松弛素家族及其受體在精子發(fā)生過程中的作用研究進展

董盼攀 楊凱 張?zhí)煊?曾慶琪

松弛素（relaxin，RLN）是 1926年由 Dr.Frederick Hisaw在地鼠和豚鼠的性腺激素中發(fā)現(xiàn)并命名的一種短循環(huán)多肽激素，在妊娠、分娩及其他女性生殖方面起重要作用。人類RLN家族多肽包括RLN1、RLN2、RLN3和類胰島素多肽（insulin like peptides，INSL）3、INSL4、INSL5、INSL6兩大類。成熟的多肽由二硫鍵連接的A、B兩條肽鏈組成，其中B鏈有些氨基酸殘基是RLN分子受體識別位點的重要部分。不同物種RLN的結構、生物學作用差異很大[1]。隨著研究的不斷深入，有學者發(fā)現(xiàn)RLN對非生殖系統(tǒng)起到抗纖維化、舒張血管以及促進組織愈合等作用[2-3]。自從2007年Agoulnik[4]在精液中發(fā)現(xiàn)RLN家族及其受體，其在男性生殖領域也成為了研究的熱點，但作用仍存在爭議。本文就RLN家族及其受體在精子發(fā)生過程中的作用及可能的機制作一綜述。

1 RLN家族及其受體分布

人類的RLN基因從cDNA數(shù)據(jù)庫中分離，并通過質譜法進行鑒定。在靈長目動物中，RLN通過復制，產(chǎn)生了RLN1和RLN2。RLN2是生物進化過程中RLN1的直系同源基因，兩者分子結構非常接近，僅13個氨基酸序列排列有別，其中RLN2是組織儲存及血液中存在的主要形式。卵巢和前列腺是RLN2的主要來源[5]。早在1998年，Steinetz等研究提出，RLN3是所有RLN家族最原始的多肽，但目前大多研究認為RLN3是一種神經(jīng)肽，主要參與攝食調節(jié)、壓力、記憶等腦部的神經(jīng)調節(jié)[6]。RLN3復制以后產(chǎn)生INSL5。與RLN3一樣，INSL5維持非性腺表達模式，主要參與胃腸道調節(jié)。INSL4和INSL6與兩性和mab3相關轉錄因子1（doublesex-mab3-related transcription factor1，DMRT1）基因緊密連鎖，參與脊椎動物古老的性別決定，在生殖功能中發(fā)揮作用[7]。

RLN受體是G蛋白偶聯(lián)受體，也稱為RLN家族肽受體（receptors for relaxin and related peptides，RXFP）。胰島素RLN肽類激素家族的進化還伴隨著使用的受體的連續(xù)變化。RLN是RXFP1的內(nèi)源性配體，RXFP1與RLN的親和力是RXFP2的5倍。RXFP2也是INSL3的受體。當RLN3復制產(chǎn)生INSL5時，受體也從RXFP3復制成為RXFP4。這兩種受體主要與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）和 Ca2+細胞內(nèi)信號通路相關[8-9]。截止目前，INSL4、INSL6的受體尚未見相關報道[10]。

2 RLN家族對精子發(fā)生的影響

RLN家族及其受體在不同組織的共表達提示RLN可能存在自分泌和旁分泌作用。雖然目前已有研究表明男性生殖系統(tǒng)存在部分RLN家族及其受體，但其對精子的發(fā)生及作用過程尚未十分明確[11]。Pimenta等[12]通過培養(yǎng)大鼠睪丸細胞發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RLN對生殖細胞群體的比例沒有影響，但增加了未分化和分化的精原細胞標記早幼粒細胞白血病鋅指蛋白（promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF）、c-kit和減數(shù)分裂后標記外密纖維蛋白 2（outer dense fiber protein 2，Odf2）在D5的基因和（或）蛋白的表達。用小干擾RNA敲除RLN可減少β-catenin在細胞連接處的表達，并將其表達轉移到細胞核，由此認為RLN可能通過調節(jié)精原細胞的自我更新和促進細胞接觸來影響精子發(fā)生。Feugang等[13]研究發(fā)現(xiàn)RLN主要聚集在睪丸的間質細胞中，在前列腺和精囊中含量較低；在曲細精管和附睪的管腔和上皮中也發(fā)現(xiàn)RLN表達；精子本身也存在RLN，且集中在頂體區(qū)，RXFP2比RXFP1分布更均勻。Braun等[14]報道RLN與RXFP1一起參與精子發(fā)生的第一階段，而RLN3通過與RXFP3結合參與了生精過程。此外，還觀察到 RLN、RLN3、RXFP1、RXFP2 和 RXFP3 mRNA的表達與睪丸中單倍體細胞的相對數(shù)量呈正相關。INSL3在睪丸各發(fā)育階段均有高表達。由于其受體RXFP2的低表達和非階段依賴性，INSL3在精子發(fā)生過程中不太可能具有自分泌和（或）旁分泌功能。在成人睪丸中，RLN、RXFP1和RXFP3的mRNA主要在睪丸管狀室表達，而INSL3在間質細胞表達較多。Heidari等[15]則通過不同劑量的RLN3培養(yǎng)正常的精液標本，發(fā)現(xiàn)RLN3可以減緩精子活力的自然下降，但沒有檢測到RXFP3 mRNA在精子中的表達，提示RXFP3在精子發(fā)生過程中停止表達。Yeganeh等[16]通過免疫熒光和RTPCR法，首次證實了RXFP4在精子中的存在，且集中分布在頸部和中段。INSL5則能抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）對線粒體的損傷，從而影響精子的發(fā)生、運動等。而目前INSL4只在胎盤上表達，在男性任何生殖道部位都未檢測到。Burnicka-Turek等[17]通過基因敲除小鼠研究表明，INSL6基因缺失的小鼠表現(xiàn)出明顯的精子發(fā)生中斷和減數(shù)分裂停滯，且INSL6在保護生殖細胞免受凋亡方面具有作用。

3 RLN對精子發(fā)生的作用機制

RLN介導多種生物學作用，包括纖維化、擴張血管、促血管生成、抗炎、抗凋亡和器官保護等作用[18]。在細胞水平上，RLN與受體RXFP1相結合，激活多種下游信號轉導通路。RLN通過復雜多樣的信號轉導機制在機體中發(fā)揮其多樣的生物學效應，包括環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、蛋白激酶（protein kinase C，PKC）途徑和細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）途徑等。不同的細胞間，RLN誘導的信號轉導機制不完全相同[19]。在Sertoli細胞中，RLN主要通過ERK1/2及 PI3K/蛋白激酶 B（protein kinase，Akt）這兩條通路對精子發(fā)生產(chǎn)生影響。

3.1 PI3K/Akt及ERK1/2信號通路 PI3K/Akt信號通路參與細胞周期的調節(jié)，包括介導細胞存活、凋亡和增殖。McGuane等[20]通過使用PI3K抑制劑Y294002發(fā)現(xiàn)，通過RXFP1介導可快速激活PI3K的下游Akt。ERK1/2是MAPK家族成員，參與調節(jié)一系列細胞生物學過程，如細胞增殖和分化等。Nascimento等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠原代培養(yǎng)Sertoli細胞中，RLN能在5～10 min內(nèi)誘導ERK1/2快速磷酸化，在30 min內(nèi)恢復到基礎水平。外源性RLN可增加Sertoli細胞數(shù)量和增殖細胞核抗原的表達。在大鼠Sertoli細胞中，絲裂素活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）抑制劑U0126阻斷了RLN引起Akt磷酸化的能力，而抑制PI3K則削弱了RLN治療增加ERK1/2磷酸化的能力。由此可見，ERK1/2和PI3K/Akt通路之間似乎也存在串擾。

3.2 促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和RLN的相互作用 Sertoli細胞功能受多種激素調節(jié)，如FSH能調節(jié)其增殖及協(xié)助細胞間通訊，且有助其形成血-睪屏障。Soffientini等[22]研究表明FSH在決定嚙齒動物體內(nèi)支持細胞增殖和細胞數(shù)量方面起著重要作用。FSH促進未成熟大鼠Sertoli細胞ERK1/2磷酸化和增殖，但在Sertoli細胞分化開始時抑制MAPK通路。一方面，PI3K/Akt/哺乳動物靶點雷帕霉素復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）通路也參與了FSH誘導的人髓細胞增生原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene，c-Myc）表達和 Sertoli細胞增殖，另一方面腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）活化的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）的激活可能通過降低mTORC1活性和增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinases-1，CDK1）的表達而參與抑制Sertoli細胞的增殖[23-24]。然而，Nascimento等[25]通過研究FSH和RLN對15日齡大鼠Sertoli細胞增殖和分化相關的細胞內(nèi)信號通路的影響發(fā)現(xiàn)，在支持細胞發(fā)育的這個時期，F(xiàn)SH通過激活c-AMP/環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（CAMP response element binding protein，CREB），抑制ERK1/2和Akt通路，進而引導細胞分化。RLN通過抑制 cAMP和激活 ERK1/2、Akt、NF-κB來拮抗促性腺激素信號轉導，但不阻斷促性腺激素誘導的分化過程。

4 結語

Sertoli細胞在生精過程中的重要程度不言而喻。綜述RLN家族及其受體對Sertoli細胞功能調節(jié)的研究進展，為后續(xù)進一步實驗研究作用分子機制及臨床治療生精障礙提供了新思路。