中藥復(fù)方干預(yù)糖尿病腎臟疾病db/db小鼠的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

周盈 蔡倩 劉晴 王暴魁

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)作為糖尿病最常見的微血管合并癥，隨著糖尿病發(fā)病率提高而危害凸顯，其引起的慢性腎臟病的比例已超過(guò)腎小球腎炎[1]。糖尿病患者一旦出現(xiàn)蛋白尿，5年以后發(fā)生腎衰的患者占50%以上，10年以后發(fā)生腎衰的患者占80%以上[2]。

db/db小鼠是由C57BL/6J近交系中發(fā)現(xiàn)的由于瘦素受體基因缺陷的先天肥胖性2型糖尿病小鼠，是目前被廣泛認(rèn)可的研究人類2型糖尿病較好的動(dòng)物模型。該模型具有早期脂質(zhì)代謝紊亂、持續(xù)進(jìn)展性高血糖等特點(diǎn)[3]，出生4周左右逐漸出現(xiàn)肥胖、高血糖、胰島素抵抗和β細(xì)胞功能衰竭等癥狀，發(fā)病過(guò)程與人類2型糖尿病非常相似。該模型在7～8周時(shí)尿白蛋白排泄量明顯增加[4]，腎臟開始出現(xiàn)DKD的改變，如腎小球系膜基質(zhì)增加、基底膜增厚、小管擴(kuò)張等[5]。8～16周齡時(shí)，小鼠腎臟體積增長(zhǎng)達(dá)20%～30%[6]，16周齡后隨著年齡增長(zhǎng)，小鼠腎臟系膜細(xì)胞數(shù)量增加了3倍[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，與誘發(fā)性糖尿病小鼠模型相比，db/db小鼠腎臟有明顯變化，部分腎臟出現(xiàn)壞死，剖開后內(nèi)部有大量水樣液體，而誘發(fā)性模型腎臟則無(wú)肉眼可見的變化[8]。故db/db小鼠可作為研究DKD發(fā)病機(jī)制及藥物防治較好的動(dòng)物模型。

DKD發(fā)病分子機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為涉及多種因素，包括糖代謝紊亂、脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子異常表達(dá)、自噬行為異常、腎血流動(dòng)力學(xué)異常、遺傳因素等。在各種因素的復(fù)合影響下，腎小球基底膜增厚、系膜細(xì)胞基質(zhì)堆積，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化，失去正常濾過(guò)作用[3]，臨床多表現(xiàn)為蛋白尿、腎功能下降。目前西醫(yī)治療主要使用降糖藥、ACEI/ARB類、他汀類藥物控制血糖、血壓、血脂，通過(guò)治療原發(fā)病來(lái)延緩病情進(jìn)展，但臨床療效有限。近年來(lái)中藥復(fù)方干預(yù)DKD db/db小鼠模型控制DKD進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究取得了一定進(jìn)展，現(xiàn)根據(jù)不同機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 糖代謝與脂代謝紊亂

糖代謝紊亂可以通過(guò)非酶糖基化及糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts, AGEs)聚積、己糖胺通路、多元醇通路、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途徑等造成腎臟損傷。這些途徑可以單一或共同造成后續(xù)的系膜細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)聚積、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腎臟纖維化，造成腎臟損害。糖尿病導(dǎo)致的高血脂狀態(tài)可直接損害腎臟，多余脂質(zhì)沉積在腎臟引起ECM聚積，導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管損傷。Gao等[9]以芪地糖腎顆粒(熟地黃、生黃芪、山萸肉、炒芡實(shí)、炙水蛭、熟大黃、白花蛇舌草)干預(yù) db/db小鼠，發(fā)現(xiàn)該方可在不增加磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)和Akt表達(dá)的情況下提高其磷酸化水平，抑制蛋白激酶和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase , p38MAPK)活化，降低腎組織中胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)的絲氨酸(serine, Ser) 302、磷酸化胰島素受體底物1(phospho-IRS1, Tyr896)磷酸化水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該方可下調(diào)胰島素信號(hào)抑制因子p38MAPK活性，從而削弱其對(duì)IRS-1/PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制，提高胰島素信號(hào)通路活化水平，減輕腎臟胰島素抵抗，從而保護(hù)足細(xì)胞。表明該方不但能夠整體減輕DKD小鼠的胰島素抵抗程度，還可增強(qiáng)腎臟對(duì)胰島素信號(hào)的敏感度，對(duì)治療DKD意義重大[10]。陳霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)黃芪湯(黃芪、茯苓、瓜蔞根、麥門冬、北五味子、炙甘草、生干地黃)對(duì)磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phospho-AMP-activated protein kinase, p-AMPK)、磷酸化Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶β(p-Ca2+/Calmodulin dependent protein kinase kinase beta, p-CaMKKβ)、肝激酶B1(p-liver kinase B1, p-LKB1)、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶蛋白表達(dá)呈濃度依賴性增加，可激活A(yù)MPK-Camkkβ通路，通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝而延緩DKD的進(jìn)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該方還可作用于IRS1/PI3K/GLUT信號(hào)通路，上調(diào)p-IRY1361、p-IRS1Y896、p-PI3K、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporters, GLUT)4，抑制p-IRS1S636/639、p-AKTT308、p-AKTS473、GLUT1，調(diào)節(jié)腎臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，通過(guò)改善葡萄糖再攝取延緩DKD進(jìn)展[12]。

2 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激導(dǎo)致活性氧族(reactive oxygen species，ROS)生成過(guò)多，其中一氧化氮合酶、NADPH氧化酶(NADPH oxidase, Nox)等均是其重要來(lái)源，其中研究較多的有Nox4、Nox2等，可以抑制三磷酸甘油脫氫酶活性，激活與糖尿病微血管病變發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路，與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是抗氧化中發(fā)揮中心作用的核轉(zhuǎn)錄因子，相關(guān)通路可有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。劉華東等[13]以復(fù)腎湯(黃芪、大黃、水蛭、地龍等)干預(yù)db/db小鼠，可下調(diào)丙二醛(malondialdehyde, MDA)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)、纖維結(jié)合蛋白(fibronectin,FN)水平，上調(diào)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平，緩解DKD可能與抑制氧化應(yīng)激和部分細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)、調(diào)節(jié)脂代謝等多種因素相關(guān)。張并璇等[14]以糖腎方(黃芪、生地黃、山茱萸、大黃、鬼箭羽、三七、枳殼)干預(yù)db/db小鼠觀察NADPH氧化酶及Nrf2通路發(fā)現(xiàn)，糖腎方可顯著抑制Nox2、Nox4、p22phox、Nrf2、NQO1表達(dá)，提高血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表達(dá)，通過(guò)降低腎臟NADPH氧化酶表達(dá)，減少活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆積，抑制Nrf2入核，起到抗氧化應(yīng)激、減輕腎損傷的作用。

3 炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括單核細(xì)胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、白介素(interleukin, IL)、細(xì)胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子通路(the janus kinase /signal transducer and activator of transcription pathway, JAK/STAT)、核因子kB(nuclear factor kB, NF-kB)相關(guān)通路等。陳勇等[15]以石斛合劑(石斛、黃芪、丹參、五味子、葛根、知母、生地黃、地龍等)干預(yù)db/db小鼠發(fā)現(xiàn)，該方可顯著抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、MCP-1、ICAM-1、IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，延緩DKD進(jìn)展。Mei等[16]觀察糖腎方(黃芪、生地黃、三七、大黃、枳殼、山茱萸、鬼箭羽)對(duì)細(xì)胞因子抗體陣列影響發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)24種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-13、IL-15、干擾素-γ，通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路起到抑制炎癥反應(yīng)治療DKD的作用。Hu等[17]以糖腎方(黃芪、地黃、三七、大黃、山茱萸等)干預(yù)db/db小鼠發(fā)現(xiàn)，該方可提高JAK1、JAK2、STAT3表達(dá)，抑制STAT4表達(dá)，激活鈣庫(kù)操控Ca2+通道(store-operated calcium, SOC)蛋白。而細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS-1)作為JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控因子在腎臟中過(guò)表達(dá)可延緩DKD進(jìn)展[18]，提示糖腎方可能通過(guò)調(diào)節(jié)JAK/STAT/SOCS通路起到治療DKD的作用?；葨|等[19-20]以復(fù)方魚腥草合劑(魚腥草、牛蒡子)不同提取物干預(yù)db/db小鼠，同樣發(fā)現(xiàn)該方可抑制JAK/STAT信號(hào)通路，且對(duì)比不同提取物還發(fā)現(xiàn)正丁醇組和水提取物組亦可提高SOCS-1基因及蛋白表達(dá)。

4 細(xì)胞因子異常表達(dá)

多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)與DKD的發(fā)生密切相關(guān)，研究較多的有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-beta, TGF-β)、TNF-α。TGF-β作為糖代謝紊亂、細(xì)胞因子等多種因素引起腎損傷共同的重要中介，與其下游信號(hào)Smad在腎纖維化進(jìn)程中扮演了最有力的驅(qū)動(dòng)者。TNF-α在高血糖狀態(tài)下可介導(dǎo)炎癥等多種改變導(dǎo)致DKD。段穎等[21-22]用固腎降白顆粒(黃芪、白術(shù)、薏苡仁、赤小豆、地龍、五味子、丹參、黃柏)干預(yù)db/db小鼠，發(fā)現(xiàn)該方可下調(diào)腎組織中TGF-β1、Smad3、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-smooth muscle actin, α-SMA)，上調(diào)E鈣黏連蛋白(E-cadherin, E-cad)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenic protein, BMP)-7，減緩腎臟纖維化。房蕓等[23]、史曉偉等[24]分別發(fā)現(xiàn)復(fù)方魚腥草合劑(魚腥草、牛蒡子)和糖腎康(杜仲、黃芪、大黃、桃仁、金櫻子、芡實(shí)、水蛭、澤瀉)均可減少ECM蓄積，減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化程度。劉鵬等[25]發(fā)現(xiàn)糖腎方(黃芪、生地黃、山茱萸、三七、衛(wèi)矛、熟大黃、枳殼)不僅可下調(diào)TGF-β1、Smad3、膠原(collagen, Col)I、 FN的表達(dá)，還可下調(diào)miRNA29b，上調(diào)miRNA21，通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟纖維化相關(guān)miRNA，減緩DKD腎臟纖維化。

5 自噬行為異常

生理狀態(tài)下自噬行為作為一種高度保守的自穩(wěn)調(diào)控機(jī)制，主要表現(xiàn)為包裹并降解細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器，可以維持不同應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。DKD時(shí)腎臟中高糖高脂狀態(tài)會(huì)抑制足細(xì)胞自噬水平，其中AMPK信號(hào)通路被抑制，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路作為自噬負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制被激活與DKD發(fā)病關(guān)系緊密。Zhao等[26]研究發(fā)現(xiàn)糖腎方(黃芪、鬼箭羽、地黃、枳實(shí)、山茱萸、大黃、三七根)可抑制db/db小鼠腎臟早幼粒細(xì)胞白血病鋅指(promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF)和ColⅢ，通過(guò)抑制PLZF表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，上調(diào)自噬水平，促進(jìn)ColⅢ自噬降解，減輕腎損傷。

此外，還有學(xué)者進(jìn)行其他機(jī)制及多種機(jī)制的研究，Peng等[27]研究發(fā)現(xiàn)糖腎方(黃芪、生地黃、山茱萸、三七、鬼箭羽、熟大黃、枳殼)可促進(jìn)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)介導(dǎo)的膽固醇外流，減少腎臟膽固醇蓄積治療DKD。鄭燕芳等[28]研究發(fā)現(xiàn)石斛合劑(石斛、黃芪、丹參、葛根、五味子、生地黃、川牛膝、知母、地龍、白花蛇舌草等)和六味地黃丸 (熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉)均可下調(diào)db/db小鼠腎臟水通道蛋白(aquaporin, AQP)2、AQP3的表達(dá)，其中AQP2維持機(jī)體水平衡，并參與尿液濃縮和滲透壓調(diào)節(jié)[29]，恢復(fù)體內(nèi)水代謝平衡, 從而防治早期DKD損害。Jung等[30]以五苓散(澤瀉、豬苓、白術(shù)、茯苓、桂枝)干預(yù)db/db小鼠發(fā)現(xiàn)可抑制TGF-β1、p-Smad2、ColIV、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶組織抑制因子-2、ICAM-1和MCP-1的表達(dá)，提高膜型基質(zhì)金屬蛋白酶、Smad7表達(dá)，五苓散可調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路，減少ECM堆積，減輕炎性反應(yīng)損傷，多通路多靶點(diǎn)地治療DKD。

6 問(wèn)題與展望

DKD的發(fā)病機(jī)制尚未清晰，涉及到多條信號(hào)通路和多個(gè)作用靶點(diǎn)，這些信號(hào)通路、作用靶點(diǎn)雖作用不同卻又錯(cuò)雜交縱、緊密聯(lián)系，目前西藥治療難以從源頭截?cái)嗉膊“l(fā)展或多途徑覆蓋相關(guān)靶點(diǎn)。而研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方治療DKD優(yōu)勢(shì)顯著，不僅可以改善臨床癥狀，還可通過(guò)多靶點(diǎn)多途徑截?cái)嗖C(jī)，更加全面地減緩病程進(jìn)展，逐漸受到重視。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索其作用的分子機(jī)制，可為中藥復(fù)方治療DKD提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及處方思路，證實(shí)中藥復(fù)方治療DKD的科學(xué)性。

根據(jù)以上有關(guān)中藥復(fù)方干預(yù)DKD db/db小鼠實(shí)驗(yàn)研究，可發(fā)現(xiàn)不同中藥復(fù)方可作用于相同或類似的分子機(jī)制，同一中藥復(fù)方也可作用于多個(gè)通路調(diào)控多種分子機(jī)制?？梢源_定的是，基于辨證論治形成的有效中藥復(fù)方可不同程度地緩解DKD進(jìn)程，且多種復(fù)方的研究表明，中藥復(fù)方并非單一作用，而更傾向于多靶點(diǎn)多途徑貫穿治療始終。一般來(lái)說(shuō)db/db小鼠病至晚期不會(huì)發(fā)生腎小球膜溶解或結(jié)節(jié)性腎小球系膜硬化，也不會(huì)發(fā)展為進(jìn)行性腎功能不全[31],是研究人類早中期DKD的理想動(dòng)物模型，而上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了中藥復(fù)方在DKD早中期干預(yù)的療效顯著，且對(duì)于DKD晚期腎臟纖維化在分子學(xué)層面存在預(yù)防作用。提示中醫(yī)藥治療DKD應(yīng)從早中期著手，對(duì)療效與預(yù)后有關(guān)鍵作用。

但目前中藥治療DKD機(jī)制的研究仍存在諸多不足：(1)從目前掌握的研究結(jié)果分析，中藥并非單純作用某一個(gè)靶點(diǎn)或某一個(gè)通路，常出現(xiàn)對(duì)多機(jī)制同時(shí)作用的現(xiàn)象，要求實(shí)驗(yàn)人員在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)要盡可能涉及多個(gè)通路、多個(gè)靶點(diǎn)，避免以偏概全；(2)不同復(fù)方對(duì)于靶點(diǎn)覆蓋程度以及多種機(jī)制對(duì)疾病的貢獻(xiàn)度尚不清晰，一方面需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，另一方面需要基于大數(shù)據(jù)探索不同復(fù)方作用之間的異同；(3)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的同時(shí)，要將研究成果應(yīng)用到中醫(yī)的辨證用藥中去，將現(xiàn)代科學(xué)成果為中醫(yī)所用，用微觀變化解釋中藥復(fù)方療效的科學(xué)內(nèi)涵；(4)中藥復(fù)方受藥材質(zhì)量、劑量不同、煎煮方法、給藥方式等影響存在較大的不穩(wěn)定性，不可避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，建議今后探索中藥有效成分，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥治療DKD的優(yōu)勢(shì)；(5)實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)以“治病為本”的原則出發(fā)，證明中藥有效性不是最終目的，在研究中藥作用機(jī)制的同時(shí)更應(yīng)中西醫(yī)結(jié)合優(yōu)化DKD的治療方案，發(fā)揮西藥的優(yōu)勢(shì)，對(duì)比不同干預(yù)方法的作用差異，為臨床延緩DKD病程，提高患者生存質(zhì)量謀福利。本研究望通過(guò)中藥復(fù)方治療DKD分子機(jī)制的研究，進(jìn)一步明確中藥作用機(jī)制，為治療DKD提供新思路。