X=0.867，Q2=0.816，R2表示OPLS-DA模型累計方差值，反映模型的擬合程度，Q2表示累計交叉有效性，反映模型的預(yù)測能力)，OPLS-DA狀態(tài)下模型對自變量的擬合能力和預(yù)測能力皆顯示良好，對照組與實驗組在肝臟代謝譜中均可以明顯區(qū)分。

圖1 對照組與10、100、250 μg·L-1 PFOS實驗組斑馬魚肝臟PCA得分圖注：C為對照組，T1、T2、T3分別為PFOS濃度10、100和250 μg·L-1的實驗組。Fig. 1 PCA scores plots of zebrafish liver in control group and experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1 Note: C stands for control group; T1, T2 and T3 stand for experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1, respectively.

圖2 對照組與10、100、250 μg·L-1實驗組斑馬魚肝臟OPLS-DA得分圖注： C為對照組，T1、T2、T3分別為PFOS濃度10、100和250 μg·L-1的實驗組。Fig. 2 OPLS-DA scores plots of zebrafish liver in control group and experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1 Note: C stands for control group; T1, T2 and T3 stand for experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1, respectively.

2.2 差異代謝物

為了篩選出能更好反映PFOS影響的差異代謝物，將對照組分別與各個實驗組進(jìn)行比較，在OPLS-DA分析結(jié)果的S-plot圖中，選擇∣p(corr)∣>0.5，∣p∣>0.1，VIP值>1.0且P值<0.05的差異代謝物。通過NIST譜庫檢索，并且利用HMDB、KEGG等在線數(shù)據(jù)庫對差異代謝物的結(jié)構(gòu)、名稱進(jìn)行比對確認(rèn)，與對照組相比，PFOS濃度為10 μg·L-1的斑馬魚肝臟中篩選出4種發(fā)生顯著性變化的代謝物，包括?；撬?、磷酸乙酰胺、β-D-葡萄糖、油酸；PFOS濃度為100 μg·L-1的斑馬魚肝臟中篩選出5種代謝物發(fā)生顯著性變化，分別為牛磺酸、β-D-葡萄糖、棕櫚酸、油酸、膽固醇；PFOS濃度為250 μg·L-1的斑馬魚肝臟中有5種代謝物發(fā)生顯著性變化，分別為?；撬?、β-D-葡萄糖、乳酸、甘油-3-磷酸、磷酸乙酰胺(表1)。

表1 不同濃度PFOS實驗組斑馬魚肝臟中的顯著性差異代謝物Table 1 Significantly changed metabolites of zebrafish liver in experimental groups of PFOS

注：↑為上調(diào)，*為差異顯著(P<0.05)，**為差異顯著(P<0.01)。

Note: ↑ stands for upregulation; * stands for significant difference (P<0.05); ** stands for significant difference (P<0.01).

圖3 10(A)、100(B)、250(C) μg·L-1 PFOS暴露對斑馬魚肝臟代謝通路的影響注： A圖中a1.?；撬岷蛠喤；撬岽x；b1.鞘脂代謝；c1.甘油磷脂代謝；d1.糖酵解或葡萄糖生成；B圖中a2.原代膽汁酸生物合成； b2.?；撬岷蛠喤；撬岽x；c2.類固醇生物合成；d2.類固醇激素生物合成；e2.糖酵解或葡萄糖生成； C圖中a3.?；撬岷蛠喤；撬岽x；b3.甘油磷脂代謝；c3.甘油脂代謝；d3.鞘脂代謝；e3.糖酵解或葡萄糖生成。Fig. 3 10(A), 100(B), 250(C) μg·L-1 PFOS impacts on zebrafish liver metabolism pathwayNote: in Figure A, a1. Taurine and hypotaurine metabolism; b1. Sphingolipid metabolism; c1. Glycerophospholipid metabolism; d1. Glycolysis or Gluconeogenesis. In Figure B, a2. Primary bile acid biosynthesis; b2. Taurine and hypotaurine metabolism; c2. Steroid biosynthesis; d2. Steroid hormone biosynthesis; e2. Glycolysis or Gluconeogenesis. In Figure C, a3. Taurine and hypotaurine metabolism; b3. Glycerophospholipid metabolism; c3. Glycerolipid metabolism; d3. Sphingolipid metabolism; e3. Glycolysis or Gluconeogenesis.

2.3 代謝通路分析

各實驗組PFOS暴露影響力大于零的代謝途徑見圖3(A、B、C分別為PFOS暴露濃度10、100、250 μg·L-1組)。結(jié)果顯示10、100、250 μg·L-1PFOS濃度組皆影響牛磺酸和亞?；撬岽x途徑和糖酵解或葡萄糖生成，且對牛磺酸和亞?；撬岽x途徑影響較大。

3 討論(Discussions)

已有研究表明PFOS會影響斑馬魚肝臟脂代謝，如胡芹[41]、崔燕[42]均在PFOS暴露后的斑馬魚肝臟切片中觀察到大量脂肪空泡。本研究同樣表明PFOS暴露可影響斑馬魚肝臟脂代謝。PFOS濃度10 μg·L-1和100 μg·L-1組的斑馬魚肝臟中均篩選出具有顯著性差異的飽和脂肪酸，PFOS濃度為10 μg·L-1組篩選出油酸，PFOS濃度為100 μg·L-1組篩選出油酸、棕櫚酸，而PFOS濃度為250 μg·L-1的實驗組斑馬魚肝臟中則未篩選出飽和脂肪酸。推測相比高濃度的PFOS，較低濃度PFOS暴露更傾向于促進(jìn)飽和脂肪酸的積累，可能對于肝臟脂肪代謝的影響更大。王玲[26]在碩士論文中曾研究PFOS暴露對小鼠肝臟脂肪含量的影響，結(jié)果顯示PFOS暴露后肝臟脂肪含量相比對照組有所升高，低劑量組脂肪含量顯著升高，高劑量組雖有升高但不顯著，與本實驗的研究結(jié)果相一致。在篩選出的飽和脂肪酸中，油酸隨著PFOS濃度的升高由P<0.01水平顯著升高變?yōu)镻<0.05水平顯著升高，再到變化不顯著(P>0.05)，顯示出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，可作為PFOS對斑馬魚肝臟脅迫的潛在標(biāo)記物。

牛磺酸是一種含硫非蛋白氨基酸，來源于半胱氨酸氧化脫羧。肝臟中的?；撬崾悄承┠懰岬慕M成部分，主要作用是與膽汁酸結(jié)合形成脂肪吸收所必需的?；悄懰帷Ａ硗?，牛磺酸還具有抗氧化損傷的作用，已被證明能顯著逆轉(zhuǎn)PFOS處理的PC12細(xì)胞活性降低和ROS增加[43-45]。實驗組中，隨著PFOS暴露濃度的升高，篩選出的?；撬嵊蒔<0.05水平顯著上升變?yōu)镻<0.01水平顯著上升，表明兩者之間具有一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，可作為斑馬魚在PFOS脅迫下肝臟的潛在標(biāo)記物。PFOS可造成肝臟氧化損傷[21,46]，250 μg·L-1PFOS組斑馬魚肝臟中?；撬岢曙@著性上升(P<0.01)，而飽和脂肪酸并未隨?；撬岢霈F(xiàn)顯著上升，由此推測高濃度PFOS的暴露下肝臟中上調(diào)的?；撬峥赡苤饕l(fā)揮對抗氧化的損傷作用。

葡萄糖為能量的主要來源，實驗組與對照組相比，斑馬魚肝臟中β-D-葡萄糖均顯著上升(P<0.01)，通過通路分析其涉及的代謝路徑為糖酵解或葡萄糖生成，提示PFOS會干擾肝臟糖代謝。

綜上所述，斑馬魚在PFOS濃度為10 μg·L-1、100 μg·L-1、250 μg·L-1溶液中暴露40 d后，對其肝臟的?；撬岷蛠喤；撬岽x、糖酵解或葡萄糖、部分脂類代謝均產(chǎn)生影響。其中，對?；撬岷蛠喤；撬岽x影響較大，較低濃度PFOS暴露更傾向于促進(jìn)肝臟脂肪的累積；顯著性差異代謝物?；撬?、葡萄糖、油酸可作為PFOS造成斑馬魚肝臟代謝異常的潛在標(biāo)記物，實驗結(jié)果為進(jìn)一步研究PFOS對水生動物肝臟毒性提供了一定的理論依據(jù)。本實驗中使用的代謝組學(xué)技術(shù)為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，其優(yōu)勢在于具有高分辨率和高靈敏度，分析成本較低，可重復(fù)性進(jìn)樣，具有高質(zhì)量的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)譜庫，能對代謝物定性和定量分析，局限性在于需要衍生化處理，不能獲得不穩(wěn)定或是難以揮發(fā)的代謝物信息。除此之外，目前主要的代謝組學(xué)技術(shù)還包括液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、核磁共振技術(shù)，單獨使用時亦是各有優(yōu)缺點，但是如果將它們聯(lián)合起來則可發(fā)揮更強(qiáng)大的作用，這也是現(xiàn)代儀器技術(shù)分析手段發(fā)展的一個趨勢，日后深入研究PFOS毒理機(jī)制代謝組學(xué)可以以此為切入口[52-53]。