五氯苯酚對(duì)淡水雙殼類背角無齒蚌ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

華春秀，張科，劉慶春，李冰潔，宋國英，薛士鵬，于瑞雪，王中曉，張慶遠(yuǎn)，劉麗，夏西超,,*

1. 南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，南陽 473061 2. 平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，平頂山 476000

五氯苯酚(PCP)廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、木材防腐劑和個(gè)人護(hù)膚品等工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，目前，在地表水、地下水、污水和飲用水中都不同程度地被檢測(cè)到[1-3]。PCP存在能夠給水生生物和人類生存帶來顯著的健康威脅，已被美國、中國和歐洲等國家和地區(qū)定為一種具有嚴(yán)重危害的持久性污染物[4-6]。在我國，PCP主要用于殺滅血吸蟲的中間宿主，由于其持久性的存在，在大多數(shù)河流中仍然被廣泛發(fā)現(xiàn)[1,7-8]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)屬于機(jī)體Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)酶類，催化谷胱甘肽(GSH)與廣泛外源性或內(nèi)源性有毒化合物親電中心結(jié)合，如癌癥化療藥物、化學(xué)致癌物、農(nóng)藥、除草劑和氧化應(yīng)激產(chǎn)物[9-10]。在哺乳動(dòng)物中，根據(jù)GST底物特異性、免疫學(xué)性質(zhì)和蛋白質(zhì)序列的同源性，把GST劃分為α、μ、π、θ、σ、ζ和ω等7個(gè)大類[11]。在氧化應(yīng)激條件下，GST表達(dá)水平被視為是一種適應(yīng)性反應(yīng)，GST表達(dá)被認(rèn)為是受氧化應(yīng)激動(dòng)物的分子標(biāo)志物[12-13]。背角無齒蚌(Anodontawoodiana)作為淡水底棲生物的重要類群，在淡水環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有重要作用[14-15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PCP處理對(duì)背角無齒蚌產(chǎn)生顯著的毒性傷害和應(yīng)激效應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討[16]。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶完整基因序列并命名為ρ-GST，通過real-time PCR分析ρ-GST時(shí)空表達(dá)，為揭示PCP毒性效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 背角無齒蚌處理

背角無齒蚌購自南陽市水產(chǎn)市場(chǎng)，殼長(6.5±0.5) cm，處理之前，動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)中適應(yīng)養(yǎng)殖2周。PCP購自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，溶解于二甲亞砜(DMSO)中以制備儲(chǔ)備液。動(dòng)物處理實(shí)驗(yàn)在長方形塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm高)中進(jìn)行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[16]，每天更換水，動(dòng)物喂食小球藻。為了確定ρ-GST組織分布，對(duì)來自同一塑料盒的5只動(dòng)物進(jìn)行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。根據(jù)上述動(dòng)物處理方法，將80只河蚌隨機(jī)飼養(yǎng)于10個(gè)塑料盒中，每盒8只，分為對(duì)照組和PCP處理組，每組5個(gè)盒子。PCP處理組采用13.9 mg·L-1的PCP進(jìn)行處理，對(duì)照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。0、1、3、6、9、12和15 d從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物生物有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應(yīng)模板。

1.3 背角無齒蚌ρ-GST核心片段的擴(kuò)增

簡(jiǎn)并引物ρ-GST1和ρ-GST2分離ρ-GST cDNA保守區(qū)域片段，PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，雙向測(cè)序。確定ρ-GST部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，擴(kuò)增ρ-GST cDNA 5’和3’區(qū)域序列，5’RACE和3’RACE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和拼接。

1.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

分析ρ-GST序列，通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行BLAST程序比對(duì)；根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP預(yù)測(cè)信號(hào)肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)Ζ?GST基因進(jìn)行多序列比對(duì)；通過Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)ρ-GST的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件，采用臨近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 ρ-GST mRNA水平定量檢測(cè)

為了確定ρ-GST轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進(jìn)行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)ρ-GST-F和ρ-GST-R引物常用PCR儀中分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測(cè)出一個(gè)條帶，PCR產(chǎn)物測(cè)序，序列鑒別。使用ABI7500實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行real-time PCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過2-△△CT分析ρ-GST表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果(Results)

2.1 背角無齒蚌ρ-GST分子結(jié)構(gòu)

背角無齒蚌ρ-GST cDNA全長為1 026 bp，包含了57 bp的5’非編碼區(qū)、291 bp的3’非編碼區(qū)和一個(gè)678 bp的開放閱讀框。開放閱讀框?yàn)?26個(gè)氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量為26.80 kDa，等電點(diǎn)為6.38。終止信號(hào)(AATAAA)位于3’UTR的986～991處(圖1)。預(yù)測(cè)氨基酸序列包括N端G-位(殘基8～85)和C端H-位點(diǎn)(殘基92～204)2個(gè)保守區(qū)域(圖1)。

背角無齒蚌ρ-GST和其他水生軟體動(dòng)物GSTs之間的多重序列比對(duì)結(jié)果表明，所有GSTs的N-端區(qū)域同源性較高，并且相對(duì)保守，而C-端相對(duì)多變(圖2)。在ρ-GST中，N端部分是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶催化的必要條件，通過穩(wěn)定二硫鍵來激活被束縛的GSH。在該區(qū)域中，Try7、Ser13、Pro15、Phe38、His42、Lys43、Glu69和Ser70都是所有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶序列中的保守氨基酸，G-位點(diǎn)上這些氨基酸與GST結(jié)合有關(guān)(圖2)。

圖2 背角無齒蚌ρ-GST與其他物種GST序列多重比對(duì)注：G-位點(diǎn)保守氨基酸殘基用星號(hào)表示。CgGST為長牡蠣谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(EKC36795.1)，HdGST為皺紋盤鮑(Haliotis discus discus) 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A(ABO26605.1)，LeGST為南極帽貝(Laternula elliptica)ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(ACM44933.1)，RpGST為菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(AEW46331.1)。Fig. 2 Multiple alignment of ρ-GST of Anodonta woodiana compared with other GSTSsNote: CgGST is Crassostrea gigas glutathione S-transferase A (EKC36795.1); HdGST is Haliotis discus discus glutathione S-transferase A (ABO26605.1); LeGST is Laternula elliptica rho-class glutathione S-transferase (ACM44933.1); RpGST is Ruditapes philippinarum rho-class glutathione S-transferase (AEW46331.1). The conserved residues of G-sites are marked with asterisk.

2.2 AwGST1和AwGST2的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

ρ-GST蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)有12個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊組成(圖3A)。在N端G-位點(diǎn)有3個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊，C端的H-位點(diǎn)包含8個(gè)α-螺旋。ρ-GST的三維結(jié)構(gòu)與其他物種ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶有高度的相似性(圖3B)。

圖3 背角無齒蚌ρ-GST二級(jí)和3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)注：A. ρ-GST二級(jí)結(jié)構(gòu)；B. ρ-GST的3D結(jié)構(gòu)。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of ρ-GST deduced amino acids of Anodonta woodianaNote: A. The secondary structure of ρ-GST; B. The 3D structure of ρ-GST.

2.3 背角無齒蚌ρ-GST系統(tǒng)進(jìn)化

背角無齒蚌ρ-GST氨基酸序列與腹足綱皺紋盤鮑GST有55%同源性，與雙殼綱長牡蠣(Crassostreagigas)GST有55%同源性，與腹足綱南極帽貝ρ-GST有50%同源性，與菲律賓蛤仔GST有46%同源性(表2)。

表2 背角無齒蚌ρ-GST與其他物種GST序列同源性比較Table 2 Percentage of identity respectively for pairwise alignment of ρ-GST protein sequences between Anodonta woodiana and other species

注：HdGST為皺紋盤鮑谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A(ABO26605.1)，CgGST為長牡蠣谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(EKC36795.1)，AfGST為櫛孔扇貝(Azumapectenfarreri)ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(ACF25903.1)，LeGST為南極帽貝ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(ACM44933.1)，RpGST為菲律賓蛤仔ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(AEW46331.1)，DrGST為斑馬魚(Daniorerio)ρ型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(NP_001038525.1)。

Note: HdGST isHaliotisdiscusdiscusglutathione S-transferase A (ABO26605.1); CgGST isCrassostreagigasglutathione S-transferase A (EKC36795.1); AfGST isAzumapectenfarrerirho-class glutathione S-transferase (ACF25903.1); LeGST isLaternulaellipticarho-class glutathione S-transferase (ACM44933.1); RpGST isRuditapesphilippinarumrho-class glutathione S-transferase (AEW46331.1); DrGST isDanioreriorho-class glutathione S-transferase (NP_001038525.1).

圖4 背角無齒蚌ρ-GST氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of ρ-GST of Anodonta woodiana according to neighborhood-joining method

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，背角無齒蚌ρ-GST與軟體動(dòng)物谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A類群和ρ型GST親緣關(guān)系較近，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A類群和ρ型GST分為了一組(圖4)。研究結(jié)果顯示，從選擇的物種中，同一類型GST的不同個(gè)體之間保持較高的bootstrap值，特別是在θ型GST中，昆蟲家蠶(Bombyxmori)和脊椎動(dòng)物之間bootstrap值達(dá)到99%。值得注意的是，2種類型GST之間，bootstrap值明顯減小，如ω型GST和ζ型GST、ω型GST和δ型GST、ζ型GST和σ型GST等。

2.4 背角無齒蚌ρ-GST表達(dá)水平的組織分布

背角無齒蚌ρ-GST廣泛表達(dá)于斧足、外套膜、閉殼肌、心臟、肝胰腺、血淋巴和鰓(圖5)。背角無齒蚌ρ-GST在肝胰腺中表達(dá)水平最高，在鰓、血淋巴、心臟、斧足和閉殼肌中次之，外套膜中表達(dá)水平較低(圖5)。

圖5 背角無齒蚌ρ-GST基因的空間表達(dá)注：每組數(shù)據(jù)來源于5只動(dòng)物。Fig. 5 Real-time PCR analysis of ρ-GST transcript from different tissues of Anodonta woodianaNote: n = 5 replicates.

2.5 PCP對(duì)背角無齒蚌ρ-GST表達(dá)的影響

在肝胰腺中，與第0天相比，背角無齒蚌ρ-GST表達(dá)在第1～15天出現(xiàn)了明顯的波動(dòng)。PCP處理對(duì)背角無齒蚌ρ-GST表達(dá)具有顯著影響。PCP處理后背角無齒蚌ρ-GST mRNA水平呈現(xiàn)時(shí)間依賴的上調(diào)模式。與對(duì)照組相比，ρ-GST表達(dá)水平在第1天、第3天和第15天分別增加18.18%、82.88%(P<0.05)和2.43倍(P<0.01) (圖6)。與對(duì)照組相比，PCP處理后背角無齒蚌鰓中ρ-GST表達(dá)水平增加了1.44倍以上(P<0.05) (圖7)。與對(duì)照組相比，PCP處理后背角無齒蚌血淋巴中ρ-GST表達(dá)水平在第3至15天顯著升高(圖8)。

圖6 五氯苯酚(PCP)對(duì)背角無齒蚌肝胰腺ρ-GST基因表達(dá)的影響注： n=5/組/時(shí)間點(diǎn)；*、**表示與相應(yīng)對(duì)照組相比，有顯著差異(P<0.05、P<0.01)；#表示與0 d相比，有顯著差異(P<0.05)。Fig. 6 Temporal expression of ρ-GST in hepatopancreas of Anodonta woodiana after pentachlorophenol (PCP) challenge as measured by quantitative real-time RT-PCRNote: Bars represent means ± SE; n=5/each group/each time point. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group at the same time. # P<0.05, ## P<0.01 vs control group at the day 0.

3 討論(Discussion)

ρ-GST有N端區(qū)域和C-端區(qū)域2個(gè)不同區(qū)域；多重序列比對(duì)表明，ρ-GST的N端G-位點(diǎn)相對(duì)保守，而C端多變，提示這些特征與GST的功能有關(guān)。一般來說，供GSH結(jié)合的G位點(diǎn)具有高度特異性包含11個(gè)高度保守氨基酸：Tyr7、Arg13、Trp38、Lys46、Gln53、Leu54、Pro55、Gln66、Ser67、Glu98和Asp99[17-18]。前期研究表明，Tyr在穩(wěn)定結(jié)合GSH方面發(fā)揮重要作用[17-18]，提示ρ-GST的N端保守氨基酸殘基有助于結(jié)合GSH。H-位點(diǎn)是親電底物的結(jié)合點(diǎn)，C端的H-位點(diǎn)相對(duì)多變與適應(yīng)更廣泛底物的結(jié)構(gòu)有關(guān)[19-20]。

圖7 PCP對(duì)背角無齒蚌鰓ρ-GST基因表達(dá)的影響注：n=5/組/時(shí)間點(diǎn)；*、**表示與相應(yīng)對(duì)照組相比，有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Temporal expression of ρ-GST in gill of Anodonta woodiana after PCP challenge as measured by quantitative real-time RT-PCRNote: Bars represent means ± SE; n=5/each group/each time point. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group at the same time.

圖8 PCP對(duì)背角無齒蚌血淋巴ρ-GST基因表達(dá)的影響注：n=5/組/時(shí)間點(diǎn)；*、**表示與相應(yīng)對(duì)照組相比，有顯著差異(P<0.05、P<0.01)；#表示與0 d相比，有顯著差異(P<0.05)。Fig. 8 Temporal expression of ρ-GST in hemocytes of Anodonta woodiana after PCP challenge as measured by quantitative real-time RT-PCRNote: Bars represent means ± SE; n=5/each group/each time point. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group at the same time. # P<0.05 vs control group at the day 0.

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，ρ-GST氨基酸序列與長牡蠣和腹足綱皺紋盤鮑GST-A序列很相似，并與ρ型GST具有高度同源性?；谙到y(tǒng)進(jìn)化分析數(shù)據(jù)和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，ρ-GST應(yīng)歸為ρ型GST。研究已表明，序列相似性程度在GST分類中沒有明確標(biāo)準(zhǔn)，GST同工酶的演化關(guān)系仍然存在廣泛爭(zhēng)議[21]。大家普遍認(rèn)為，在一類GST個(gè)體中同源性超過40%劃分為一個(gè)類群，同源性小于25%類群劃分為其他類群[21]。θ類GST第一個(gè)關(guān)于子家族演化的描述表明，θ類GST在從有氧細(xì)菌到更高真核生物中都存在，呈現(xiàn)廣泛分布，序列具有高度保守性，是較為原始的類群[22]。σ類GST是從哺乳動(dòng)物α、μ和π這3個(gè)類群中分離出來的，ρ和θ從α、μ、ρ和θ中分離出來[23]。由此可見，GST類群進(jìn)化經(jīng)歷了從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的復(fù)雜里程。

背角無齒蚌ρ-GST在肝胰腺中表達(dá)水平最高，在鰓、血淋巴、心臟、斧足和閉殼肌內(nèi)中等表達(dá)，在外套膜表達(dá)水平較低，這提示ρ-GST這種表達(dá)模式可能與清除活性氧以及維持氧化和抗氧化細(xì)胞之間平衡有關(guān)。正常情況下，活性氧簇(ROS)保持相對(duì)較低水平，ROS會(huì)被一系列抗氧化劑酶迅速消除，以維持ROS水平和抗氧化劑酶活性之間的均衡。在雙殼類動(dòng)物，肝胰腺是重要代謝器官，在解毒和外源性物質(zhì)的降解方面發(fā)揮重要的作用[24]。軟體動(dòng)物GST能降解水體農(nóng)藥、有機(jī)污染物和其他有毒化學(xué)物質(zhì)[25]。因此，肝胰腺ρ-GST mRNA水平高表達(dá)與環(huán)境中出現(xiàn)外源性有毒物質(zhì)降解有關(guān)。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，PCP明顯誘導(dǎo)背角無齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中ρ-GST的表達(dá)，提示ρ-GST表達(dá)水平上調(diào)有助于參與PCP解毒過程和抗氧化過程。對(duì)于機(jī)體而言，ROS主要包括過氧化物陰離子、過氧化氫、烷基過氧化物、單線態(tài)氧和羥基自由基[26]。背角無齒蚌是濾食性淡水動(dòng)物，PCP易沉積和過量積累在其體內(nèi)，可以催化生成ROS[3-4]。GST廣泛分布在所有活細(xì)胞中并參與機(jī)體有毒物質(zhì)降解，GST通過與毒素結(jié)合，能夠主動(dòng)或者被動(dòng)地與致癌物、治療制劑和氧化應(yīng)激產(chǎn)物等外源性/內(nèi)源性有毒物質(zhì)結(jié)合[27-28]，促進(jìn)細(xì)胞排毒和自我保護(hù)的作用。研究表明，正常情況下GST持續(xù)表達(dá)與機(jī)體解毒密切相關(guān)，而GST的高表達(dá)參與保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)源性氧化應(yīng)激的影響[27-29]。已有研究表明，諸多外界因素誘導(dǎo)GST表達(dá)，GST被認(rèn)為是一種對(duì)抗異種生物化學(xué)毒性的有效解毒酶。高水平GST與農(nóng)藥降解密切有關(guān)[30-31]。褐飛虱(Nilaparvatalugens)GST水平增高有助于抵抗氧化損傷，保護(hù)組織[32]。綜上所述，背角無齒蚌中ρ-GST表達(dá)上調(diào)在降低PCP導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著積極作用。

PCP處理后ρ-GST表達(dá)水平在不同組織表現(xiàn)出不同特征。對(duì)于該現(xiàn)象，一種解釋可能與這些組織不同生理功能有關(guān)。軟體動(dòng)物肝胰腺具有肝和胰腺雙重功能，參與消化和中和大量有毒物質(zhì)[33-34]。鰓位于殼腔內(nèi)，通過水體流動(dòng)實(shí)現(xiàn)呼吸功能，直接與外部環(huán)境接觸，上皮組織非常薄[35]，鰓也是環(huán)境污染物作用的重要靶器官之一[36]。雙殼類血淋巴是防御病原侵染的重要防線，也是減少ROS生成的重要防線，通過吞噬作用和呼吸爆發(fā)過程消除環(huán)境污染物[37]。眾所周知，呼吸爆發(fā)過程與雙殼類血淋巴中重金屬和污染物所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[37-38]。呼吸爆發(fā)在消除重金屬和污染物產(chǎn)生的毒性方面起著潛在的作用，一些復(fù)雜因素可能參與肝胰腺、鰓和血淋巴中ρ-GST表達(dá)調(diào)控。另一種解釋是ρ-GST可能在不同的組織和不同的發(fā)育階段扮演不同的角色。

與脊椎動(dòng)物相比，軟體動(dòng)物主要依靠自身的免疫能力，而血淋巴細(xì)胞是先天防御措施的主要途徑之一。維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)是一個(gè)復(fù)雜過程，需要多個(gè)器官參與。在環(huán)境壓力下，一系列抗氧化酶表達(dá)在其中發(fā)揮重要的作用，高表達(dá)涉及保護(hù)細(xì)胞，抵抗內(nèi)源性氧化應(yīng)激。背角無齒蚌ρ-GST在肝胰腺、鰓和血淋巴中表達(dá)顯著增加有助于清除PCP處理產(chǎn)生的ROS，提高細(xì)胞氧化應(yīng)激能力，實(shí)現(xiàn)機(jī)體穩(wěn)態(tài)。