淡水雙殼類背角無齒蚌AwHSP70基因克隆及多溴聯(lián)苯醚-47對其表達的影響

薛士鵬，王涵，宋國英，華春秀，于瑞雪，劉慶春，王中曉，張慶遠，劉麗，李冰潔，夏西超,,*

1. 南陽醫(yī)學高等?？茖W校基礎(chǔ)醫(yī)學部，南陽 473061 2. 平頂山學院醫(yī)學院，平頂山 476000

熱休克蛋白(HSP)是一個超基因家族，在調(diào)節(jié)機體應(yīng)激反應(yīng)和耐受性方面發(fā)揮重要作用[1-2]。在正常和應(yīng)激條件下，HSP幫助蛋白質(zhì)折疊、膜轉(zhuǎn)位和錯誤折疊蛋白質(zhì)降解等方面具有積極作用[3-4]。根據(jù)其分子量不同，HSP可以分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP20等5個家族，HSP70是最為保守且研究相對廣泛的家族之一[5-6]。HSP70對環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)性較為敏感，溫度、氧化應(yīng)激、重金屬、能量代謝抑制劑、紫外線和輻射、病毒、細菌和寄生蟲感染均可誘導HSP70表達，以增強機體的耐受能力[7-9]。多聯(lián)苯醚(PBDE)是常見淡水持久性有機污染物，具有持久性和高生物蓄積的特點，已經(jīng)引起學者的極大關(guān)注[10]。PBDE-47是水體中最豐富的有機污染物，其生物毒性顯著強于其他溴化化合物[11]。我們前期的研究結(jié)果表明，PBDE-47可能導致淡水背角無齒蚌機體應(yīng)激反應(yīng)并產(chǎn)生急性毒性效應(yīng)，具體機制有待進一步探究。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出AwHSP70完整基因序列，通過real-time PCR分析AwHSP70表達，為揭示PBDE-47毒性效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產(chǎn)市場，殼長(6.5±0.5) cm，處理之前，動物置于實驗室自動水循環(huán)系統(tǒng)中適應(yīng)養(yǎng)殖2周。PBDE-47(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶解于二甲亞砜(DMSO)制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒(40 cm×25 cm，高10 cm)中進行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[10]。為了確定AwHSP70組織分布，對來自同一塑料盒5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。根據(jù)上述動物處理方法，將80只河蚌隨機飼養(yǎng)于10個塑料盒中，每盒8只，分為對照組和PBDE-47處理組，每組5個盒子。PBDE-47處理組采用3.36 μg·L-1的PBDE-47進行處理，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。第0、1、3、6、9、12和15天從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物工程(大連)有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應(yīng)模板。

1.2.2 背角無齒蚌AwHSP70核心片段的擴增

簡并引物AwHSP71和AwHSP72分離AwHSP70 cDNA保守區(qū)域片段，PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，雙向測序。確定HSP70部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設(shè)計的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，擴增AwHSP70 cDNA 5’和3’區(qū)域序列，5’Race和3’Race的PCR產(chǎn)物進行測序和拼接。

1.2.3 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

分析AwHSP70序列，通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST程序比對；根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP預(yù)測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)wHSP70基因進行多序列比對；通過Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測AwHSP70的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4AwHSP70 mRNA水平定量檢測

為了確定AwHSP70轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)AwHSP70-F和AwHSP70-R引物常用PCR儀中的分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳檢測出一個條帶，并進行PCR產(chǎn)物測序和序列鑒別。使用ABI7500實時檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進行real-time PCR分析，構(gòu)建標準曲線，通過2-△△CT分析AwHSP70表達水平。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 背角無齒蚌AwHSP70基因的cDNA及預(yù)測蛋白質(zhì)序列分析

AwHSP70 cDNA序列由2 305 bp核苷酸序組成，全長cDNA包含1個67 bp的5’-端非編碼區(qū)、1個267 bp的5’-端非編碼區(qū)和1個1 971 bp的開放閱讀框。開放閱讀框為由657個氨基酸組成的多肽，分子量為71.57 kDa，理論等電點為5.61(圖1)。AwHSP70具有HSP70家族3個標簽序列(7-IDIDLGTTYSLGTTYSCV-16、197-IFDLGGGTFDVSIL-210和334-IVLVGGSTRIPKV-348)，ATP/GTP結(jié)合位點為131-AEAYLGQR-137，核定位信號區(qū)域為246-KRKHKKDISDNKRSVRR-262，另有C末端高度保守的EEVD序列和重復序列GGXP(圖1)。

2.2 背角無齒蚌AwHSP70的進化關(guān)系

BLAST分析顯示，AwHSP70的氨基酸序列與HSP70家族成員具有顯著相似性，與三角帆蚌和光滑雙臍螺同源性分別為98.63%和88.43%。AwHSP70與模式生物小鼠、斑馬魚、非洲爪蟾、水蚤和果蠅同源性分別為86.76%、85.54%、81.76%、81.91%和71.88%。為了分析AwHSP70的進化關(guān)系，分別從脊椎動物和無脊椎動物物種中選擇HSP70家族的不同成員，通過MEGA5.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。AwHSP70與雙殼類和腹足綱動物親緣關(guān)系最近，昆蟲、甲殼動物和哺乳動物次之，脊椎動物較遠，細菌親緣關(guān)系最遠(圖2)。

圖2 根據(jù)背角無齒蚌AwHSP70氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed by adjacency method according to the Anodonta woodiana AwHSP70 amino acid sequence

2.3 背角無齒蚌AwHSP70 mRNA的組織分布

組織分布結(jié)果顯示，AwHSP70廣泛表達于背角無齒蚌斧足、鰓、心臟、肝胰臟、血淋巴、閉殼肌和外套膜(圖3)。上述組織中，AwHSP70 mRNA在肝胰臟中表達水平最高，鰓和血細胞次之，心臟、閉殼肌、外套膜和斧足最低(圖3)。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 PCR amplified primer sequence

圖3 背角無齒蚌AwHSP70基因的空間表達注：每組數(shù)據(jù)來源于5只動物，重復3次。Fig. 3 The spatial expression of Anodonta woodiana AwHSP70 geneNote: Each group data was derived from five animals and the experiment was repeated three times.

2.4 PBDE-47對背角無齒蚌AwHSP70表達的影響

正常條件下，AwHSP70在背角無齒蚌肝胰臟、鰓和血淋巴表達穩(wěn)定，PBDE-47處理組中AwHSP70表達水平受到顯著影響。1～15 d內(nèi)，PBDE-47處理后肝胰臟中AwHSP70 mRNA水平隨時間顯著上調(diào)(圖4)；與對照組相比，AwHSP70 mRNA水平在第1天增加2.79倍(P<0.01)，第15天增加13.15倍(P<0.01)(圖4A)。PBDE-47處理后，與對照組相比，鰓中AwHSP70表達水平顯著上調(diào)；且變化趨勢呈現(xiàn)倒U字形，1～6 d內(nèi)AwHSP70表達水平顯著上調(diào)，第6天達到峰值，6～15 d內(nèi)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(圖4B)。與對照組相比，第1天后血淋巴中AwHSP70 mRNA水平增加了1.81倍(P<0.05)(圖4C)。

圖4 PBDE-47對背角無齒蚌肝胰腺AwHSP70基因表達的影響注：A 肝胰腺，B 腮，C 血淋巴；n=5，*、**表示與相應(yīng)對照組相比差異顯著(P<0.05、P<0.01)。Fig. 4 The effect of PBDE-47 on AwHSP70 gene expression in Anodonta woodiana hepatopancreasNote: A, hepatopancreas; B, gill; C, hemolymph; n=5; *, **indicates a significant difference compared with the corresponding control group (P<0.05, P<0.01).

3 討論(Discussion)

在AwHSP70蛋白質(zhì)序列中包括HSP70家族的保守結(jié)構(gòu)域和特征性序列，如：HSP70標簽序列1、2和3，細胞核定位信號、ATP/GTP結(jié)合位點序列、C末端最后4個氨基酸形成EEVD特定基序，提示AwHSP70是一種胞漿類型熱休克蛋白。根據(jù)HSP70家族特征序列和細胞中的分布，可將HSP70劃分為不同類型。EEVD保守結(jié)構(gòu)被視為胞漿類型熱休克蛋白與其他類型區(qū)別的關(guān)鍵標志。HSP70的GGMP氨基酸重復結(jié)構(gòu)域能夠促進HSP90和其他輔助分子與其形成多分子伴侶復合體[12-13]。GGMP重復區(qū)域還參與蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和螺旋亞結(jié)構(gòu)域形成，在介導輔助因子與分子伴侶結(jié)合方面發(fā)揮重要作用[14]。由此可見，GGMP在AwHSP70形成的連續(xù)重復區(qū)域可能在多分子伴侶復合體形成和輔助因子識別方面發(fā)揮重要作用。值得注意的是，AwHSP70氨基酸序列與其他HSP70家族成員具有高度同源性，但UTR核苷酸序列卻各不相同，推測HSP70的UTR核苷酸序列差異性可能與不同物種HSP70轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復雜性有關(guān)。

序列比對和系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，從軟體動物到昆蟲，以及到脊椎動物，HSP70譜系高度保守。背角無齒蚌和三角帆蚌存在更為親近的親緣關(guān)系，提示二者在進化上來自同一個祖先。背角無齒蚌AwHSP70 mRNA具有廣泛的分布，提示這種分布模式與AwHSP70參與環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)和提高耐受性相關(guān)。肝胰臟是軟體動物主要的消化、吸收和分泌器官，不斷接觸溫度、pH和水體成分等變化，對環(huán)境改變敏感[15]。鰓是動物的呼吸器官，環(huán)境中污染物主要入口之一，并與污染物直接接觸[16]。雙殼類微循環(huán)系統(tǒng)是一個淋巴細胞和血細胞混合在一起的開放式循環(huán)系統(tǒng)，淋巴細胞和血細胞在淋巴管、血竇以及全身軟組織中流通。黏膜組織中淋巴細胞和血細胞填盈充足，與這些器官與周圍環(huán)境進行氧氣交換或營養(yǎng)素提取有關(guān)。血淋巴是應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激的重要防線[17]。肝胰臟、鰓和血細胞在維護動物穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是環(huán)境因素作用的關(guān)鍵靶器官。肝胰臟、鰓和血淋巴中的AwHSP70表達水平相對較高，提示這種分布模式很可能與器官功能有關(guān)。

在本研究中，PBDE-47處理能夠誘導肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP70表達，提示背角無齒蚌能夠通過上調(diào)AwHSP70表達提高對PBDE-47暴露的適應(yīng)能力和耐受能力。背角無齒蚌作為一種濾食性淡水生物，靠過濾水體中營養(yǎng)物質(zhì)來維持生存。PBDE具有較高親脂性，水中溶解的PBDE很容易蓄積在細胞中，導致活性氧(ROS)大量產(chǎn)生。正常情況下，ROS很快被一系列抗氧化酶清除，維持在一個合理水平。在應(yīng)激環(huán)境中，過量生成ROS引起DNA損傷、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)糖基化，導致蛋白質(zhì)錯誤折疊可能性增加。HSP70表達上調(diào)有助于幫助錯誤折疊蛋白質(zhì)進行修復和轉(zhuǎn)膜，并促進錯誤折疊白質(zhì)降解，提高機體環(huán)境適應(yīng)性和耐受性。與其他熱休克蛋白家族相比，HSP70研究較為廣泛且對環(huán)境應(yīng)激較為敏感。暴露于重金屬和多環(huán)芳烴類后，紫貽扇貝能夠上調(diào)HSP70表達提高對污染物的耐受能力[18]。蝦夷扇貝暴露于麻痹性貝類毒素后，能夠增加HSP70表達水平以增強毒性應(yīng)激的適應(yīng)能力[19]。高溫條件下，太平洋牡蠣通過增加HSP70表達來提高自身對高溫的適應(yīng)能力[20]?？挂钟粜退幬锓魍√幚砗螅油樝僦蠬SP70 mRNA表達水平上調(diào)[21]。研究證實，一些蚌類HSP70表達可被重金屬激活，該過程是金屬硫蛋白調(diào)控途徑的重要環(huán)節(jié)之一[22-27]。干擾機體蛋白質(zhì)正確折疊是環(huán)境因素和污染物干擾機體功能的重要路徑之一，而激活HSP表達是動物提高環(huán)境適應(yīng)能力的關(guān)鍵策略[28]。由此，AwHSP70表達上調(diào)是背角無齒蚌應(yīng)對PBDE-47引起的氧化應(yīng)激重要手段之一。

PBDE-47處理后，肝胰臟中AwHSP70 mRNA水平上調(diào)表現(xiàn)出時間依賴模式，提示這種模式與動物的代償機制相關(guān)。動物長期暴露在PBDE-47環(huán)境中，機體通過適應(yīng)性機制處理應(yīng)激效應(yīng)，并逐漸恢復細胞穩(wěn)態(tài)。作為一種細胞內(nèi)的分子伴侶，HSP70參與細胞內(nèi)外免疫調(diào)控并保護細胞免受環(huán)境應(yīng)激損害，HSP70表達常表現(xiàn)出時間和劑量依賴性模式。銅、鎘和180CST燃料油等重金屬和其他化學物質(zhì)處理后，紫貽扇貝肝胰臟中HSP70表現(xiàn)出時間依賴性的上調(diào)模式。渦鞭毛蟲毒素處理蝦夷扇貝后，HSP70表達水平呈現(xiàn)出時間依賴性上調(diào)模式。太平洋牡蠣高溫條件下HSP70表達水平呈時間依賴性上調(diào)模式。苯并芘處理后，菲律賓哈仔消化腺中HSP70和HSP90表達水平顯著上調(diào)，其絕對表達水平呈現(xiàn)時間和劑量依賴性反應(yīng)。

整個實驗過程中，背角無齒蚌鰓中AwHSP70表達呈現(xiàn)倒U型曲線，早期上調(diào)，中期達到峰值，晚期下降，提示這種現(xiàn)象可能與動物應(yīng)對持續(xù)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的耐受能力有關(guān)。隨著PBDE-47處理時間延長，PBDE-47在體內(nèi)不斷蓄積，將不斷產(chǎn)生ROS，導致細胞應(yīng)對不斷增加的氧化應(yīng)激效應(yīng)。機體通過上調(diào)HSP表達的方式減少錯折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，增強耐受性[29]。一旦PBDE-47處理后氧化應(yīng)激水平達到峰值并超出細胞耐受能力，巨大應(yīng)激效應(yīng)將導致慢性損傷、炎癥和細胞凋亡[30-31]。這種情況下，如果動物喪失產(chǎn)生新細胞去補償死亡細胞的能力，活細胞數(shù)量將逐漸降低[32-33]。由此，PBDE-47處理后AwHSP70表達水平呈現(xiàn)出倒U型曲線變化趨勢。

值得注意的是，水蚤LC50急性毒性結(jié)果顯示，PBDE-28、PBDE-47、PBDE-99和PBDE-100呈現(xiàn)出不同的毒性效應(yīng)，其原因與這些物質(zhì)的親脂性有關(guān)。其中PBDE-47、PBDE-99和PBDE-100具有明顯的高親脂性，呈現(xiàn)出較強的毒性效應(yīng)[34]。由此，為了系統(tǒng)分析PBDE-47對背膠無齒蚌和淡水生物的毒性效應(yīng)，需要從多個基因靶點和多個靶組織予以分析。總之，本研究首次從背角無齒蚌中克隆出AwHSP70 cDNA序列，該序列包含HSP70家族高度保守的標簽序列。PBDE-47處理可顯著上調(diào)肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP70表達水平，AwHSP70轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)與提高動物的耐受性和適應(yīng)能力密切有關(guān)。