肌源性干細胞造血分化的研究進展

韓遠豪 杜亞格 竇昊穎 王曉玲 汪濤

白血病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤和骨髓增生異常綜合征等惡性血液病具有發(fā)病率高、治療難度大和預后較差等特點，一直威脅著人類的生命和健康[1]。長期以來，臨床上對于惡性血液病的治療主要以化學治療、激素治療、免疫抑制劑治療以及使用富含造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的骨髓移植等為主要治療手段。但化療藥物、免疫抑制劑等緩解疾病發(fā)展的同時也會造成嚴重的不良反應，如嘔吐、毛發(fā)脫落、食欲缺乏、手腳麻木、免疫力降低等。骨髓移植作為根治惡性血液病的唯一方法，尋找與患者配型相同的骨髓費時費力，花費昂貴，且其中所含干細胞數(shù)量有限，大大限制了其在臨床的廣泛應用，成為血液病治療中的難題。肌源性干細胞(MDSCs)是一種來源于骨骼肌中具有自我更新、多向分化潛能的成體干細胞，在無誘導因素作用下可定向分化為骨骼肌細胞，在特定條件下不僅能分化為中胚層細胞類型，如成肌細胞、成骨細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞和造血譜系，還可以打破胚層的限制分化為外胚層和內(nèi)胚層的細胞類型[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs能夠表達HSCs的標志物Sca-1和CD34，在造血微環(huán)境下可以促進造血重建，通過移植到小鼠內(nèi)產(chǎn)生的造血活性要強于骨髓移植，且MDSCs系自體來源，具有取材容易、利于體外培養(yǎng)擴增、免疫原性低等優(yōu)點，因此將成為重建造血最有希望的種子細胞來源之一[4-6]。本文將對近年來課題組關于MDSCs造血分化過程中機制的研究現(xiàn)狀、存在的問題以及應用前景進行綜述。

1 MDSCs的概述

1.1 MDSCs的分離 MDSCs可來源于骨骼肌、心肌和平滑肌[7]。但目前文獻中報道較多的方法均采用來自骨骼肌的組織進行分離培養(yǎng)。從解剖學的角度來看，肌肉中存在兩種類型的干細胞，其中位于肌纖維基板和質膜之間的是衛(wèi)星細胞(也稱為肌肉干細胞)，可以與受損的肌原纖維融合，再生肌纖維。另一種細胞是MDSCs，它不位于衛(wèi)星細胞壁龕中，在適當?shù)臈l件下可以定向分化為不同的細胞譜系[8,9]。這在其他研究中也得到了證實，例如，Jackson等[10]在1999年從小鼠的骨骼肌中分離出一種干細胞，它與衛(wèi)星細胞明顯不同且表達造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)的表面標志Sca-1和c-Kit，通過將培養(yǎng)的干細胞移植入受致死劑量輻照的受者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的造血活性是整個骨髓的10～14倍，具有強大的造血分化能力，這說明衛(wèi)星細胞與MDSCs是兩種不同的細胞。

目前大多數(shù)獲取MDSCs的方法都涉及肌肉活檢。例如利用小鼠的骨骼肌分離MDSCs，取4～5日齡的乳鼠，分離骨骼肌，剔除脂肪、筋膜、神經(jīng)和血管等，通過機械剪切方式將骨骼肌剪碎，后采用膠原酶和胰蛋白酶等分步消化，可使80%～90%的MDSCs從肌肉組織的不同解剖位置釋放出來[11-13]。但是，在使用酶消化法分離MDSCs時，應嚴格掌握酶消化的時間，消化時間過長會導致MDSCs的過度消化，影響其生長狀態(tài)，若消化時間過短，則無法充分分解蛋白，會使獲得的MDSCs數(shù)量減少[14]。酶消化法的另一個缺點是對組織有較大的破壞性，會影響細胞的增殖與分化活性[7]。文獻表明，目前最常用于分離MDSCs的方法是preplate技術[15]，但是此方法在應用過程中較復雜和耗時。因此，Xu等[16]對preplate技術進行了改良，以開發(fā)一種更有效的獲取和培養(yǎng)MDSCs的方法。在結合了多步酶消化法和preplate技術的基礎上，還改良了培養(yǎng)基和培養(yǎng)器具，結果顯示，改良方法可顯著縮短MDSCs的分離過程，是一種快速、有效的從小鼠骨骼肌中分離和純化MDSCs的方法。

1.2 MDSCs的純化 由于肌肉組織中含有的MDSCs較少，酶消化法分離獲得的MDSCs中?；煊醒軆?nèi)皮細胞、血細胞和成纖維細胞等，并非單純的MDSCs，因此，建立一種高效的MDSCs純化方法尤為必要，也是當前研究中需要克服的難題之一。目前MDSCs的純化方法包括差速貼壁法，密度梯度離心法、流式細胞術和免疫磁珠法。流式細胞術雖然能獲得高純度的MDSCs，但因其實驗要求過高，且成本昂貴，因此并不作為首選方法。目前最常用的方法是根據(jù)MDSCs的物理特性，即差速貼壁法進行MDSCs純化[7]。

差速貼壁法的原理是，非MDSCs成分貼壁能力較MDSCs強，貼壁時間較短。利用此特點通過預貼壁和轉瓶換液的方式將未貼壁的MDSCs細胞懸液移至新瓶，重復操作即可完成MDSCs的純化。此方法的優(yōu)勢是獲得細胞的純度可高達90%，且對細胞的損傷較小，缺點是操作步驟較繁瑣，細胞污染的概率增加[2]。丁維進等[17]利用改良的差速貼壁法從3～5日齡的C57小鼠骨骼肌中分離純化得到了高純度的MDSCs，且MDSCs可以保持較好的細胞形態(tài)的增殖能力，這表明差速貼壁法是一種高效的MDSCs純化技術。

較為理想的純化方法是根據(jù)細胞表面的特異性標志物進行篩選。磁珠分選法是近年來新興起的一種細胞篩選技術，應用抗原-抗體反應的原理對具有特定標記的細胞進行分選，實驗操作簡單，獲得目標細胞純度高且不會破壞細胞活力。但目前尚未發(fā)現(xiàn)MDSCs的特異性標志物，HSCs標志物Sca-1是目前公認的MDSCs標志物[18,19]。本課題組劉志強等[20]利用磁珠篩選法獲得純度超過90%的Sca-1+MDSCs，且保持了一定的細胞活力。不足的是，篩選后獲得的細胞數(shù)量，可能是在實驗過程中損失了部分細胞。因此，在今后的研究中，不斷完善MDSCs的純化過程，提高純化效率依然是我們科研工作者的重要任務。

1.3 MDSCs與HSCs的關系 MDSCs與HSCs有著密切的關系，在細胞來源、增殖分化以及蛋白表達方面有著異同點。二者同屬于干細胞范疇，具有干細胞自我更新、高度增殖、多向分化的潛能。MDSCs主要存在于骨骼肌組織，但也可從平滑肌中分離獲取。HSCs是各類血細胞的始祖細胞，存在于骨髓之中。當機體需要時，其中一部分分化為成熟血細胞，另一部分進行分裂增殖，以維持HSCs的數(shù)量相對穩(wěn)定，維系著造血系統(tǒng)的動態(tài)平衡[21]。而MDSCs與HSCs的增殖分化方式有著相似之處，經(jīng)激活之后其中一個子細胞分化成肌管細胞，另一個則通過復制形成新的MDSCs[22]。此外，在目前的研究中，二者共同表達的蛋白包括CD34，CD45，Sca-1等，不同的是，HSCs表達c-kit、Try1、Ly6G、CD3、CD4、CD5等成熟造血細胞標志物，而MDSCs則表達desmin、MyoD等肌源性標志物[23]。因此，明確MDSCs與HSCs之間存在的關聯(lián)對于今后的實驗研究及臨床應用至關重要。

2 MDSCs的造血分化

2.1 造血微環(huán)境在造血過程中的重要作用 造血微環(huán)境又稱為造血細胞龕(niche)，根據(jù)位置和功能的不同將其分為兩大類，即骨內(nèi)膜微環(huán)境和血管微環(huán)境。造血微環(huán)境主要是由骨髓中鄰近HSCs的支持細胞構成，包括成骨細胞、內(nèi)皮細胞、CAR細胞、nestin+細胞、破骨細胞、巨噬細胞和施萬細胞等[24]。這些細胞對維持HSCs的自我更新及增殖分化起著關鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，造血微環(huán)境中的多種骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)在正常生理狀態(tài)下主要通過分泌細胞因子、白介素或其他活性物質等調控造血干/祖細胞的增殖、分化和發(fā)育，例如干細胞生長因子(SCF)[25]。Ding等[26]利用基因敲除技術在各BMSCs中特異性敲除SCF，結果發(fā)現(xiàn)當敲除內(nèi)皮細胞中SCF時骨髓內(nèi)HSCs數(shù)量下降明顯，不僅證明了SCF對HSCs增殖分化的重要性，同時也提供了內(nèi)皮細胞作為SCF主要來源的證據(jù)。此外，趨化因子12(CXCL12)是也造血過程中一種必不可少的細胞因子，而富含CXCL12的網(wǎng)狀細胞(CXCL12 abundant reticular cell，CAR細胞)則是構成造血細胞龕的重要組成細胞，在整個造血活動中扮演著重要角色[27]。

此外，造血微環(huán)境中還存在著多種信號通路，如Wnt信號通路，Notch信號通路，BMP/TGF-β信號通路以及JAK2-STAT5信號通路等。這些信號通路與BMSCs共同參與HSCs的自我更新和定向分化，維持造血微環(huán)境的穩(wěn)定。一旦造血微環(huán)境紊亂，就會引發(fā)諸如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征甚至是白血病等惡性血液病[28]，因此，造血微環(huán)境的穩(wěn)定對HSCs的增殖分化至關重要，明確造血微環(huán)境的細胞組成和分子機制對于了解血液病發(fā)病機制和臨床治療有重要意義。

2.2 BMSCs對MDSCs的造血分化的誘導作用 成骨細胞是構成骨內(nèi)膜微環(huán)境的主要組成細胞。Calvi等[29]應用甲狀旁腺激素相關肽(parathyroid hormone related peptide，PTHrP)刺激經(jīng)基因改造產(chǎn)生成骨細胞特異性活化的PTH/PTHrP受體(PPRs)4的小鼠，結果顯示成骨細胞的數(shù)目增加，而HSCs的數(shù)目也隨之增加。Galán-Díez等[30]發(fā)現(xiàn)成骨細胞已成為HSCs增殖的有效調節(jié)細胞，既可以調節(jié)HSCs的募集，又可根據(jù)其分化階段，沿著淋巴系、髓系和紅細胞系增殖分化。此外，成熟成骨細胞突變還可誘發(fā)髓系惡性腫瘤。表明了成骨細胞對HSCs具有一定的調節(jié)作用。

內(nèi)皮細胞是血管微環(huán)境的主要組成細胞。張瀅等[31]通過輸注內(nèi)皮祖細胞(EPC)聯(lián)合小鼠異基因骨髓移植(allo-BMT)，觀察經(jīng)60Co照射后小鼠骨髓內(nèi)皮細胞(EC)的修復情況,并進一步觀察其對造血重建的影響。免疫組化及血液指標檢測的結果表明，EPC輸注聯(lián)合allo-BMT組骨髓內(nèi)皮細胞的修復及造血功能的恢復情況要好于單獨移植組，表明了內(nèi)皮細胞對維持造血微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。

而MDSCs在造血分化過程中同樣受到BMSCs的影響。本課題組王曉玲等[32]通過模擬體外造血微環(huán)境，探討經(jīng)典藥方當歸補血湯于造血微環(huán)境中對MDSCs造血分化的影響，首先將培養(yǎng)3 d的MDSCs進行當歸補血湯載藥血清和經(jīng)當歸補血湯干預后的BMSCs條件培養(yǎng)基干預，然后鑒定肌源性的標志蛋白desmin，并進行抗CD45的免疫組化染色與圖像分析。實驗結果顯示，相對原始的MDSCs其CD45表達的量要多，而隨著細胞分化成熟，desmin表達的量增多，CD45表達的量開始減少，呈下降趨勢。并且以含當歸補血湯載藥血清和BMSCs的培養(yǎng)基培養(yǎng)的MDSCs，CD45表達量要高于正常血清組及單純載藥血清干預組。而CD45是目前造血細胞生長發(fā)育、活化及凋亡過程中起重要調控作用且具有相對特異性的造血細胞標志物，這表明BMSCs對MDSCs的造血分化起促進作用，且在中藥干預下，隨劑量的增加MDSCs向造血分化的現(xiàn)象更加明顯。此外，課題組劉志強等[33]為探究BMSCs對MDSCs體外造血分化的影響，利用混合酶消化聯(lián)合磁珠分選法分離出更加純化的MDSCs，通過Transwell小室將BMSCs和MDSCs進行共培養(yǎng)，模擬造血微環(huán)境，并通過Western Blot方法檢測造血細胞標志物CD34和CD45的表達含量。實驗數(shù)據(jù)顯示共培養(yǎng)體系中MDSCs的CD34和CD45表達量要明顯高于MDSCs單獨培養(yǎng)組。另外，當MDSCs單獨培養(yǎng)時細胞呈梭形和紡錘形，并逐漸融合，形成多核肌管。而共培養(yǎng)組除少量貼壁細胞呈梭形或菱形外，還出現(xiàn)大量懸浮的小圓型細胞，表現(xiàn)出克隆性生長的特點。這表明MDSCs在無誘導條件下易向成肌方向分化。而在造血微環(huán)境中，MDSCs表現(xiàn)出造血特性，從而說明了BMSCs對MDSCs的造血分化具有誘導作用，但其中的具體機制尚未明顯，仍需要在今后的實驗中不斷探索。

2.3 信號通路對MDSCs造血分化的調控作用 在醫(yī)學科學技術日益發(fā)達的今天，對各類疾病發(fā)生發(fā)展的過程及臨床診療過程中存在的機制研究已經(jīng)成為眾多醫(yī)學科研工作者研究的方向，其中信號通路的研究則是當下的熱門。而HSCs的生長發(fā)育、自我更新及分化過程不僅需要造血微環(huán)境中BMSCs和細胞因子的干預，還需要依靠多種信號通路的調控作用以達到穩(wěn)態(tài)。

研究表明，Notch信號通路在HSCs中高度活化，而分化之后如在成熟的血細胞和外周淋巴器官中很少被檢測到，并且在骨髓和外周血中也檢測到Notch信號通路的活性在造血分化時下調。此外，當阻斷Notch信號時可以發(fā)現(xiàn)體外HSCs分化加速且體內(nèi)的干細胞數(shù)量減少[34]。Wnt信號通路中經(jīng)典的Wnt3a/β-catenin的激活有利于保持HSCs的活性、自我更新與增殖分化能力；而如果抑制非經(jīng)典Wnt信號通路的Wnt5a，則可通過進一步抑制細胞內(nèi)Cdc42等其他分子的活性蛋白活化等，并間接激活經(jīng)典的Wnt3a/β-catenin，共同減緩HSCs的衰老，維持其年輕態(tài)[35]。轉化生長因子β(TGF-β)信號通路由一類可以調節(jié)細胞生長和分化的多肽生長因子亞家族組成，這些家族成員的結構、功能具有一定的相關性，主要包括TGF-β、激活素、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等。在造血方面，TGF-β具有重要的負性調控作用，尤其是維持HSCs的靜息和自我更新，一旦TGF-β表達及受體水平缺陷都可以導致造血細胞的惡性增殖，從而引發(fā)惡性血液腫瘤[36]。劉俊志等[37]發(fā)現(xiàn)激活Janus激酶2-信號傳導子與轉錄激活子5(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK2-STAT5)信號通路可以促進造血生長因子白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)等的表達，從而促進造血細胞的增殖和分化，證明了JAK2-STAT5 信號通路在造血過程中也發(fā)揮了重要作用。

此外，Hedgehog、Tie2/Ang-1等信號通路也是維持HSCs正常發(fā)育和分化的重要調控因子?？傊?，在造血微環(huán)境中存在著大量的信號通路，他們共同維系著HSCs的穩(wěn)定。而在過去幾年的研究中，本課題組主要對MDSCs造血分化過程中Wnt和Notch兩條信號通路的調控作用進行了初步研究。

2.3.1 Notch信號通路:Notch信號通路是一條高度保守的信號通路，影響著細胞正常形態(tài)發(fā)生的多個過程。它是一種膜蛋白受體，由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)及細胞內(nèi)效應器分子(CSL-DNA結合蛋白)三部分組成。在哺乳動物體內(nèi)主要有Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4 五種配體，Notch1～Notch4四種受體以及CBF1/RBP-Jκ轉錄因子。Notch信號的產(chǎn)生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過連續(xù)水解，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合,形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活HES等基因表達，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡。早在20世紀90年代，Notch信號通路的受體就在造血細胞中發(fā)現(xiàn)，且在調控造血細胞的增殖、分化和凋亡中扮演著重要的角色[38]。當Notch信號通路被阻斷時，HSCs的分化率升高，從而影響了HSCs的未分化狀態(tài)，提示活化Notch信號通路能抑制HSCs分化，維持其多向分化的潛能性，并進一步促進其增殖[39]。宋波等[40]運用Notch信號通路阻斷劑DAPT阻斷其激活，發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESCs)易于分化為造血干細胞/祖細胞(HSCs/HPCs)，且當與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)協(xié)同使用時，該現(xiàn)象更加明顯，證明了Notch信號通路在VEGF促ESCs分化為HSCs/HPCs中起抑制作用。

MDSCs在造血分化過程中同樣受到Notch信號通路的調控作用。本課題組竇昊穎等[11-13]以不同劑量的當歸補血湯對小鼠進行預處理，又通過尾靜脈注射的方式將MDSCs移植到受致死劑量照射的動物模型中，研究在小鼠造血重建過程中Notch信號通路關鍵基因的表達情況，以及當歸補血湯和MDSCs對造血重建的影響。實驗結果表明，在小鼠的骨髓細胞中，Notch2、Notch3和 Notch4受體與Delta4配體受體在MDSCs向造血方向分化、增殖的過程中發(fā)揮著不同作用。其中，MDSCs 移植鼠骨髓中Notch2、Notch4和Delta4的mRNA的表達增加，Notch3的mRNA的表達減少。當加入當歸補血湯時，可以促進Notch2、Notch3和Delta4的表達，但對Notch4的作用不顯著。而Jagged2配體和Hes3靶基因既不參與HSCs向造血前體細胞分化過程，也不參與MDSCs向HSCs增殖、分化過程。而結果還表明，使用5倍劑量的當歸補血湯協(xié)同MDSCs對造血重建的恢復效果最佳。此外，脾臟B淋巴細胞是由HSCs分化而來。他們發(fā)現(xiàn)，在小鼠脾臟細胞中，MDSCs 移植早期，B淋巴細胞的分化發(fā)育過程中未見Notch2和Jagged2的參與，但在MDSCs 移植晚期，Jagged2的mRNA的表達增加，對B淋巴細胞的發(fā)育過程起到了調控作用。而當使用3倍劑量的當歸補血湯時可在MDSCs移植早期通過調控Notch2和Jagged2進而促進B淋巴細胞的發(fā)育。

這些研究結果均證實了Notch信號通路在MDSCs向造血方向分化的過程中發(fā)揮了重要的調控作用，而且通過經(jīng)典名方當歸補血湯進行干預可以促進其增殖和分化，為MDSCs的造血分化研究提供了重要的理論參考和新的研究思路。雖然課題組初步發(fā)現(xiàn)了Notch信號通路在MDSCs造血分化過程中的調控作用，但是MDSCs向造血方向分化具體的調控機制以及MDSCs移植入小鼠體內(nèi)其歸巢與轉歸機制仍不明晰，尚待進一步深入探究。

2.3.2 Wnt信號通路:Wnt信號傳導途徑是由配體蛋白質Wnt和膜蛋白受體結合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉導途徑，廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、干細胞自我更新和分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過程中，具有至關重要的作用。Wnt信號通路主要分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路、非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號通路。經(jīng)典 Wnt/β-catenin信號通路由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受體蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)及TCF/LEF家族轉錄調節(jié)因子等構成。當Wnt分泌蛋白與Frizzled受體蛋白發(fā)生結合時，Wnt信號通路的靶基因激活，開始表達。研究表明，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路可以上調造血細胞生成的關鍵轉錄因子和必需的特異性標志物，也能促進造血多潛能祖細胞的形成[41,42]。而非經(jīng)典的Wnt/Ca2+信號通路也參與了HSCs的增殖和分化，并可能是通過與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路的相互作用共同維持造血的動態(tài)平衡。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在MDSCs的分化中扮演著重要角色，參與調控MDSCs的多向分化，在造血發(fā)生和重建的過程中必不可少，而Wnt3、Wnt3a、Wnt5a和Wnt10b等是其中重要的造血基因[43,44]。課題組王麗帆等[45]構建MDSCs與BMSCs共培養(yǎng)體系，以當歸補血湯載藥血清進行干預，并分別加入Wnt信號通路激動劑和抑制劑，以研究在體外造血微環(huán)境中肌源性干細胞 Wnt/β-catenin信號通路相關基因的表達情況及當歸補血湯的干預作用。結果發(fā)現(xiàn)，激動劑組中與造血相關的Wnt3、Wnt3a、CD34等基因、Wnt信號通路關鍵基因β-catenin、干細胞增殖分化關鍵因子C-myc以及細胞增殖因子CyclinD1的mRNA表達水平明顯高于抑制劑組，表明當Wnt信號通路持續(xù)激活時，MDSCs 具有更強的增殖分化能力，顯現(xiàn)出較強的造血潛能，且當加入當歸補血湯載藥血清時，該現(xiàn)象更明顯。另外，課題組劉志強等[33]通過體外培養(yǎng)MDSCs，采用基因測序及PCR等技術檢測Wnt信號通路中的相關基因在MDSCs增殖分化過程中的表達情況。實驗結果表明，無論是MDSCs單培養(yǎng)組還是MDSCs與BMSCs共培養(yǎng)組，具有造血意義的Wnt2、Wnt3以及Wnt5a的mRNA表達量均高于新鮮分離的MDSCs組，且共培養(yǎng)組的mRNA表達量更具統(tǒng)計學意義。因此我們認為，Wnt信號通路可能參與了MDSCs的造血分化過程，但其中造血相關基因之間的相互關系仍需進一步實驗探究。

3 MDSCs在造血分化過程中存在的問題

筆者通過全面的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外對于MDSCs造血功能的研究較為有限。本課題組進行了多年的研究，對其中的機制有了初步的了解，但MDSCs的造血分化并不是一個簡單的過程，需要依靠眾多條件的共同干預作用，而其中存在許多較為復雜的問題。比如，MDSCs向造血方向分化，不僅需要依靠造血微環(huán)境中骨髓基質細胞分泌的多種細胞因子的調節(jié)作用，也需要通過各信號通路的調控作用來維持造血分化的平衡，而我們尚未探究其中具體的骨髓基質細胞及細胞因子是如何影響MDSCs造血分化的。其次，盡管課題組初步發(fā)現(xiàn)了Notch和Wnt兩條信號通路在造血分化過程中起到了一定的調控作用，但在這過程中兩條通路是否存在串話關系以及其中具體的調控機制尚未明確，并且信號通路的調控作用可能會因實驗方法的不同而產(chǎn)生不同甚至相反的作用。另外，造血微環(huán)境中存在多條通路，HSCs在增殖分化過程不僅受到Notch和Wnt兩條信號通路的調控，還受到BMP/TGF-β、JAK2-STAT5、Hedgehog等多條信號通路的調控，那么這些通路是否也參與調控MDSCs的造血分化過程都需要我們進一步探索。

另外，我們發(fā)現(xiàn)模擬體外造血微環(huán)境中培養(yǎng)的MDSCs，仍然能向成肌細胞和成骨細胞等方向分化，顯現(xiàn)出干細胞強大的分化特性。因此，如何提高MDSCs取材分離的純化率、提高造血誘導培養(yǎng)過程中向造血細胞分化的效率，以及如何在保證MDSCs干細胞特性的前提下進行體外擴增以獲得大量細胞，這些都是需要在后期實驗中不斷攻克的難關。此外，目前研究中尚未明晰MDSCs移植后在受體內(nèi)具體的遷移、歸巢途徑。在今后的實驗中，我們希望通過對MDSCs進行熒光標記，利用小動物活體成像技術進行示蹤觀察，了解其運動軌跡，以便更好的分析MDSCs的造血分化過程以及對造血功能系統(tǒng)的影響。

4 展望

隨著醫(yī)學生物學和分子生物學技術的發(fā)展，細胞治療和基因治療逐漸成為研究的熱點，醫(yī)學科研工作者通過大量的實驗不斷探求疾病發(fā)生發(fā)展的機制，以期找到多途徑、更有效的治療方法，攻克難治性疾病，促進人類健康。而干細胞因其強大的無限自我更新、增殖分化的能力，可通過移植到靶器官中發(fā)揮相應的作用，具有廣闊的應用前景。作為成體干細胞的一種，MDSCs不僅可以治療肌肉骨骼相關疾病，參與神經(jīng)損傷修復以及糖尿病的治療[46,47]，更因其造血分化的潛能不斷得到發(fā)掘，給惡性血液病的治療提供了新的思路。相比較HSCs移植的局限性，MDSCs具有取材容易、利于體外培養(yǎng)和免疫原性低等優(yōu)點，如果能夠在今后的研究中明確其在造血分化過程中的具體機制，即有望成為移植醫(yī)學領域中新的種子細胞，為更多的血液病患者帶去新的希望。