間充質(zhì)干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞融合實(shí)現(xiàn)汗腺再生的可行性研究

劉坤坤 趙亞平 高瑋 高慧 謝淼

汗腺作為皮膚重要的附屬器官，在體溫調(diào)節(jié)、體液平衡及物質(zhì)代謝等方面具有重要作用。由于深Ⅱ°以上燒傷創(chuàng)面皮膚附屬器官被破壞，無論是應(yīng)用自體皮片或組織工程皮膚封閉創(chuàng)面均無法使汗腺再生，導(dǎo)致大面積燒傷患者創(chuàng)面愈合后排汗、散熱困難，體內(nèi)熱量難以順利散發(fā)，嚴(yán)重影響患者工作及生活。如何實(shí)現(xiàn)大面積深度燒傷創(chuàng)面的汗腺重建，成為目前亟待解決一大難題。 目前部分學(xué)者用間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)成汗腺樣細(xì)胞取得了一定的初步成果，但是干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，機(jī)制尚不明確，方法尚不成熟且很難大量獲取汗腺樣細(xì)胞。需要進(jìn)一步尋找更容易在體外獲得大量具有分泌汗液細(xì)胞的新方法。再生醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢，近年來，隨著對(duì)細(xì)胞融合技術(shù)研究的深入，為解決這一難題提供了新的思路。有研究發(fā)現(xiàn)融合后的雜合細(xì)胞能夠同時(shí)表達(dá)兩個(gè)親本特性，這在再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)中具有很大的應(yīng)用潛能和治療價(jià)值[1]。因此，開展通過利用間充質(zhì)干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞的融合細(xì)胞來獲取大量具有能分泌汗液功能的細(xì)胞的研究，對(duì)促進(jìn)皮膚功能和結(jié)構(gòu)的生理性修復(fù)具有重大的意義。本文就目前干細(xì)胞/汗腺細(xì)胞融合體實(shí)現(xiàn)汗腺再生的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞融合技術(shù)

1.1 細(xì)胞融合技術(shù)的定義 細(xì)胞融合(cell fusion)也稱細(xì)胞雜交(cell hybridization),是指細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng)，在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通過無性方式融合(合并)成一個(gè)核或多個(gè)核的雜合細(xì)胞的工程。利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，把來自于不同種生物的單個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，這個(gè)新細(xì)胞(雜合細(xì)胞)得到了來自兩個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(包括細(xì)胞核的染色體組合和核外基因)，具有新的遺傳或生物特性?；具^程包括細(xì)胞融合形成異核體、異核體通過細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行核融合、最終形成單核的雜種細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展簡史 1965年英國科學(xué)家進(jìn)一步證實(shí)滅活病毒在合適條件下可以誘發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合，從而揭開了細(xì)胞融合技術(shù)的研究和開發(fā)。隨后相繼研究出三類成熟的細(xì)胞融合技術(shù)：(1)生物法：滅火病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合。利用某些病毒如：仙臺(tái)病毒、副流感病毒或者新城雞瘟病毒被膜中的融合蛋白可以介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞的融合，也可以介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的融合，因此可以利用紫外線滅活此類病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合。(2)化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)細(xì)胞融合 PEG可以破壞和干擾各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散，進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相鄰的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起，使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通，從而造成互相接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。(3)物理法：電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合和激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合[1-3]，電融合誘導(dǎo)法是指利用電場來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，在施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促使細(xì)胞融合的方法。自從1978年Zimmermann首先采用電脈沖方法成功地誘導(dǎo)了細(xì)胞電穿孔、電融合以來近三十年里,電穿孔和電融合技術(shù)不斷發(fā)展完善成為一門比較成熟的學(xué)科,得到非常廣泛地應(yīng)用。激光誘導(dǎo)融合是利用激光微束對(duì)相鄰細(xì)胞接觸區(qū)的細(xì)胞膜進(jìn)行破壞 (或擾動(dòng)),可將兩個(gè)不同特性、不同大小的細(xì)胞在顯微鏡下實(shí)現(xiàn)融合。即利用光鑷捕捉并拖動(dòng)一個(gè)細(xì)胞使之靠近另一個(gè)細(xì)胞并緊密接觸,然后對(duì)接觸處進(jìn)行脈沖激光束處理,使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿,產(chǎn)生微米級(jí)的微孔。這樣,由于質(zhì)膜上微孔的可逆性,細(xì)胞開始變形融合,最終成為一個(gè)細(xì)胞。1987 年和1989年德國海德堡理化研究所用準(zhǔn)分子激光器使油菜原生質(zhì)體融合,從開始照射到完成融合僅需幾秒鐘,對(duì)融合產(chǎn)物觀測,發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)仍在運(yùn)動(dòng),說明融合后的細(xì)胞仍能存活。

激光微束融合法與以前的病毒法、PEG法、電融合法相比較,可選擇任意兩個(gè)細(xì)胞進(jìn)行融合,易于實(shí)現(xiàn)特異性細(xì)胞融合,作用于細(xì)胞的應(yīng)力小,定時(shí)、定位性強(qiáng),損傷小,參數(shù)易于控制,操作方便,可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個(gè)融合過程,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好,無菌,無毒性。

1.3 目前細(xì)胞融合技術(shù)取得的成果 細(xì)胞融合作為細(xì)胞工程學(xué)中一項(xiàng)重要技術(shù)已在生物學(xué)各個(gè)分支科學(xué)及醫(yī)學(xué)中的腫瘤學(xué)，病毒學(xué)，免役學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。例：在醫(yī)學(xué)上現(xiàn)時(shí)最誘人的是單一特異性抗體的生產(chǎn)，1981年美國Hybriteck公司首先實(shí)現(xiàn)用單一特異抗體作臨床診斷[3]。在育種上,利用細(xì)胞融合技術(shù)將耐寒的馬鈴薯與不耐寒番茄的原生質(zhì)融合得到地上長番茄地下長馬鈴薯的新品種等，通過細(xì)胞融合技術(shù)已成功地進(jìn)行種內(nèi)、種間細(xì)胞的雜交，甚至打破植物之間的界限，取得了植物細(xì)胞原生活體與鼠的宮頸癌Hela細(xì)胞雜交的成功。動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)可用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系、揭示疾病發(fā)生的機(jī)制用于衰老機(jī)制研究；動(dòng)物細(xì)胞融合用于動(dòng)物育種。動(dòng)物體細(xì)胞融合后,雜種細(xì)胞一般難以發(fā)育再生為一個(gè)個(gè)體,但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核成熟卵內(nèi),可培育出新的雜種；動(dòng)物細(xì)胞融合用于生產(chǎn)單克隆抗體。有研究應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)和酶連免疫技術(shù)成功制備出一種新基因Urg11的抗體；動(dòng)物細(xì)胞融合用于細(xì)胞療法[3]。SCNT(somatic cell nu-clear transfer)將患者的任何體細(xì)胞與去核卵細(xì)胞融合,融合子進(jìn)行有絲分裂形成囊胚,囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是多能干細(xì)胞,對(duì)多能干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)使其定向分化可形成所需的組織和器官用于器官移植,不僅解決了器官和組織來源問題,而且避免了宿主對(duì)外來物的免疫排斥。經(jīng)過近幾十年的迅速發(fā)展，細(xì)胞融合技術(shù)成為了細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一，已在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果，而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。細(xì)胞融合技術(shù)不僅為核質(zhì)相互關(guān)系、基因調(diào)控、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、遺傳互補(bǔ)、腫瘤發(fā)生、基因定位、亞細(xì)胞生物分子研究、衰老控制等理念領(lǐng)域的研究提供了有力的手段，而且在遺傳學(xué)、動(dòng)植物遠(yuǎn)緣雜交育種、發(fā)生生物學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)以及醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等方面都有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。特別是在動(dòng)植物新品種的培育、單克隆抗體的制備、哺乳動(dòng)物的克隆以及抗癌疫苗的研發(fā)等技術(shù)中細(xì)胞融合技術(shù)已成為關(guān)鍵技術(shù)。

理論上可以說利用細(xì)胞融合技術(shù)可以使任何2個(gè)細(xì)胞通過體細(xì)胞雜交融合而形成新的生物資源。

1.4 通過利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得大量目的細(xì)胞的案例 沈繼紅等[4]利用細(xì)胞融合技術(shù),將生長迅速的異養(yǎng)微藻四鞭藻和富含EPA和DHA的自養(yǎng)微藻綠色巴夫藻相融合,并篩選出兼養(yǎng)的融合藻株。經(jīng)檢測融合藻株的總脂、EPA、DHA和EPA/DHA等指標(biāo)均比異養(yǎng)親本四鞭藻有較大提高且在兼養(yǎng)條件下生長速率高于親本微藻。楊超一等[5]用促卵泡激素(FSH)抗原免疫Balb/c小鼠,采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù),經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆化培養(yǎng)及通過小鼠腹水的誘發(fā)，共獲得11株FSH單克隆抗體。王琴等[6]以純化的新城疫病毒ND35免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)篩選,獲得5株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。雷慧芬等[7]將人巨核祖細(xì)胞和胃癌細(xì)胞融合成功的獲得了能產(chǎn)生血小板的融和細(xì)胞。焦奧等[8]通過電融合法構(gòu)建將肝細(xì)胞系及原代內(nèi)皮細(xì)胞融合,成功獲得了一株由大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A與原代大鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞融合而成的四倍體BRL-ies細(xì)胞。這株細(xì)胞既有內(nèi)皮細(xì)胞表型，表達(dá)CD31，又有肝細(xì)胞特性，表達(dá)較高水平的谷氨酰胺合成酶。祭芳等[9]將玉米赤霉烯酮與羧甲氧基胺半鹽酸鹽反應(yīng)，合成半抗原 ZEN-oxime，通過活潑酯法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備玉米赤霉烯酮人工抗原，以人工抗原 ZEN-BSA 免疫 BALB/C 小鼠，將獲得的該鼠脾細(xì)胞與 SP 2/0 鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，成功得到了1株能穩(wěn)定分泌抗玉米赤霉烯酮抗體的單克隆細(xì)胞株 3D10。曾柏全等[10]為獲得具有高纖維素酶活性且強(qiáng)抗逆性的新菌株，通過雙親滅活原生質(zhì)體技術(shù)對(duì)青霉菌與枯草芽孢桿菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，成功選育出具有抗逆性的高產(chǎn)纖維素酶菌株。趙曉燕等[11]利用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，將具有殺蟲作用的蘇云金芽胞桿菌 B7 和枯草芽胞桿菌 TL2進(jìn)行融合再生，再生融合子經(jīng)過十次傳代和顯微鏡檢產(chǎn)晶體情況初步篩選出 17 株性狀穩(wěn)定且均能產(chǎn)生殺蟲晶體的融合子,通過對(duì)黃瓜枯萎病和辣椒疫霉病的拮抗試驗(yàn)，篩選出 3 株(TLB1、TLB2、TLB15)和親最終篩選出對(duì)小菜蛾 2 齡幼蟲校正死亡率最高的融合子 TLB15。

2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。MSCs在特定誘導(dǎo)條件下可分向多種中胚層來源的組織細(xì)胞分化,如骨、軟骨、脂肪、心肌組織等[12-16]。不同來源的MSCs均不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)類分子和凋亡相關(guān)受體FasL，不表達(dá)共刺激分子B7-1、B7-2，低水平表達(dá)或不表達(dá)MHC-Ⅰ類分子、CD40和CD40L，因此其具有低免疫原性[17]。而且與胚胎干細(xì)胞相比MSCs不存在倫理約束，基于其獨(dú)特的分化能力和低免疫原性，MSC在再生醫(yī)學(xué)及疾病的臨床應(yīng)用治療中起到了很大的作用。如王慧君等[18]用毛囊培養(yǎng)上清液為條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)大鼠BM-MSCs，并對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞角蛋白15(cytokeratin15,CK15)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，RT-PCR鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞CK15的表達(dá)，結(jié)果顯示BM-MSCs經(jīng)毛囊上清液誘導(dǎo)后部分細(xì)胞CK15表達(dá)陽性，RT-PCR檢測到CK15mRNA的表達(dá)，推斷體外培養(yǎng)的BM-MSCs經(jīng)毛囊培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)可以分化為毛囊干細(xì)胞樣的細(xì)胞。李海紅等[19]將BrdU標(biāo)記的大鼠BM-MSCs經(jīng)陰莖靜脈輸注到大鼠體內(nèi)，取術(shù)后3 d及7 d的創(chuàng)面組織行BrdU免疫組織化學(xué)單染色，以及BrdU和廣譜CK免疫組織化學(xué)雙染色，結(jié)果BrdU陽性細(xì)胞出現(xiàn)在創(chuàng)面皮下組織、皮脂腺、毛囊中，免疫組織化學(xué)雙染色結(jié)果顯示皮脂腺和毛囊有BrdU陽性細(xì)胞，驗(yàn)證了在實(shí)驗(yàn)性全身皮膚缺損創(chuàng)面微環(huán)境下，MSCs可分化為皮膚附屬器細(xì)胞。

目前臨床應(yīng)用較多的為骨髓來源MSC(bonemarrow-MSC,BM-MSC)、臍帶來源MSC(umbilicalcord-MSC,UC-MSC)和臍血來源MSC(UCB-MSC)，不同來源MSC雖然具有一些共性，但也具有一些不同的特性[20]。臍帶是連接胚胎臍部和胎盤的索狀結(jié)構(gòu)，外有羊膜包被，內(nèi)有來自中胚層的膠樣結(jié)締組織。結(jié)締組織內(nèi)包括閉鎖的尿囊、卵黃蒂、兩條臍動(dòng)脈和一條臍靜脈。膠樣結(jié)締組織被稱為華通膠或沃頓膠(Wharton’sjelly,WJ)。它富含膠質(zhì)和葡萄糖胺聚糖(主要為透明質(zhì)酸)。McElreavey等[21]首次報(bào)道了在人臍帶WJ組織中分離并培養(yǎng)出一種成纖維樣細(xì)胞，其能夠向多個(gè)方向進(jìn)行分化。隨后眾多研究者也展開了對(duì)UC-MSCs的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表面標(biāo)志物與BM-MSCs相似，只是CD106表達(dá)率略低。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶中含有豐富的MSCs，比骨髓和臍血更為豐富，其增值能力也比成人骨髓MSC更強(qiáng)，并且UC-MSCs與BM-MSCs相比較，具有相似的細(xì)胞表面標(biāo)志物，它多采用組織塊法培養(yǎng)，7～10 d既可長出大量間充值干細(xì)胞[22,23]。與其他來源干細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，其方便、簡單、細(xì)胞貼壁快，更易獲臍血干細(xì)胞得原代細(xì)胞，無其他細(xì)胞混雜，純度高，是潛在的MSC的重要來源。另有研究證實(shí)，UC-MSCs與BM-MSCs免疫原性相比較，BM-MSCs表達(dá)組織相容性復(fù)合物MHC-I和較弱的MHC-Ⅱ，但UC-MSCs只表達(dá)MHC-I，且表達(dá)率低于BM-MSCs，不表達(dá)或低表達(dá)抑制免疫排斥相關(guān)的共刺激因子CD80,CD86,CD40,CD40L等，免疫原性較BM-MSCs更低，更加適宜用于臨床上同種異體間移植治療[24,25]。

3 汗腺細(xì)胞

一般來說人體有(3～4)×106個(gè)汗腺組織，汗腺屬于外分泌腺，汗腺根據(jù)其體積的大小分為兩種，大的稱為大汗腺又叫頂泌汗腺，小的稱為小汗腺即通常說的外泌汗腺。大汗腺主要分布于腋窩、乳暈、肛門和會(huì)陰等處。小汗腺分布于全身大部分皮膚中由分泌部和導(dǎo)管部組成，其腺體直接開口于皮膚是人體發(fā)汗的主要器官。

從胚胎學(xué)上來說，汗腺起源于外胚層上皮細(xì)胞，其通過分裂、增殖、內(nèi)陷在表皮脊形成上皮細(xì)胞索，隨后近端發(fā)育成導(dǎo)管，末端發(fā)育成分泌部，中間形成空隙聯(lián)通導(dǎo)管和分泌部，從而構(gòu)成汗腺。一般來說整個(gè)發(fā)育起于胚胎14～16周，到胚胎24周時(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定[26]。整個(gè)過程復(fù)雜有各種生長因子參與其中，如成纖維細(xì)胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮細(xì)胞生長因子等可以促進(jìn)有絲分裂，加速汗腺細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)汗腺胚芽的發(fā)生[27]。

汗腺的主要功能是分泌汗液，從而實(shí)現(xiàn)體溫的調(diào)節(jié)，整個(gè)排汗過程是由交感神經(jīng)支配的，外科交感神經(jīng)切除術(shù)證實(shí)膽堿能神經(jīng)纖維起源于交感神經(jīng)元的頸上神經(jīng)節(jié)[28]，成人汗腺細(xì)胞表達(dá)CK7、CK8、CK18、CK19于類上皮細(xì)胞相似[29]，Turksen等[30]發(fā)現(xiàn)一種汗腺特異性蛋白，僅存在于外泌汗腺。目前還沒有發(fā)現(xiàn)汗腺細(xì)胞的特異性標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)CEA在在胎兒和成人皮膚的汗腺導(dǎo)管部、分泌部均有表達(dá)，在表皮的其他部位不表達(dá)[29]。CK19是上皮細(xì)胞的特異性抗原標(biāo)志物，作為表皮干細(xì)胞鑒定手段之一，在汗腺導(dǎo)管部細(xì)胞中也有表達(dá)[31]。因此，以往實(shí)驗(yàn)通過CEA與CK19的免疫組化表達(dá)情況檢測汗腺細(xì)胞的表面標(biāo)志物。

4 類汗腺細(xì)胞

4.1 目前獲得類汗腺細(xì)胞的主要方式是通過干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù) 干細(xì)胞技術(shù)是通過干細(xì)胞移植誘導(dǎo)再生汗腺。間充質(zhì)干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)下可以向多種中胚層來源的組織細(xì)胞分化,具有潛在的分化為汗腺樣細(xì)胞的能力。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外與熱休克后的人汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)，可以被誘導(dǎo)成為具有汗腺細(xì)胞表型的細(xì)胞。直接共培養(yǎng)——將熱休克的汗腺細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞直接放入培養(yǎng)皿中一起培養(yǎng)。間接共培養(yǎng)——將熱休克的汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基的上清液加入到間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)培養(yǎng)。小室共培養(yǎng)——將熱休克的汗腺細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞放到小室的不同層次共同培養(yǎng)。這說明熱休克細(xì)胞分泌的某種物質(zhì)可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化。隨著近幾年眾多學(xué)者對(duì)汗腺再生相關(guān)研究的不斷深入，汗腺形態(tài)的多基因及信號(hào)通路的機(jī)制逐漸得到證實(shí)。多種細(xì)胞因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了汗腺再生過程，并在汗腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。此外，不同的細(xì)胞因子可激活相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而同一種細(xì)胞因子又可激活不同的信號(hào)通路，并且不同的信號(hào)通路之間有復(fù)雜的相互作用。目前明確的相關(guān)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有miRNA-203、P63、EDA-A1、microRNAs、NF-κB、Lef-1、外胚葉發(fā)育不全因子(EDA-A1)、重組人表皮生長因子(rh-EGF)和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)、PD98059、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路、EDA-A1/EDA-A1受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Wnt/β-角蛋白(β-catenin)信號(hào)通路、Shh信號(hào)通路、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)通路等，但是汗腺再生是一個(gè)復(fù)雜的多基因及信號(hào)通路參與的過程至今沒有完全研究清楚。共培養(yǎng)雖然可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞定向分化，但是共培養(yǎng)的前提需要大量的熱休克汗腺細(xì)胞，目前解決不了這一問題。

4.2 目前未能獲得具有分泌汗液功能的組織工程皮的主要制約瓶頸 目前通過三維培養(yǎng)等技術(shù)研制出的全層皮膚替代物已有許多種，已成功解決大面積燒傷患者自體皮源不足的問題，但筆者發(fā)現(xiàn)至今還沒有任何一種組織工程皮能作為理想的皮膚覆蓋物，是因?yàn)檫@些全層皮膚替代物缺乏皮膚附屬物，毛囊、皮脂腺尤其是汗腺。周立奉等[32]將汗腺上皮細(xì)胞以接種至Matrigel凝膠進(jìn)行三維立體培養(yǎng)，成功形成了汗腺樣結(jié)構(gòu)，但汗腺細(xì)胞自身的闊增是極其緩慢的，近年來眾多學(xué)者試圖利用組織工程學(xué)培養(yǎng)皮膚附屬物汗腺組織的嘗試一直沒有間斷過，但目前仍然沒有可靠的方法培養(yǎng)出大量汗腺細(xì)胞，這嚴(yán)重阻礙了構(gòu)件能分泌汗液組織工程皮的進(jìn)展。如何獲得大量汗腺細(xì)胞是目前首要解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

4.3 通過構(gòu)建汗腺細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞來獲得大量具有分泌液功能的融合細(xì)胞的新進(jìn)展 2003年國外學(xué)者首次提出間充質(zhì)干細(xì)胞分化為汗腺細(xì)胞的機(jī)制可能是直接分化，也可能是與汗腺細(xì)胞發(fā)生融合，甚至是核融合[33]。李海紅等[34]在研究人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外與損傷的人汗腺細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)化情況中發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融體，且做了相關(guān)檢驗(yàn)證明了融合細(xì)胞同時(shí)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞兩個(gè)親本的表型。周崗[35]汗腺發(fā)生與修復(fù)過程中基因表達(dá)特征的系列研究中再次證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融體，且做了相關(guān)檢驗(yàn)證明融合細(xì)胞同時(shí)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞2個(gè)親本的特異性抗體。李海紅等[36]對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為汗腺細(xì)胞的體外研究時(shí)也再次證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞與汗腺細(xì)胞發(fā)生融合形成多核細(xì)胞。至今融合細(xì)胞同時(shí)兩個(gè)親代細(xì)胞的表型已是不爭的事實(shí)。多個(gè)學(xué)者發(fā)現(xiàn)已分化的體細(xì)胞能夠通過重編程轉(zhuǎn)化回多能干細(xì)胞,在細(xì)胞移植、疾病細(xì)胞模型的制備以及藥物篩選等領(lǐng)域具有重要意義。通過干細(xì)胞和體細(xì)胞的細(xì)胞融合,可使體細(xì)胞重編程[37,38]。細(xì)胞融合致體細(xì)胞重編程速度快、效率高,是一種研究重編程機(jī)制的重要手段。這也同樣說明用間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞一樣用于細(xì)胞融合技術(shù)來改變親本細(xì)胞的特性，從理論上說明其是可行的。

綜上所述，實(shí)現(xiàn)汗腺再生具有很大的臨床價(jià)值，但汗腺細(xì)胞分化是一個(gè)復(fù)雜的過程，機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究。間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融合體的首次發(fā)現(xiàn)是無意中實(shí)現(xiàn)的，但融合體的檢測結(jié)果給了我們一個(gè)實(shí)現(xiàn)汗腺再生新的啟示。再生醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的趨勢，細(xì)胞融合技術(shù)作為再生醫(yī)學(xué)的重要技術(shù)手段可把來自于不同種生物的單個(gè)細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，使這個(gè)新細(xì)胞(雜合細(xì)胞)得到了來自兩個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(包括細(xì)胞核的染色體組合和核外基因)，具有新的遺傳或生物特性。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以其原代培養(yǎng)簡單、易獲得、純度高、低抗原性更加適宜用于臨床上同種異體間的移植。這從理論上說，用細(xì)胞融合技術(shù)把干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融合來獲得大量具有分泌汗液并可適當(dāng)擴(kuò)增的雜合細(xì)胞是可行的。深入研究構(gòu)建人間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞融合體來獲取大量具有分泌汗液功能雜合細(xì)胞的新方法，將細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞生物技術(shù)與生物材料工程學(xué)相結(jié)合是開發(fā)理想組織工程全層皮膚的新發(fā)展方向。