有機(jī)磷酸酯對(duì)斑馬魚的早期神經(jīng)毒性作用研究

顧杰，吳江，王宏燁，石利利，吉貴祥,*

1. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 教育部現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166

有機(jī)磷酸酯(organophosphate esters, OPEs)是一類重要的阻燃劑和塑化劑，廣泛應(yīng)用于化工、電子、建材以及紡織等行業(yè)。近年來(lái)，由于多溴聯(lián)苯醚類阻燃劑在全球范圍內(nèi)的逐步禁用，作為替代品的有機(jī)磷酸酯阻燃劑生產(chǎn)量大幅增加，使用范圍日趨廣泛[1-2]。2011年，有機(jī)磷阻燃劑在歐洲的銷售量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了溴代阻燃劑。全球OPEs產(chǎn)量從1992年的約10萬(wàn)t增加到2007年的34.1萬(wàn)t[3]。北美的磷酸三(2-氯異丙基)酯(TCPP)和已被列入歐盟高關(guān)注度物質(zhì)的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)的產(chǎn)量從1986年不足1.4萬(wàn)t，于2012年增至超過(guò)3.8萬(wàn)t[4]，此外，我國(guó)在2007年有機(jī)磷酸類物質(zhì)年均生產(chǎn)量接近7萬(wàn)t，且每年增長(zhǎng)速度達(dá)到15%[5]。

由于OPEs在使用中主要以簡(jiǎn)單的物理添加而非化學(xué)鍵合方式加入到材料中，使其極易在材料使用過(guò)程中釋放到周圍環(huán)境中，造成環(huán)境污染[6-7]，且在環(huán)境中具有持久性[8]。自然環(huán)境中的OPEs含量的高值已達(dá)到μg·L-1或μg·kg-1級(jí)別[8-11]。劉靜等[12]研究珠江主干和東江河流沉積物發(fā)現(xiàn)，珠江主干主要污染物為磷酸三(丁氧基乙基)酯(TBEP)，其次為磷酸三丁酯(TBP)和磷酸三(2-氯)乙酯(TCEP)，均值分別為84.6、55.6和27.8 ng·g-1；東江河段沉積物中以磷酸三甲苯酯(TTP)、磷酸三苯酯(TPhP)和TBEP為主要污染物，平均濃度分別為55.6、32.7和17.5 ng·g-1。高小中等[13]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)幾條較大河流，長(zhǎng)江、東江和珠江中OPEs的濃度分別為4.2～86.6、5.5～76.4和11.6～178.5 ng·L-1。研究顯示，TCEP在我國(guó)松花江和太湖水體中的濃度分別達(dá)到3 700和688 ng·L-1，遠(yuǎn)超過(guò)德國(guó)萊茵河和英國(guó)亞耳河中的濃度[14]；我國(guó)珠江三角洲魚體內(nèi)檢出了高濃度磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)(1 647～8 840 ng·g-1脂重)、TCEP(82.7～4 690 ng·g-1脂重)和磷酸三丁酯(TnBP)(43.9～2 950 ng·g-1脂重)，與在珠江三角洲附近水域中檢出高濃度OPEs的情況相符[14]。上述研究結(jié)果表明，目前我國(guó)OPEs的污染情況日益嚴(yán)重。

大量毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多種OPEs具有明顯的毒性效應(yīng)。例如，Liu等[15]發(fā)現(xiàn)磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCIPP)對(duì)于斑馬魚具有肝臟毒性，會(huì)顯著提高多種肝臟毒性生物標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄，并且可以通過(guò)改變類固醇生成或雌激素代謝等多種方式對(duì)人體細(xì)胞和斑馬魚產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)環(huán)境中的OPEs會(huì)影響人體激素水平和男性精液質(zhì)量[17]。高丹等[18]研究發(fā)現(xiàn)，4種有機(jī)磷阻燃劑濃度與斑馬魚胚胎的孵化率、存活率、心率和體長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與異常率呈正相關(guān)關(guān)系。

OPEs在結(jié)構(gòu)上與有機(jī)磷農(nóng)藥相類似，而有機(jī)磷農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性，但是有機(jī)磷酸酯的神經(jīng)毒性研究甚少，因此，有機(jī)磷酸酯是否具有神經(jīng)毒性也值得關(guān)注。本文以斑馬魚作為模式動(dòng)物，通過(guò)對(duì)斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為軌跡、氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的研究，來(lái)探討3種有機(jī)磷酸酯阻燃劑，即磷酸三苯酯(TPP)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)和TCEP，對(duì)斑馬魚幼魚的早期神經(jīng)毒性，從而為有機(jī)磷酸酯類阻燃劑及其替代產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用和危險(xiǎn)度評(píng)估提供直接依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試劑：磷酸三苯酯(triphenylphosphate, TPP)純度為99%，CAS為115-86-6；2-乙基己基二苯基磷酸酯(2-ethylhexyl diphenyl phosphate, EHDPP)純度為99%，CAS為1241-94-7；磷酸三(2-氯乙基)酯(tris(2-chloroethyl)phosphate, TCEP)，純度為97%，CAS為115-96-8；陽(yáng)性對(duì)照毒死蜱(chlorpyrifos, CPF)，純度為99%，CAS為2921-88-2；以上試劑購(gòu)自百靈威公司。過(guò)氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

儀器：Infinite M200型酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)；水質(zhì)參數(shù)儀(HQ40d，美國(guó)哈希公司)；熒光定量PCR儀(ABI-7300，美國(guó))；斑馬魚行為軌跡分析儀(Noldus，荷蘭)。

1.2 魚卵收集

本研究中使用的斑馬魚品系均為AB野生型，親魚購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，養(yǎng)殖用水為曝氣自來(lái)水，水溫控制在25～29 ℃，溶解氧大于6 mg·L-1，光周期為14 h∶10 h(晝:夜)。斑馬魚親魚用剛孵化的豐年蟲每天投喂2次，及時(shí)清除多余的飼料和排泄物。在繁殖的前一天，雄魚和雌魚以2∶1的比例放入繁殖盒中，用隔板將繁殖盒中的親魚雌雄分開(kāi)。次日清晨，將繁殖盒中的隔板拆掉，在光照的刺激下，雄魚開(kāi)始追逐雌魚，雌魚開(kāi)始產(chǎn)卵，收集所產(chǎn)受精卵。在顯微鏡下挑選正常發(fā)育的受精卵用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗3次，用于暴露實(shí)驗(yàn)。

1.3 胚胎和幼魚毒性試驗(yàn)

以陽(yáng)性參照CPF(0.3 mg·L-1)、TPP(0.1和1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(0.5和5 mg·L-1)進(jìn)行暴露，濃度選擇參考Jin等[19]、Liu等[20]和Jarema等[21]的研究。CPF、TPP、EHDPP和TCEP用二甲基亞砜(DMSO)配制成母液，-20 ℃保存。

每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行。各濃度組及空白對(duì)照組均放斑馬魚胚胎90枚，以6孔板為實(shí)驗(yàn)容器，實(shí)驗(yàn)液體積為6 mL。為減少試驗(yàn)容器對(duì)藥物的吸附，實(shí)驗(yàn)前用相應(yīng)的試驗(yàn)藥物濃度的溶液浸泡試驗(yàn)容器12 h。胚胎收取后培養(yǎng)至受精后4 h(hour post fertilization, 4 hpf)，挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎進(jìn)行染毒，隨機(jī)分組暴露于對(duì)照組、DMSO溶劑組(體積比為0.01%的DMSO)、CPF(0.3 mg·L-1)、TPP、EHDPP和TCEP的處理組，各處理組DMSO的體積比均小于0.01%，連續(xù)暴露至第6天。間隔24 h更換新配制的暴露溶液，定時(shí)觀察受試對(duì)象的活動(dòng)狀況，及時(shí)取出死亡個(gè)體。斑馬魚不同生命階段的死亡標(biāo)準(zhǔn)如下，卵：特別是在早期階段，蛋白質(zhì)凝固和(或)沉降導(dǎo)致透明度下降，兼有顏色上的變化(白色不透明)；仔魚：靜止不動(dòng)，無(wú)呼吸運(yùn)動(dòng)，心跳停止，中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈白色不透明顏色，對(duì)機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)等。

1.4 斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為測(cè)試

根據(jù)Nery等[22]的實(shí)驗(yàn)方法，每個(gè)濃度組隨機(jī)選擇24條受精后6 d (days post fertilization, 6 dpf)的斑馬魚幼魚放入24孔板置于斑馬魚行為分析儀中進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為學(xué)測(cè)試，24孔板每孔加2 mL暴露液，主要測(cè)試幼魚在固定時(shí)間內(nèi)(50 min)自由游泳行為。受試魚在實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行10 min的適應(yīng)，實(shí)驗(yàn)后剔除不正常數(shù)據(jù)。使用EthoVision軟件分別采集50 min內(nèi)各組幼魚的運(yùn)動(dòng)軌跡，利用軟件導(dǎo)出運(yùn)動(dòng)行為距離和游泳時(shí)間，然后計(jì)算每組魚游泳的總距離，各數(shù)值分別計(jì)入統(tǒng)計(jì)。

1.5 氧化應(yīng)激酶活力的檢測(cè)

每個(gè)濃度組收集6 dpf期的幼魚各20條，加裂解液(RIPA Lysis Buffer)500 μL，冰上超聲破碎組織(時(shí)間3 s，間隔6 s，振幅50%)重復(fù)2次，共持續(xù)6 s，4 ℃、15 000 r·min-1離心10 min取上清，供CAT和SOD測(cè)量使用。勻漿液中蛋白含量用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定。取50 μL適量勻漿液，采用碧云天試劑盒檢測(cè)SOD和CAT活力。CAT活性單位定義：每毫克組織蛋白中過(guò)氧化氫酶每秒分解吸光度為0.50～0.55的底物中的過(guò)氧化氫相對(duì)量為一個(gè)過(guò)氧化氫酶的活力單位(U·mg protein-1)。SOD酶活力單位的定義：在黃嘌呤氧化酶耦聯(lián)反應(yīng)體系中抑制率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U·mg protein-1)。

1.6 神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)

采用熒光定量PCR測(cè)定方法，利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)并合成神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因包括髓磷脂堿性蛋白基因(mbp)和突觸蛋白基因(syn2a)以及內(nèi)參照基因(β-actin)的Real-time PCR引物。每個(gè)濃度組收集6 dpf期的幼魚各20條，提取幼魚總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)有機(jī)磷酸酯暴露對(duì)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的影響，基因的引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.7 數(shù)據(jù)處理

先采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)發(fā)現(xiàn)各組均數(shù)不全相等，再用dunnett檢驗(yàn)法比較分析有機(jī)磷酸酯對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為距離、SOD、CAT活性和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計(jì)分析，使用SAS統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)(version 9.13, SAS Institute, Cary, NC)進(jìn)行，設(shè)P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 有機(jī)磷酸酯對(duì)斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響

受精卵連續(xù)暴露至第6天。如圖1所示，與對(duì)照組相比，6 dpf斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為除了0.1 mg·L-1TPP組，其余暴露組均抑制了斑馬魚幼魚行為運(yùn)動(dòng)的總距離，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 有機(jī)磷酸酯(OPEs)暴露對(duì)斑馬魚幼魚(6 dpf)運(yùn)動(dòng)行為的影響注：(a). 不同暴露組斑馬魚幼魚行為軌跡；(b). 不同暴露組斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)總距離；CPF表示毒死蜱，TPP表示磷酸三苯酯，EHDPP表示2-乙基己基二苯基磷酸酯，TCEP表示磷酸三(2-氯)乙酯；* P<0.05、** P< 0.01、***P<0.001。Fig. 1 The organophosphate esters (OPEs) exposure affected the locomotion behavior of 6 dpf zebrafish larvaeNote: (a). Behavior track of zebrafish larvae in different exposure groups; (b). Total movement distance of zebrafish larvae in different exposure groups; CFP stands for chlorpyrifos; TPP stands for triphenylphosphate; EHDPP stands for 2-ethylhexyl diphenyl phosphate; TCEP stands for tris(2-chloroethyl)phosphate; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.2 有機(jī)磷酸酯對(duì)斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激的影響

如圖2(a)所示，與對(duì)照組相比，TPP(1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(0.5和5 mg·L-1)顯著抑制SOD的活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。如圖2(b)所示，與對(duì)照組相比，TPP(1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(5 mg·L-1)可抑制CAT的活性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組CPF(0.3 mg·L-1)的CAT和SOD的活性略有下降，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 有機(jī)磷酸酯暴露對(duì)斑馬魚幼魚超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的影響注：*P<0.05、** P<0.01、***P<0.001。Fig. 2 OPEs expsoure altered the levels of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity in zebrafish larvaeNote: *P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.001.

2.3 有機(jī)磷酸酯對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的影響

在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的mbp通常作為斑馬魚和人類的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中樞軸突髓鞘化的生物標(biāo)志物[23-24]。syn2a是哺乳動(dòng)物中形成突觸的生物標(biāo)志物，在突觸發(fā)生和神經(jīng)遞質(zhì)釋放中起重要作用[25]。如圖3(a)所示，與對(duì)照組相比，TPP(1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(5 mg·L-1)可抑制mbp基因的轉(zhuǎn)錄，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。如圖3(b)所示，與對(duì)照組相比，TPP(0.1和1 mg·L-1)、EHDPP(0.2和2 mg·L-1)和TCEP(0.5和5 mg·L-1)可以抑制syn2a基因的轉(zhuǎn)錄，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

隨著歐盟對(duì)溴代阻燃劑的禁用，有機(jī)磷酸酯阻燃劑作為新型阻燃劑產(chǎn)量持續(xù)快速增長(zhǎng)，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。作為一類新型污染物，OPEs已廣泛分布于各種環(huán)境介質(zhì)中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人體健康造成潛在威脅。OPEs與有機(jī)磷農(nóng)藥具有相似的分子結(jié)構(gòu)，提示其可能具有神經(jīng)毒性。然而，OPEs的神經(jīng)毒性的研究工作仍處于起步階段，對(duì)于OPEs如何引起神經(jīng)毒性的作用機(jī)制較少涉及。因此，針對(duì)OPEs的神經(jīng)毒性作用機(jī)制研究將有利于尋找OPEs神經(jīng)毒性作用的靶點(diǎn)，為OPEs的神經(jīng)毒性作用的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TPP、EHDPP和TCEP暴露對(duì)斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為具有抑制作用，其可能與氧化應(yīng)激和神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)有關(guān)。運(yùn)動(dòng)行為代表神經(jīng)控制的活動(dòng)系統(tǒng)，已被廣泛用于測(cè)試環(huán)境化學(xué)品的神經(jīng)毒性[26]。研究發(fā)現(xiàn)，TPP、EHDPP和TCEP暴露顯著抑制了斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)距離，提示TPP、EHDPP和TCEP可能介導(dǎo)了斑馬魚幼魚早期階段的神經(jīng)毒性。

氧化應(yīng)激是活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生與機(jī)體抗氧化能力的失衡引起的。在正常生理狀態(tài)下，ROS可被抗氧化防御系統(tǒng)有效清除，保障各種生理功能正常有序進(jìn)行；若兩者失衡，就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷。許多外源化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后可產(chǎn)生氧自由基，引起氧化損傷，這是引起細(xì)胞死亡的重要誘因。SOD將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，是抗氧化系統(tǒng)中的第一道防御屏障，而CAT催化過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化成水。本研究發(fā)現(xiàn)，SOD和CAT的活性在TPP、EHDPP和TCEP暴露后顯著降低，這與彭濤等[27]、龍鼎新等[28]和劉曉暉等[29]的研究結(jié)果相類似。因此，TPP、EHDPP和TCEP可能通過(guò)產(chǎn)生氧化損傷產(chǎn)生了神經(jīng)毒性。

圖3 有機(jī)磷酸酯對(duì)斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的影響注：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。Fig. 3 OPEs affected the expression of key genes for neurodevelopment in the zebrafish larvaeNote: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

此外，本研究還探討了OPEs暴露對(duì)神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的影響。在髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的mbp基因也被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)育的生物標(biāo)志物[23-24]，syn2a基因作為神經(jīng)遞質(zhì)釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑并涉及突觸發(fā)生[25]。Sun等[30]研究發(fā)現(xiàn)，3種有機(jī)磷酸酯(TNBP、TBOEP和TCEP)都會(huì)對(duì)抑制斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，同時(shí)均抑制了mbp和syn2a基因。He等[31]研究發(fā)現(xiàn)，甲胺磷抑制斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，也顯著下調(diào)了mbp和syn2a基因。本研究發(fā)現(xiàn)，TPP、EHDPP和TCEP顯著抑制mbp和syn2a基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)mbp基因可能抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步影響髓鞘的形成；下調(diào)syn2a可能會(huì)影響神經(jīng)分化和突觸形成，并最終導(dǎo)致神經(jīng)行為障礙。

綜上所述，斑馬魚幼魚在早期神經(jīng)發(fā)育階段暴露于TPP、EHDPP和TCEP可能會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和抑制神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性。