慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘生長、抗氧化及免疫指標的影響

管 敏，張德志，唐大明，張厚本

（中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所，三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443100）

中華鱘（Acipenser sinensis）為大型溯河產(chǎn)卵洄游性魚類，屬國家一級重點保護動物。近年來，由于受到人類活動的影響，中華鱘的自然種群已嚴重衰退［1-2］。自20世紀70年代始，國內多家研究機構在中華鱘物種保護方面做了大量工作，至2009年，中華鱘在淡水條件下的全人工繁殖技術獲得突破［3］，這對于中華鱘的物種保護及其種群復壯具有極為重要的意義。然而，在中華鱘的人工養(yǎng)殖過程中，還存在投喂方式較為粗放、養(yǎng)殖密度較高及水體交換量小等問題，這導致養(yǎng)殖水體中氨氮超標成為一種常態(tài)，雖極少達到中華鱘的急性毒性致死濃度，但會對中華鱘造成慢性氨氮脅迫；同時，過高的氨氮易打破養(yǎng)殖系統(tǒng)平衡性，使養(yǎng)殖水體中的病原微生物迅速繁殖，從而導致中華鱘病害頻發(fā)，這已成為制約中華鱘健康養(yǎng)殖的主要因素之一［4］。因此，研究慢性氨氮脅迫對中華鱘生長、抗氧化及免疫能力的影響，可為中華鱘的人工養(yǎng)殖提供重要的理論指導，對中華鱘的物種保護具有重要意義。

氨氮脅迫會導致水生生物生長緩慢、組織器官病變，抑制其免疫系統(tǒng)功能，擾亂其中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最終致其死亡［5-7］。目前，關于急性氨氮脅迫對魚類［6，8-10］、蝦蟹類［11-13］、頭足類［7］、棘皮動物類［14］影響的研究報道較多，而關于氨氮對中華鱘慢性毒性的研究尚未見報道。本實驗在慢性氨氮脅迫條件下，研究了子二代中華鱘生長、抗氧化及免疫指標的變化情況，旨在探討慢性氨氮脅迫對其代謝水平和生理狀況的影響，從而為子二代中華鱘的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗魚為湖北省宜昌市中華鱘研究所2014年全人工繁殖所得的子二代中華鱘 （3＋齡）。隨機挑選規(guī)格一致、體質健康的子二代中華鱘24尾，體質量為 （2.62±0.16）kg，體長為（84.20±1.50）cm。

1.2 實驗設計

實驗在4個直徑4.0 m、水深0.8 m的實驗池中進行，氨氮濃度設置為0.01 mg·L-1（對照組）、0.5 mg·L-1（低質量濃度組）、1.0 mg·L-1（中質量濃度組）、2.0 mg·L-1（高質量濃度組），每個濃度組6尾魚。實驗開始前，用120 mg·L-1MS-222將中華鱘進行麻醉，然后稱重并測全長和體長，最后將其轉至實驗池中暫養(yǎng)，3 d后開始實驗。暫養(yǎng)和實驗期間，溶氧6.0～7.0 mg·L-1，pH 7.3～7.6，亞硝酸鹽低于0.01 mg·L-1；暫養(yǎng)期間水溫（16.8±0.5）℃，實驗期間水溫16.8～21.5℃。氨氮濃度用10 g·L-1的NH4Cl母液進行調配，實驗池水每24 h換一次；每天投喂1次，投喂量為0.9 kg，攝食完成后及時清除殘餌，并觀察記錄魚的攝食及活動狀態(tài)，實驗持續(xù)60 d。

1.3 樣品的采集和處理

取樣前，用120 mg·L-1MS-222將試驗魚進行麻醉，然后臀鰭基部抽血，靜置1 h后3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清保存于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，-70℃保存待測。將試驗魚解剖，對內臟團和肝臟進行稱重，然后取肝臟并將其切成小塊，置于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，-70℃保存待測。

1.4 測定指標

計算成活率 （SR）、增重率 （WGR）、特定生長率 （SGR）、肝體比 （HSI）、肥滿度 （CF）和臟體比 （VSI），計算公式為：

成活率 （SR，%）=100×Nf／Ni

增重率 （WGR，%）=100×（Wt-W0）／W0

特定生長率 （SGR，%·d-1）=100×（lnWt-lnW0）／t

肝體比 （HSI，%）=100×Wh／Wb

肥滿度 （CF，%）=100×（Wb／L3）

臟體比 （VSI，%）=100×We／Wb

式中，Nf為終末魚尾數(shù)；Ni為初始魚尾數(shù)；Wt為終末體質量 （g）；W0為初始體質量 （g）；t為實驗天數(shù) （d）；Wb為每尾魚體質量（g）；L為每尾魚體長（cm）；Wh為肝臟質量（g）；We為內臟團質量 （g）。

抗氧化指標包括超氧化物歧化酶 （SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、總抗氧化能力（TAOC）活性、谷胱甘肽（GSH）含量、丙二醛（MDA）含量；免疫指標包括溶菌酶 （LZM）活性和免疫球蛋白M（IgM）含量。所有指標的測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，具體方法參見其說明書。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 16.0和Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析 （One-Way ANOVA）和Duncan’s多重比較檢驗慢性氨氮脅迫對各項指標影響的顯著性，差異的顯著性以P＜0.05為標準，結果以平均值 ±標準差（Mean±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘行為及生長性能的影響

在各氨氮處理組中，隨著氨氮濃度的升高，中華鱘表現(xiàn)出一定的應激行為，主要體現(xiàn)在呼吸頻率增加，食欲減退，攝食率下降；實驗結束時，各組試驗魚的成活率均為100%。慢性氨氮脅迫雖未對子二代中華鱘的存活造成影響，但卻對其生長產(chǎn)生了顯著的抑制作用 （表1）。隨著氨氮濃度的增加，子二代中華鱘的增重率和特定生長率逐漸降低，且中、高濃度組顯著低于低濃度組和對照組（P＜0.05）；低、中、高濃度組試驗魚的臟體比和肝體比均低于對照組，但無顯著性差異（P＞0.05）；此外，各組試驗魚的肥滿度也無顯著性變化 （P＞0.05）。

表1 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘生長指標的影響Tab.1 Effect of chronic ammonia stress on growth index of F2 Acipenser sinensis

2.2 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘抗氧化指標的影響

2.2.1 SOD活性

隨著氨氮濃度值的增大，子二代中華鱘血清、肝臟SOD活性逐漸下降 （圖1）。低、中、高濃度組血清 SOD活性分別為72.38、67.89、59.21 U·mL-1，較對照組分別下降 9.28%、14.91%和25.79%；肝臟 SOD活性分別為 217.55、203.77、194.04 U· mg-1prot，較 對照組 分別 下降12.20%、17.77%和 21.69%；其中，低濃度組和對照組與中、高濃度組存在顯著性差異 （P＜0.05）。

圖1 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清、肝臟SOD活性的影響Fig.1 Effect of chronic ammonia stress on SOD activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.2 CAT活性

子二代中華鱘血清、肝臟CAT活性變化如圖2所示。氨氮濃度值越大，血清和肝臟CAT活性越小。對照組血清CAT活性為1.20 U·mL-1，分別是低、中、高濃度組的1.24、1.27和1.57倍，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）；對照組肝臟CAT活性為15.61 U·mg-1prot，分別是低、中、高濃度組的 1.13、1.30和 1.50倍，且對照組與中、高濃度組存在顯著性差異 （P＜0.05）。

圖2 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟CAT活性的影響Fig.2 Effect of chronic ammonia stress on CAT activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.3 GSH含量

子二代中華鱘血清、肝臟GSH含量變化如圖3所示。各處理組試驗魚血清、肝臟GSH含量依次表現(xiàn)為對照組＞低濃度組＞中濃度組＞高濃度組，高濃度組中華鱘血清、肝臟GSH含量顯著低于對照組 （P＜0.05），較對照組分別降低42.42%和 65.24%。

圖3 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟GSH含量的影響Fig.3 Effect of chronic ammonia stress on GSH content in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.4 T-AOC活性

子二代中華鱘血清、肝臟T-AOC活性變化見圖4。隨著氨氮濃度的升高，試驗魚的血清、肝臟T-AOC活性逐漸降低，低、中、高濃度組血清 TAOC活性較對照組分別下降了15.85%、41.46%和47.15%，肝臟T-AOC活性較對照組分別下降20.24%、30.79%和 33.46%。

圖4 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟T-AOC活性的影響Fig.4 Effect of chronic ammonia stress on T-AOC activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.2.5 MDA含量

在慢性氨氮脅迫條件下，子二代中華鱘血清、肝臟MDA含量的變化情況見圖5。各氨氮處理組血清、肝臟MDA含量由大到小依次為高濃度組、中濃度組、低濃度組和對照組；其中，高濃度組血清 MDA含量顯著高于對照組 （P＜0.05），中、高濃度組肝臟MDA含量均顯著高于對照組和低濃度組 （P＜0.05）。

圖5 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟MDA含量的影響Fig.5 Effect of chronic ammonia stress on MDA content in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

2.3 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘免疫指標的影響

2.3.1 LZM活性

子二代中華鱘血清、肝臟LZM活性隨氨氮濃度升高而顯著降低（圖6）。與對照組和低濃度組相比，高濃度組血清 LZM活性分別降低26.77%和23.45%，之間存在顯著性差異 （P＜0.05）；高濃度組肝臟LZM活性與對照組也存在顯著性差異 （P＜0.05）。

2.3.2 IgM含量

子二代中華鱘血清、肝臟IgM含量變化情況見圖7。氨氮濃度越高，血清、肝臟IgM含量越低，中濃度組血清、肝臟IgM含量較對照組分別下降17.21%和34.11%；高濃度組血清、肝臟IgM含量較對照組分別下降25.07%和43.64%；中、高濃度組與低濃度組、對照組均存在顯著差異 （P＜0.05）。

圖6 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟LZM活性的影響Fig.6 Effect of chronic ammonia stress on LZM activity in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

圖7 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘血清和肝臟IgM含量的影響Fig.7 Effect of chronic ammonia stress on IgM content in serum and liver of F2 Acipenser sinensis

3 討論

3.1 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘生長的影響

氨氮是評估水環(huán)境好壞的重要指標，其濃度升高會對養(yǎng)殖魚類造成脅迫作用。研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫會顯著降低尼羅羅非魚［8］（Oreochromisniloticus）、黃顙魚［15］（Pelteobagrus fulvidraco）、大菱鲆［16］（Scophthalmus maximus） 、舌 齒 鱸［17］（Dicentrarchus labrax） 幼 魚、塞 內 加 爾 鰨［18］（Solea senegalensis） 、大 西 洋 比 目 魚［19］（Hippoglossushippoglossus）等魚類的生長速率，使其生長緩慢甚至停滯，本研究所得結果與其相同。在本研究中，慢性氨氮脅迫未造成子二代中華鱘死亡，但對其攝食、生長造成了嚴重影響。試驗魚的增重率和特定生長率隨氨氮濃度的增加而顯著降低，這說明慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘的生長產(chǎn)生了顯著抑制作用，其原因可能為氨氮濃度的升高影響了魚類的消化生理功能，致其消化酶活性降低，食欲下降，攝食量減少，從而導致魚體生長緩慢［20］。

3.2 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘抗氧化能力的影響

愈來愈多的研究者認為，魚類氨中毒致死可能與機體氧化損傷和免疫抑制有關［21］。魚類長期處于氨氮脅迫中，機體內源性氨的排泄被阻斷，外源性氨經(jīng)鰓和皮膚進入體內并大量積累，產(chǎn)生大量氧自由基 （ROS），從而對魚體造成損傷［22］。為了消除體內過多的ROS，維持 ROS的動態(tài)平衡，魚類進化出一套完整的抗氧化防御體系。衡量該系統(tǒng)功能的綜合性指標為總抗氧化能力（T-AOC），它可以反映機體應對外來脅迫的能力［23］，另外，超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶（CAT）是抗氧化防御體系中非常重要的功能酶［24］，其活性大小代表機體清除ROS能力的高低［25］。

本研究中，慢性氨氮脅迫顯著降低了子二代中華鱘血清、肝臟SOD、CAT和T-AOC活性，這與鯔（Mugil cephalus）［26］、吉富羅非魚 （GIFTOreochromis niloticus）［27］的研究結果相同，其原因可能與氨氮脅迫抑制抗氧化酶合成有關。在一定的范圍內，魚體可通過改變相關基因表達水平調節(jié)蛋白質的合成量，進而調控體內酶的合成［28］。當氨氮脅迫程度超過魚體耐受后，機體為減少體內分子氨的積累，可能會降低蛋白質和氨基酸的分解代謝［29］，從而導致魚體 T-AOC、SOD和CAT活性顯著下降。然而，姜會民［30］、SUN等［31］研究得出不同結論，這可能與魚體在低氨氮條件下產(chǎn)生毒物興奮效應有關［29］。

谷胱甘肽（GSH）是一種低分子自由基清除劑［32］，是清除 ROS非常重要的非酶抗氧化物質［33］，而丙二醛 （MDA）是 ROS與脂質發(fā)生過氧化反應的產(chǎn)物，它能夠加劇細胞膜的損傷，可以反映組織細胞受ROS攻擊的程度，從而間接反映機體抗氧化能力的強弱［32，34］。隨著氨氮濃度的升高，子二代中華鱘血清、肝臟GSH含量顯著下降，MDA含量顯著升高，這與鯔幼魚［26］、福瑞鯉 （Cyprinus carpio）［35］、黃顙魚幼魚［36］的研究結果相同。結果表明持續(xù)60 d的慢性氨氮脅迫使魚體GSH大量消耗，并顯著加劇了組織細胞膜脂質過氧化程度，醛酮類物質在魚體內不斷積累，這也間接反映機體抗氧化能力正逐漸減弱。

3.3 慢性氨氮脅迫對子二代中華鱘免疫指標的影響

溶菌酶（LZM）和免疫球蛋白M（IgM）是魚體非常重要的免疫因子，前者可以破壞革蘭氏陽性菌細胞壁中的肽聚糖，從而瓦解細菌細胞［37］；后者具有強大的抗感染作用。本研究中，隨著氨氮脅迫濃度的增大，子二代中華鱘血清和肝臟LZM活性及IgM含量均表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢。這表明慢性氨氮脅迫顯著降低了魚體溶菌酶的活性及IgM的合成，對魚體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用，顯著降低了魚體的免疫力。這與黃顙魚幼魚［37］、奧尼羅非魚［38］（Oreochromis niloticus×O.areus）、吉富羅非魚［39］的研究結果相同，其原因可能為魚類受氨氮脅迫時，大量免疫抑制因子會在外圍淋巴組織中產(chǎn)生，并逐漸被釋放到血液中，從而影響巨噬細胞和淋巴細胞的含量及活性，進而抑制免疫應答［40］。

本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)60 d的慢性氨氮脅迫導致子二代中華鱘的特定生長率和增重率顯著下降，血清、肝臟 SOD、CAT、T-AOC、LZM活性、GSH及IgM含量顯著下降，MDA含量顯著升高，這表明慢性氨氮脅迫對中華鱘的生長、抗氧化能力和免疫能力產(chǎn)生了顯著的不利影響，本研究結果對了解中華鱘氨氮脅迫反應以及其健康養(yǎng)殖具有重要的借鑒意義。