韓婧,劉惠文,吳娟,許鳳清,2,楊青山,2,王國(guó)凱,2,劉勁松,2*
1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心,安徽 合肥 230012
穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees為爵床科穿心蓮屬植物,又名一見喜、苦草、斬蛇草、印度草等。原產(chǎn)地可能為南亞,其莖、葉極苦,具有清熱解毒之功效[1]。因其抗病毒和廣譜抗菌作用,被稱為“天然抗生素”[2]。我國(guó)于20世紀(jì)50年代先在福建、廣東地區(qū)引種了穿心蓮,后于廣西、湖南、四川及華北和西北地區(qū)相繼栽培[3]。穿心蓮屬植物中富含黃酮類和二萜內(nèi)酯類成分[4-5]。安徽臨泉已有多年穿心蓮引種歷史,現(xiàn)已成為穿心蓮的中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)生產(chǎn)基地[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)臨泉GAP基地穿心蓮地上部分進(jìn)行化學(xué)成分系統(tǒng)研究,明確該產(chǎn)區(qū)穿心蓮物質(zhì)基礎(chǔ),為穿心蓮引種種植研究進(jìn)行有益的探索。
Bruker AV 400 MHz或AVANCE Ⅲ-600 MHz核磁共振儀(德國(guó)Bruker BioSpin GmbH公司);Waters Xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);Waters Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);HP1100 型高效液相色譜儀、UPLC-IT-TOF色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司);中壓液相色譜儀(瑞士BUCHI公司);XRC-1型顯微熔點(diǎn)儀(四川大學(xué)科儀廠生產(chǎn));KH-2100薄層色譜分析儀(上??普芄?。
柱色譜硅膠(200~300目,青島海洋化工廠),薄層色譜硅膠板(青島海洋硅膠試劑廠);反相填充材料RP-18(20~45 μm,日本Fuji Silysia Chemical公司);MCI填充材料MCI-gel CHP-20P(日本三菱公司);Sephadex LH-20(瑞典Amershanm Biosciences公司)。
穿心蓮藥材于2017年6月采于安徽省阜陽市臨泉縣牛莊,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山教授鑒定為爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees的地上部分。
將干燥的穿心蓮地上部分32 kg,粉碎,用90%乙醇水回流提取3次,合并提取液,減壓濃縮至無醇味,加水混懸,依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取,分別得到石油醚萃取浸膏189 g,乙酸乙酯萃取浸膏403 g和正丁醇萃取浸膏106 g。
取乙酸乙酯部位萃取物200 g,吸附于350 g硅膠(100~200目)上,經(jīng)硅膠柱色譜,薄層色譜(TLC)(石油醚-乙酸乙酯,10∶1~1∶100)檢識(shí),合并相同組分得8個(gè)亞組分Fr.1~Fr.8。
組分1經(jīng)硅膠柱色譜,TLC(石油醚-乙酸乙酯,10∶1~1∶100)檢識(shí),合并相同組分得5個(gè)亞組分Fr.1-1~Fr.1-5。組分Fr.1-5經(jīng)硅膠色譜(石油醚-乙酸乙酯,10∶1~100∶1),得到3個(gè)亞組分Fr.1-5-1~Fr.1-5-3。Fr.1-5-2經(jīng)凝膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇,1∶1)純化得到化合物3(5.4 mg)。組分2經(jīng)硅膠柱色譜,TLC(石油醚-丙酮,10∶1~1∶100)檢識(shí),合并相同組分得9個(gè)亞組分Fr.2-1~Fr.2-9。組分Fr.2-1經(jīng)硅膠色譜(石油醚-乙酸乙酯,10∶1~1∶100),得到9個(gè)亞組分Fr.2-1-1~Fr.2-1-9。Fr.2-1-8經(jīng)凝膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇,1∶1),經(jīng)過純化得到化合物4(5.6 mg)和5(3.6 mg)。Fr.2-1-5經(jīng)MCI柱,甲醇-水(30∶70~100∶1)系統(tǒng)洗脫,可以得到7個(gè)組分。Fr.2-1-5-6經(jīng)硅膠色譜柱(二氯甲烷-甲醇,10∶1~1∶100),得到4個(gè)亞組分,對(duì)組分Fr.2-1-5-6-1及Fr.2-1-5-6-2分別進(jìn)行正相硅膠柱梯度洗脫、純化,得化合物6(5.8 mg)和7(6.4 mg)。Fr.2-7經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇,12∶1~1∶100),得到7個(gè)亞組分。將Fr.2-7-3經(jīng)MCI柱(甲醇-水,35∶65~100∶1)系統(tǒng)洗脫,得10個(gè)亞組分,F(xiàn)r.2-7-3-1經(jīng)制備HPLC(乙腈-水,5∶95~15∶85)純化得Fr.2-7-3-1-2;對(duì)Fr.2-7-3-10經(jīng)制備HPLC(乙腈-水,38∶62~56∶44)純化得化合物8(4.6 mg,30 min)、9(7.9 mg,41 min)和10(6.5 mg,50 min);Fr.2-7-5-5經(jīng)反相Rp18中壓液相色譜(甲醇-水,10∶90~100∶0)分離劃分為3個(gè)亞組分,F(xiàn)r.2-7-5-5-1靜置析出結(jié)晶,經(jīng)反復(fù)重結(jié)晶得化合物11(6.7 mg)。組分3經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇,100∶1~1∶100),TLC檢識(shí),合并相同組分共得9個(gè)亞組分Fr.1-1~Fr.1-9;將Fr.3經(jīng)MCI柱(甲醇-水,30∶70~100∶1)系統(tǒng)洗脫,得到10個(gè)亞組分,即Fr.3-1~Fr.3-10;Fr.3-10經(jīng)凝膠柱(三氯甲烷-甲醇,1∶1)得到5個(gè)亞組分,對(duì)Fr.3-10-1經(jīng)制備HPLC(乙腈-水,25∶75~35∶65)純化得化合物12(6.3 mg,30 min)、13(4.7 mg,25 min)和14(4.3 mg,29 min)。Fr.3-4經(jīng)反相Rp18中壓液相色譜(甲醇-水,25∶75~100∶0)分離劃分為5個(gè)亞組分,即Fr.3-4-1~Fr.3-4-5。Fr.3-4-3經(jīng)prep-HPLC(乙腈-水,20∶80~30∶70)純化得化合物2(4.7 mg,25 min);Fr.3-4-5經(jīng)制備HPLC(乙腈-水,15∶85~32∶68)純化得化合物1(4.6 mg,30 min)。
化合物1:分子式C16H14O5,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于三氯甲烷;mp 203~206 ℃;ESI-MSm/z309[M+Na]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:11.89(1H,s,5-OH),7.44(5H,m,H-2′,-3′,-4′,-5′,-6′),6.16(1H,s,H-6),5.48(1H,dd,J=12.8,3.2 Hz,H-2),3.88(3H,s,8-OCH3),3.09(1H,dd,J=17.8,12.8Hz,H-3a),2.87(1H,dd,J=17.2,3.2 Hz,H-3b);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:79.7(C-2),43.5(C-3),195.6(C-4),158.0(C-5),96.0(C-6),159.9(C-7),127.6(C-8),152.8(C-9),101.8(C-10),138.7(C-1′),126.0(C-2′,-6′),128.5(C-3′,-4′,-5′),61.6(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物1為雙氫漢黃芩素。
化合物2:分子式C17H14O5,黃色結(jié)晶,易溶于三氯甲烷;mp 162~163 ℃;ESI-MSm/z321[M+Na]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ: 12.57(1H,s,5-OH),7.96(2H,m,H-2′,-6′),7.55(3H,m,H-3′,-4′,-5′),6.68(1H,s,H-8),6.44(1H,s,H-3),3.96(3H,s,6-OCH3),3.95(3H,s,7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物2為5-羥基-6,7-二甲氧基黃酮。
化合物3:分子式C18H18O5,黃色結(jié)晶,易溶于三氯甲烷;mp 138~139 ℃;ESI-MSm/z337[M+Na]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:13.91(1H,s,2-OH),7.86(1H,d,J=15.6 Hz,H-β),7.81(1H,d,J=15.6 Hz,H-α),7.62~7.60(2H,m,H-2′,-6′),7.42~7.40(3H,m,H-3′,-4′,-5′),6.02(1H,s,H-5),3.97(3H,s,4-OMe),3.97(3H,s,6-OMe),3.78(3H,s,3-OMe);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:106.9(C-1),158.5(C-2),130.2(C-3),158.7(C-4),87.1(C-5),159.4(C-6),127.5(C-α),135.5(C-β),193.3(C=O),142.7(C-1′),128.9(C-2′,6′),128.4(C-3′,5′),130.9(C-4′),60.8(3-OCH3),56.0(4-OCH3),56.1(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物3為2-羥基-3,4,6-三甲氧基查爾酮。
化合物4:分子式C17H14O5,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于三氯甲烷;mp 183~184 ℃;ESI-MSm/z299[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:12.57(1H,s,5-OH),7.96(2H,dd,J=7.4,1.5 Hz,H-2′,-6′),7.59~7.49(3H,m,H-3′,-4′,-5′),6.68(1H,s,H-3),6.45(1H,s,H-6),3.96(3H,s,7-OCH3),3.94(3H,s,8-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:164.0(C-2),105.4(C-3),182.8(C-4),104.8(C-5),158.8(C-6),95.9(C-7),157.6(C-8),129.1(C-9),157.6(C-10),131.4(C-1′),126.4(C-2′,6′),129.2(C-3′,5′),132.0(C-4′),61.7(7-OCH3),56.4(7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物4為5-羥基-7,8-二甲氧基黃酮。
化合物5:分子式C18H15O7,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于二甲基亞砜(DMSO);mp 254~255 ℃;ESI-MSm/z343[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:12.34(1H,s,5-OH),7.78(1H,dd,J=8.0,1.6 Hz,H-6′),7.44(1H,t,J=7.8 Hz,H-4′),7.08(1H,br d,J=8.4 Hz,H-3′),7.05(1H,t,J=7.6 Hz,H-5′),7.02(1H,s,H-3),6.47(1H,s,H-6),3.97(3H,s,7-OCH3),3.95(3H,s,8-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:164.0(C-2),107.2(C-3),183.1(C-4),156.8(C-5),96.3(C-6),158.9(C-7),128.9(C-8),148.9(C-9),104.7(C-10),116.6(C-1′),157.6(C-2′),118.9(C-3′),133.9(C-4′),120.9(C-5′),128.3(C-6′),56.6(7-OCH3),56.6(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物5為穿心蓮素。
化合物6:分子式C18H16O7,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于DMSO;mp 195~197 ℃;ESI-MSm/z358[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.62(1H,s,5-OH),7.44(1H,d,J=2.5 Hz,H-6′),7.22(1H,dd,J=9.1,2.5 Hz,H-4′),7.21(1H,s,H-3),6.93(1H,d,J=9.1 Hz,H-3′),6.62(1H,s,H-6),3.93(3H,s,7-OCH3),3.90(3H,s,8-OCH3),3.82(3H,s,2′-OCH3),3.80(3H,s,5′-OCH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:161.2(C-2),109.6(C-3),182.3(C-4),103.9(C-5),156.7(C-6),96.0(C-7),158.6(C-8),128.4(C-9),149.0(C-10),119.8(C-1′),152.1(C-2′),113.8(C-3′),118.6(C-4′),153.0(C-5′),114.1(C-6′),56.4(7-OCH3),61.1(8-OCH3),56.6(2′-OCH3),55.6(5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物6為5-羥基-7,8,2′,5′-四甲氧基黃酮。
化合物7:分子式C18H18O5,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于DMSO;mp 156~158 ℃;ESI-MSm/z315[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.49~7.42(5H,m,H-2′,-3′,-4′,-5′,-6′),6.14(1H,s,H-6),5.47(1H,dd,J=12.4,3.0 Hz,H-2),3.95(3H,s,7-OCH3),3.93(3H,s,8-OCH3),3.81(3H,s,5-OCH3),3.02(1H,dd,J=17.0,12.4 Hz,H-3),2.88(1H,dd,J=17.0,3.0 Hz,H-3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ: 79.1(C-2),45.7(C-3),189.5(C-4),106.3(C-5),158.8(C-6),89.3(C-7),157.9(C-8),156.3(C-9),138.6(C-1′),126.0(C-2′,6′),128.8(C-3′,5′),128.5(C-4′),61.2(7-OCH3),56.6(8-OCH3,5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物7為5,7,8-三甲氧基二氫黃酮。
化合物8:分子式C19H18O6,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于三氯甲烷;mp 76~78 ℃;ESI-MSm/z343[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.98(1H,dd,J=7.6,1.8 Hz,H-6′),7.47(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),7.11(1H,t,J=8.4 Hz,H-4′),7.03(1H,d,J=8.4 Hz,H-3′),6.44(1H,s,H-8),3.99(3H,s,7-OCH3),3.97(3H,s,8-OCH3),3.94(3H,s,5-OCH3),3.93(3H,s,2′-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:158.0(C-2),111.6(C-3),178.4(C-4),130.7(C-5),156.3(C-6),92.3(C-7),152.2(C-8),156.3(C-9),109.0(C-10),120.5(C-1′),158.1(C-2′),113.5(C-3′),132.1(C-4′),129.1(C-5′),120.8(C-6′),61.6(8-OCH3),56.6(7-OCH3),56.3(5-OCH3),55.6(2′-OCH3)。以上氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物8為2′-甲氧基-5,6,7-三甲基黃芩素。
化合物9:分子式C18H16O5,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于三氯甲烷;mp 158~160 ℃;ESI-MSm/z313[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ: 7.80(2H,d,J=8.8 Hz,H-2′,-6′),6.99(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,-5′),6.58(1H,s,H-3),6.54(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),6.36(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),3.96(3H,s,5-OCH3),3.91(3H,s,7-OCH3),3.87(3H,s,4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物9為5,7,4′-三甲氧基黃酮。
化合物10:分子式C16H12O6,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于甲醇;mp 284~286 ℃;ESI-MSm/z301[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.80(2H,d,J=8.6 Hz,H-2′,-6′),6.87(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,-5′),6.60(1H,s,H-8),6.56(1H,s,H-3),3.60(3H,s,6-OCH3);13C-NMR(150 MHz,CD3OD)δ: 165.4(C-2),103.4(C-3),185.0(C-4),154.0(C-5),133.0(C-6),157.9(C-7),95.4(C-8),154.0(C-9),105.0(C-10),122.2(C-1′),128.9(C-2′),118.0(C-3′),161.8(C-4′),116.0(C-5′),128.9(C-6′),60.4(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物10為高車前素。
化合物11:分子式C25H28O12,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于DMSO;mp 138 ℃;ESI-MSm/z521[M+H]+1;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.43(1H,d,J=2.8 Hz,H-6′),7.21(1H,d,J=8.8 Hz,H-3′),7.18(1H,dd,J=8.8,2.8 Hz,H-4′),7.16(1H,s,H-6),6.86(1H,s,H-3),4.73(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.14~3.73(6H,m,H-2″,-3″,-4″,-5″,-6″),3.94(3H,s,7-OCH3),3.89(3H,s,8-OCH3),3.86(3H,s,2′-OCH3),3.80(3H,s,5′-OCH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:158.6(C-2),109.2(C-3),177.4(C-4),104.5(C-5),156.5(C-6),101.2(C-7),153.4(C-8),132.2(C-9),150.6(C-10),118.2(C-1′),152.0(C-2′),112.3(C-3′),118.2(C-4′),153.0(C-5′),113.6(C-6′),61.1(8-OCH3),56.4(7-OCH3),56.3(2′-OCH3),55.7(5′-OCH3)104.5(glc-1″),73.6(glc-2″),77.7(glc-3″),70.2(glc-4″),76.0(glc-5″),61.1(glc-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物11為7,8,2′,5′-四甲氧基黃酮-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物12:分子式C23H26O10,淡黃色針狀結(jié)晶,易溶于DMSO;mp 168~169 ℃;ESI-MSm/z463[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.61~7.38(5H,m,H-2′,-3′,-4′,-5′,-6′),6.70(1H,s,H-6),5.63(1H,dd,J=12.1,2.8 Hz,H-2),3.16(1H,dd,J=17.8,10.3 Hz,H-3a),2.81(1H,dd,J=16.1,3.0 Hz,H-3b),4.73(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.06~3.45(6H,m,H-2″,-3″,-4″,-5″,-6″),3.91(3H,s,7-OCH3),3.73(3H,s,8-OCH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:77.3(C-2),46.1(C-3),191.8(C-4),160.0(C-5),98.8(C-6),156.4(C-7),156.4(C-8),134.3(C-9),156.5(C-10),140.3(C-1′),127.2(C-2′),129.6(C-3′),129.4(C-4′),129.6(C-5′),129.6(C-6′),61.0(8-OCH3),56.7(7-OCH3),105.9(glc-1″),74.7(glc-2″),80.1(glc-3″),71.5(glc-4″),78.6(glc-5″),62.8(glc-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物12為穿心蓮黃酮苷A。
化合物13:分子式C23H24O10,淡黃色針狀結(jié)晶;mp 196~201 ℃;ESI-MSm/z463[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.06(2H,m,H-2′,-6′),7.52~7.75(3H,m,H-3′,-4′,-5′),7.18(1H,s,H-6),6.93(1H,s,H-3),3.94(3H,s,7-OCH3),3.90(3H,s,8-OCH3),4.77(1H,d,J=7.6 Hz,H-1″),3.14~3.41(6H,m,H-2″,-3″,-4″,-5″,-6″);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ: 160.9(C-2),107.6(C-3),190.2(C-4),103.4(C-5),158.6(C-6),132.4(C-7),158.6(C-8),155.4(C-9),109.4(C-10),132.4(C-1′),126.1(C-2′),129.3(C-3′),130.8(C-4′),129.3(C-5′),126.1(C-6′),61.1(8-OCH3),56.0(7-OCH3),106.8(glc-1″),76.0(glc-2″),78.4(glc-3″),70.0(glc-4″),78.5(glc-5″),61.2(glc-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物13為穿心蓮黃酮苷C。
化合物14:分子式C23H25O11,淡黃色針狀結(jié)晶;mp 145~147 ℃;ESI-MSm/z499[M+Na]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.86(1H,d,J=7.9 Hz,H-4′),7.49(1H,t,J=7.8 Hz,H-3′),7.20(1H,s,H-6),6.89(1H,s,H-3),4.73(1H,d,J=7.2 Hz,H-1″),3.11~3.50(6H,m,H-2″,-3″,-4″,-5″,-6″),3.92(3H,s,7-OCH3),3.90(3H,s,8-OCH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:159.4(C-2),111.7(C-3),177.6(C-4),153.3(C-5),101.2(C-6),156.3(C-7),132.7(C-8),150.5(C-9),109.2(C-10),117.3(C-1′),156.8(C-2′),117.1(C-3′),132.4(C-4′),119.6(C-5′),128.1(C-6′),61.1(8-OCH3),56.3(7-OCH3),104.6(glc-1″),73.6(glc-2″),76.0(glc-3″),70.2(glc-4″),77.7(glc-5″),61.1(glc-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]數(shù)據(jù)基本一致,鑒定化合物14為穿心蓮黃酮苷G。
從臨泉產(chǎn)穿心蓮地上部分中分離得到了14個(gè)黃酮類化合物,包括6個(gè)黃酮類、3個(gè)二氫黃酮類、1個(gè)查耳酮類以及4個(gè)黃酮苷類,揭示臨泉產(chǎn)穿心蓮黃酮類化學(xué)成分的復(fù)雜性。其中化合物1、2、3、8首次從穿心蓮中分離得到,豐富了穿心蓮的化學(xué)成分,為進(jìn)一步研究臨泉產(chǎn)穿心蓮的藥理活性和藥材品質(zhì)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。