亞洲柑橘木虱與柑橘黃龍病菌互作的研究進(jìn)展

張旭穎，岑伊靜*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病研究室，廣州 510642)

柑橘黃龍病是當(dāng)前全球柑橘產(chǎn)業(yè)上最重要的傳染性病害，分布在亞洲、南北美洲、大洋洲和非洲的近50個(gè)國家和地區(qū)，并且有不斷蔓延的趨勢(Bové，2006；江宏燕等，2018)。亞洲柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama，屬半翅目Hemiptera木虱科Psyllidae，我國原稱為柑橘木虱，是黃龍病最重要的媒介昆蟲。黃龍病的傳播過程即黃龍病病菌與蟲媒互作的過程，本文綜述了國內(nèi)外近年來有關(guān)柑橘木虱對(duì)黃龍病的傳播機(jī)制以及黃龍病菌與木虱、寄主植物三者的互作關(guān)系等內(nèi)容，為探索柑橘木虱及黃龍病新的防控途徑提供參考。

1 柑橘黃龍病及其媒介昆蟲

黃龍病的記載由來已久，早在18世紀(jì)的印度就有記載疑似柑橘黃龍病的癥狀，在當(dāng)時(shí)表現(xiàn)為柑橘樹頂梢枯死、生長緩慢，產(chǎn)量降低，它被命名為“枯梢病”(dieback)(Asana，1958)。1919年，黃龍病在中國的廣東潮汕地區(qū)被發(fā)現(xiàn)(Reinking，1919；林孔湘，1956)，早期該病的命名存在差異，這是由于各個(gè)地區(qū)的癥狀記載不同所導(dǎo)致的，比如印度稱為“枯梢病”、菲律賓稱為“葉斑駁病”、南非稱為“青果病”、臺(tái)灣稱為“立枯病”等(趙學(xué)源等，2007)，直到1995年在中國福州召開的第13屆國際柑橘病毒學(xué)組織(IOCV)會(huì)議決定以柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)作為該病的正式命名(Bové，2006)。

黃龍病可以侵染幾乎所有柑橘類植物，初期時(shí)造成果樹的黃梢和葉片斑駁黃化，發(fā)病初期，樹冠上有少部分新梢葉片黃化，呈現(xiàn)明顯的黃梢癥狀，隨后病梢下段枝條和樹冠其他部位的枝條陸續(xù)發(fā)病(Batool，2007；吳定堯，2010)。黃龍病造成植株壽命減短，果實(shí)產(chǎn)量銳減，果品質(zhì)劣，并可短期內(nèi)導(dǎo)致植株死亡，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Bové，2006，2014)。

在1967年以前，黃龍病病原菌被認(rèn)為是病毒，后來被認(rèn)為是一種類似支原體的原核生物(Mycoplasma Like Organisms；MLOs)，直到1977年，在電鏡下觀察到病原菌的細(xì)胞壁之后，最終確認(rèn)黃龍病病原菌為細(xì)菌(Garnier and Bové，1977)。目前的研究表明，黃龍病是一種韌皮部專性寄生的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬于α-變型菌綱Proteobacteria韌皮桿菌屬Liberibacter(Garnieretal.，1984；Jagoueixetal.，1994)，根據(jù)16S rDNA序列不同可將其分為亞洲種CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas、非洲種CandidatusLiberibacter africanus，CLaf和美洲種CandidatusLiberibacter americanus，CLam 3個(gè)種(Jagoueixetal.，1994；Teixeiraetal.，2005)。其中亞洲種為耐熱型，分布于亞洲和美洲，其分布最廣、為害最大；非洲種為熱敏感型，分布于非洲；美洲種僅發(fā)現(xiàn)于巴西(Bové，2006)。

黃龍病媒介昆蟲的發(fā)現(xiàn)始于非洲和印度。繼1965年McClean發(fā)現(xiàn)非洲柑橘木虱TriozaerytreaeDel Guercio傳播非洲柑橘青果病、1967年Capooretal.發(fā)現(xiàn)亞洲柑橘木虱傳播印度青果病后，我國也于上世紀(jì)70年代末通過蟲傳實(shí)驗(yàn)證實(shí)了亞洲柑橘木虱為黃龍病的傳播媒介，并且排除了橘蚜ToxopteracitricidusKirkaldy、橘二叉蚜ToxopteraaurantiiKoch、橘全爪螨PanonychuscitriMcGregor、黃蜘蛛EotetranychuskankitusEhara傳病的可能(廣西柑桔黃龍病研究小組，1977；華南農(nóng)學(xué)院植保系植病教研組，1977)。盡管柚喀木虱CacopsyllacitrisugaYang & Li也被證實(shí)是黃龍病亞洲種的傳播媒介，但僅分布于我國西南高海拔地區(qū)(Cenetal.，2012b；郭俊等，2012；周汶靜等，2012)，亞洲柑橘木虱在絕大多數(shù)柑橘產(chǎn)區(qū)是黃龍病唯一的媒介昆蟲。

2 柑橘木虱對(duì)黃龍病菌的傳播機(jī)制

2.1 獲菌與傳病的效率

黃龍病3個(gè)亞種中，亞洲種CLas的分布最廣、為害最大，其田間自然媒介為亞洲柑橘木虱，柑橘木虱成蟲和2～5齡若蟲都能獲菌，1齡若蟲尚未檢測出病菌(Hungetal.，2004)。木虱的獲菌時(shí)間很短，在韌皮部刺吸1 h后就可以檢測出病菌的存在(Bonani，2008)，獲菌率與植株感染CLas的水平呈正相關(guān)(余繼華等，2017)，實(shí)驗(yàn)室條件下，若蟲的獲菌效率高于成蟲，木虱在黃龍病病樹上取食5周后，若蟲的獲菌率是60%～100%，而成蟲的獲菌率僅達(dá)到40%，但田間觀察到若蟲和成蟲的獲菌率較為相似(Pelz-Stelinskietal.，2010)；在若蟲獲菌后的14～28 d內(nèi)，體內(nèi)的黃龍病菌濃度會(huì)達(dá)到峰值，而成蟲達(dá)到峰值的時(shí)間21～35 d，這可能是由于若蟲和成蟲的免疫程度不同導(dǎo)致的(Ammaretal.，2016)。同時(shí)，木虱的取食時(shí)間越長，獲菌率就越高，這可能與植物獲取CLas的時(shí)間有關(guān)(Pelz-Stelinskietal.，2010；Coy and Stelinski，2015)。獲菌率還受植物成熟度的影響，健康木虱成蟲在病樹成熟葉、嫩葉、嫩芽取食8 h后獲菌率分別達(dá)55%、40%、35%(Luoetal.，2015)。

木虱獲菌之后，體內(nèi)的病菌到達(dá)一定閾值(106)并經(jīng)過體內(nèi)的偱回期后，帶菌木虱在健康的植株上取食5 h以上就可傳病(許長藩，1988；Ukuda-Hosokawaetal.，2015)。單頭木虱的傳病效率并不高(Halletal.，2013)，在木虱接種一年后，由單頭木虱成功傳病的比例在4%～10%之間，而由100或100頭以上的木虱傳病率大約在88%(Pelz-Stelinskietal.，2010)。黃金萍等(2015)發(fā)現(xiàn)木虱取食嫩梢、成熟葉和老葉24 h后的獲菌效率存在差異，在馬水橘FortunellamargaritaLour.病苗上成熟葉的獲菌效率最高，達(dá)到66.67%，其次為嫩梢(33.33%)，最后為老葉(10%)；而在酸橘C.sunkiHort. ex Tanaka病苗上，獲菌效率為老葉(60%)>成熟葉(43.33%)>嫩梢(6.67%)，并且兩個(gè)品質(zhì)整株的獲菌效率相同，均為36.67%，作者分析存在這種差異的原因可能是受病原菌的分布以及木虱取食行為的影響。木虱的傳病效率受多方面的影響，包括植物防御、環(huán)境條件、攝食期以及木虱本身在防疫能力方面的遺傳差異等等(Halletal.，2013；Coletta-Filhoetal.，2014；Lopesetal.，2014)。在若蟲期獲菌的木虱在羽化后依舊帶菌，并且終身攜菌傳病(許長藩等，1988；Hungetal.，2004)。木虱的產(chǎn)卵和交配行為也會(huì)造成黃龍病菌的傳播，病原菌通過卵傳遞給子代的比例約為2%～6%(Pelz-Stelinskietal.，2010)，交配行為也可以傳病，但傳病率非常低，Mannetal.(2011)的研究表明，帶病的雄蟲通過交配傳病給雌蟲的比例小于4%，而帶病的雌蟲與未受感染的雄蟲交配后不會(huì)傳病，這一結(jié)果提供了黃龍病性水平傳播的證據(jù)，即使在沒有病樹的情況下，病菌也可以在種群傳播。

2.2 病菌在木虱體內(nèi)的分布

柑橘木虱感染黃龍病之后，病菌可分布在木虱體內(nèi)的各個(gè)器官和組織，包括唾液腺、血淋巴、濾腔、中腸、脂肪和肌肉組織、卵巢等(Ammaretal.，2011)，但是各個(gè)組織的感染水平和感染率差異顯著，相較于其他組織器官，唾液腺和消化道感染黃龍病菌的幾率非常低，但感染后病菌的相對(duì)含量顯著升高(Ammaretal.，2011)；帶菌木虱體內(nèi)的中腸細(xì)胞和唾液腺外皮層的含菌量最高(許長藩等，1985；Yasudaetal.，2005)。而成蟲和若蟲的分布也是不同的，通過RT-qPCR技術(shù)可以檢測到2～5齡若蟲體內(nèi)存在黃龍病病菌，并且隨著齡期的增大而不斷增多，病菌在4齡、5齡的若蟲體內(nèi)主要分布在U型含菌體內(nèi)，這一點(diǎn)與雌雄成蟲的散布型分布不同(任素麗等，2018)。CLas在木虱種群內(nèi)呈現(xiàn)周年動(dòng)態(tài)變化，余繼華等(2017)通過測定田間木虱的周年帶菌量，發(fā)現(xiàn)柑橘木虱在12月至翌年1月之間的平均帶菌量最高。木虱一旦獲菌之后會(huì)終身帶菌，但是有研究指出，如果木虱在若蟲期獲菌，并且不從其他受感染的植物中不斷地重新獲得病原體，其病原體滴度會(huì)隨著時(shí)間的推移而下降(Pelz-Stelinskietal.，2010)。

2.3 病菌在木虱體內(nèi)的偱回機(jī)制

黃龍病菌以增殖型體內(nèi)循環(huán)式傳播，即在媒介昆蟲體內(nèi)循環(huán)、擴(kuò)散以及增殖，一旦獲菌，即具有長久性傳播的能力(許長藩等，1988；Hungetal.，2004)。黃龍病菌在柑橘木虱體內(nèi)循環(huán)、擴(kuò)散和規(guī)避免疫系統(tǒng)的機(jī)制已經(jīng)非常成熟，借助于這些機(jī)制在木虱體內(nèi)進(jìn)行傳播擴(kuò)散。木虱取食帶病植株后，黃龍病菌先通過口針進(jìn)入腸道，隨后在中腸上皮細(xì)胞快速繁殖，之后進(jìn)入血腔內(nèi)繼續(xù)增殖，然后逐漸轉(zhuǎn)移至其他組織，最終進(jìn)入唾液腺，此時(shí)木虱便具有了傳播黃龍病菌的能力(許長藩，1985)。

這一跨膜擴(kuò)散過程涉及許多效應(yīng)因子的參與，許多革蘭氏陰性菌表面蛋白與柑橘木虱體內(nèi)中腸、唾液腺或者其他組織中的受體都存在特異性相互作用(Ammaretal.，2011)。病菌通過受體和配體間的相互識(shí)別作用附著在昆蟲細(xì)胞表面，之后利用胞吞進(jìn)入細(xì)胞，并逐步穿過細(xì)胞進(jìn)入血淋巴、卵巢和唾液腺等組織器官(Wang and Killiny，2014)。

Capooretal.(1974)認(rèn)為偱回期為8～12 d；黃炳超等(1985)年通過木虱飼毒傳毒實(shí)驗(yàn)初步確定體內(nèi)偱回期大約為21～30 d；許長藩(1985)等指出，黃龍病菌在木虱體內(nèi)偱回期時(shí)長不一，短期為3 d或少于3 d，長的為26～27 d；這些結(jié)果不一可能是由于實(shí)驗(yàn)的柑橘品種或環(huán)境條件差異導(dǎo)致的。

3 黃龍病菌與柑橘木虱互作研究進(jìn)展

3.1 CLas對(duì)木虱產(chǎn)生的影響

黃龍病菌入侵木虱體內(nèi)后，會(huì)對(duì)木虱產(chǎn)生多方面的影響。在生理方面，用刺吸電位圖譜技術(shù)(EPG)監(jiān)測木虱在病苗和健康苗的取食行為發(fā)現(xiàn)，在病苗上取食的木虱成蟲分泌唾液時(shí)間顯著延長(Cenetal.，2012a)；在代謝方面，CLas對(duì)若蟲和成蟲的影響不盡相同，感染CLas的若蟲比成蟲的部分代謝產(chǎn)物含量更高，特別是TCA循環(huán)，C16和C18脂肪酸，葡萄糖，蔗糖和肌醇(Killiny and Jones，2018)，這可能是由于若蟲生長期間的攝食率產(chǎn)生變化或者是黃龍病植物韌皮部汁液質(zhì)量發(fā)生了改變而造成的，具體機(jī)制尚不明確；在免疫方面，感染黃龍病菌的木虱比健康木虱更容易受到白僵菌、綠僵菌和玫煙色棒束孢的侵染(Orduo-Cruzetal.，2016)。并且，黃龍病菌會(huì)誘導(dǎo)木虱中腸細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡和DNA的降解，這也被認(rèn)為是木虱的一種保護(hù)性免疫措施，主動(dòng)出現(xiàn)中腸細(xì)胞的壞死，防止病菌進(jìn)一步擴(kuò)散到血淋巴中(Ghanimetal.，2016)。另外，CLas對(duì)木虱的感染也會(huì)致使木虱對(duì)殺蟲劑的敏感性上升，Tiwarietal.(2011a)發(fā)現(xiàn)感病的柑橘木虱對(duì)毒死蜱和乙基多殺菌的LC50明顯低于未感病的柑橘木虱，而其它3種殺蟲劑(西維因、甲氰菊酯和吡蟲啉)沒有顯著性差異。Tiwarietal.(2011b)隨后的研究證實(shí)了感病木虱的細(xì)胞色素p450氧化酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶明顯低于未感病木虱。這可能是由于黃龍病菌的感染改變了柑橘木虱體內(nèi)的一些生理機(jī)制，導(dǎo)致了酶活的改變，進(jìn)一步增加了柑橘木虱對(duì)殺蟲劑的敏感性(Tiwarietal.，2011b)。

黃龍病菌在進(jìn)入木虱體內(nèi)后，通過調(diào)控生物膜的形成、免疫防御、細(xì)胞黏著等相關(guān)的多種相關(guān)機(jī)制和蛋白質(zhì)表達(dá)等，以減小病菌在木虱體內(nèi)擴(kuò)散和循環(huán)的障礙。其中，木虱感染黃龍病菌引起包括網(wǎng)格蛋白、黏著斑蛋白以及踝蛋白在內(nèi)的一系列蛋白基因表達(dá)水平減弱，影響生物膜合成、擴(kuò)散通道的愈合以及受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用，直接加快病菌在木虱體內(nèi)循環(huán)和擴(kuò)散(Vyasetal.，2015)。并且黃龍病菌使得柑橘木虱若蟲體內(nèi)蛋白酶及其轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物的基因表達(dá)水平下調(diào)，使得免疫系統(tǒng)合成與釋放與免疫相關(guān)的蛋白酶的能力下降，黃龍病菌得以繼續(xù)在木虱體內(nèi)繁殖(Tiwarietal.，2011c)，Gilletal.(2017)使用納米LC-MS / MS檢測比較了感染與未受感染木虱的血淋巴組份，發(fā)現(xiàn)被感染的木虱血淋巴中缺失大量的免疫防御相關(guān)蛋白。

曾麗霞等(2018)通過分析感染黃龍病菌柑橘木虱的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中表達(dá)差異最高的基因?yàn)榧?xì)胞壁水解酶。細(xì)胞壁水解酶對(duì)細(xì)胞壁的生長、細(xì)菌的形態(tài)形成和細(xì)胞分裂增殖有重要作用(Leeetal.，2013)，因此在CLas感染的木虱體內(nèi)高表達(dá)的細(xì)胞壁水解酶，可以促進(jìn)病菌在木虱體內(nèi)的增殖與傳播，此外CLas入侵后將Toll途徑相關(guān)的基因下調(diào)，以此來抑制木虱的免疫反應(yīng)，從而加快病菌的擴(kuò)散。

3.2 CLas對(duì)木虱共生菌的影響

內(nèi)生菌廣泛分布于昆蟲體內(nèi)，幾乎所有的昆蟲都有內(nèi)共生菌(譚周進(jìn)等，2005)。李翌菡(2016)對(duì)國內(nèi)7個(gè)地區(qū)的木虱進(jìn)行分析，所有柑橘木虱均含有原生共生菌CandidatusCarsonella(100%)，次生共生菌CandidatusProfftella感染率為(95.85%)。馬曉芳(2014)分析木虱的優(yōu)勢共生菌為α-proteobacteria，Wolbachiaspp，CandidatusCarsonella ruddii，CandidatusProteobacteria armatura。

CLas侵染木虱后可能會(huì)引起木虱體內(nèi)共生菌種群的變化。沃爾巴克氏體屬Wolbachia、腸桿菌屬Enterobactersp.菌的含量與CLas呈明顯的正相關(guān)(Fagenetal.，2012；孫麗琴等，2014)，有研究指出這是可能是因?yàn)槲譅柊涂耸象w屬提供了黃龍病在木虱體內(nèi)所缺少的有關(guān)發(fā)育和繁殖必需的營養(yǎng)物質(zhì)的前體物質(zhì)(Duanetal.，2009；Sahaetal.，2012)，但腸桿菌屬與黃龍病菌之間的互作機(jī)制尚不明確，推測有可能是因?yàn)槟c桿菌屬改善了黃龍病菌的生長環(huán)境所導(dǎo)致(宋揚(yáng)，2016)，這仍需要進(jìn)一步明確。

4 柑橘木虱、黃龍病原菌與寄主植物互作關(guān)系

柑橘木虱、CLas和寄主植物之間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，當(dāng)宿主植株感染黃龍病菌后，能夠改變植株體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，F(xiàn)anetal.(2010)通過比較感病與健康的甜橙中碳水化合物代謝的變化，與健康葉片相比，感病葉片中淀粉水平增加7.9倍，中脈和葉片中的蔗糖、果糖和葡萄糖積累水平顯著增加，其中葡萄糖積累水平大于5倍，相反地，麥芽糖含量降至健康葉片的49.6%?？赡苷怯捎谶@些變化，導(dǎo)致木虱選擇或取食行為的變化，促進(jìn)病菌的傳播與擴(kuò)散(Mannetal.，2010；Zhaoetal.，2013；Luoetal.，2015)。寄主植物是否感病對(duì)木虱的世代發(fā)育也存在一定的影響，在感病植株上，木虱的生長發(fā)育歷期變短、產(chǎn)卵量增加，同時(shí)存活率降低；而在健康植株上，感病木虱相較于健康木虱，雖然生長發(fā)育歷期變短，但壽命和存活率的差異不大(Renetal.，2016)，并且在感病植株上成長的雌性成蟲的繁殖力與壽命都顯著增高(PelzStelinski and Killiny，2016)；Wuetal.(2018)的實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)論，在感染黃龍病柑橘上飼養(yǎng)木虱的卵、1齡和2齡若蟲的發(fā)育歷期和成蟲壽命縮短，并且分析這可能是因?yàn)镃Las影響了木虱本身某些酶的活性有關(guān)。

研究表明，在帶病植株和健康植株之間，柑橘木虱會(huì)于優(yōu)先取食帶病植株(Mannetal.，2012)，但是取食過帶病植株的木虱又會(huì)再一次的趨向于未被感染的健康植株(Halletal.，2013)，這可能是由于嫩梢揮發(fā)物成分不同所導(dǎo)致，Mannetal.(2012)表明感染黃龍病的柑橘會(huì)釋放一種特殊的化學(xué)物質(zhì)—水楊酸甲酯，吸引柑橘木虱趨向被感染的植株；楊玉枝等(2015)通過分析健康和黃龍病沙糖橘嫩梢揮發(fā)物成分，發(fā)現(xiàn)帶病砂糖橘嫩梢釋放的揮發(fā)性物中，含量最高的是β-水芹烯，并且該物質(zhì)在木虱嗜食的九里香釋放的揮發(fā)物中含量也是最高的，這說明β-水芹烯可能對(duì)木虱具有吸引活性，并且，經(jīng)過木虱的取食，會(huì)誘導(dǎo)植株產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，其中就包括水楊酸甲酯(Mannetal.，2012)，進(jìn)一步促進(jìn)增加木虱的取食，進(jìn)而加速黃龍病的流行。木虱在取食植株后，自身會(huì)排出白色蜜露，取食感染黃龍病植株的木虱相較于健康植株的木虱，排出蜜露中的葡萄糖、肌醇以及松二糖的含量都顯著降低，這可能與CLas在木虱體內(nèi)的代謝和營養(yǎng)需求有關(guān)(Hijazetal.，2016)。

除此之外，植株嫩梢的成熟程度也會(huì)影響木虱取食，在帶病和健康柑橘嫩梢之間，木虱首先趨向于選擇帶病嫩梢，并且停留時(shí)時(shí)間較長；在沒有嫩梢的情況下，會(huì)先選擇帶病成熟葉片，但38 h之后會(huì)轉(zhuǎn)向健康成熟葉片，這可能是由于帶病植株?duì)I養(yǎng)不佳所導(dǎo)致的(Wuetal.，2015)。綜上所述，帶黃龍病柑橘對(duì)媒介昆蟲柑橘木虱的吸引作用增強(qiáng)，而其營養(yǎng)成分等條件的改變促使木虱從染病寄主向健康寄主轉(zhuǎn)移，從而有利于病原菌的擴(kuò)散與傳播。

5 展望

柑橘是世界上最重要的果樹，黃龍病作為柑橘產(chǎn)業(yè)的“頭號(hào)殺手”，其防控任重而道遠(yuǎn)。現(xiàn)階段，有關(guān)柑橘木虱的生物學(xué)特性已基本被掌握，但由于黃龍病菌還不能體外培養(yǎng)，導(dǎo)致部分研究存在一定的困難。黃龍病的傳播是黃龍病菌、寄主植物、蟲媒以及體內(nèi)共生菌相互作用的一個(gè)復(fù)雜過程，日后的研究應(yīng)當(dāng)將這幾個(gè)元素作為一個(gè)整體進(jìn)行，綜合分析研究這幾者之間的互作機(jī)理，為探索黃龍病防控新途徑奠定基礎(chǔ)。