脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的生態(tài)毒性效應(yīng)研究

朱津輝，鄭澤欣，李吉平，張政，李威

南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學(xué)院，南京 210037

近年來，抗生素的環(huán)境暴露、遷移轉(zhuǎn)化及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注[1-4]。我國(guó)是抗生素的生產(chǎn)和使用大國(guó)。2013年，我國(guó)抗生素的總使用量為16.2萬(wàn)t，其中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的用量為4.2萬(wàn)t，占總抗生素使用量的1/4[5]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的大量使用導(dǎo)致其連續(xù)不斷地進(jìn)入環(huán)境中，其已在污水處理廠出水、地表水甚至于飲用水中檢出[6-10]。其中，紅霉素、羅紅霉素和克拉霉素是最常檢出的抗生素，紅霉素和克拉霉素已被歐盟列為優(yōu)先監(jiān)測(cè)污染物[11]。

以往研究已對(duì)紅霉素的生態(tài)毒性進(jìn)行了較為充分的探索[12-17]。如González-Pleiter等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素對(duì)羊角月牙藻(Pseudokirckneriellasubcapitata)的半數(shù)抑制濃度(EC50)為(0.35 ± 0.03) mg·L-1。劉濱揚(yáng)等[13]發(fā)現(xiàn)，0.18 mg·L-1的紅霉素即可使羊角月牙藻光合作用綜合性能指數(shù)下降69.7%。劉臻[14]發(fā)現(xiàn)，紅霉素對(duì)熱帶爪蟾的14 d的半數(shù)致死濃度(LC50)為253 mg·L-1。Meinertz等[15]研究發(fā)現(xiàn)，硫氰酸紅霉素對(duì)大型蚤的最大無作用濃度為248 μg·L-1。紅霉素在酸性條件下不穩(wěn)定，口服后易被胃酸破壞，生成脫水紅霉素，在環(huán)境中檢測(cè)到的紅霉素多為脫水紅霉素[18-19]，如周志洪等[19]發(fā)現(xiàn)，脫水紅霉素在珠江廣州段水體中的檢出頻率可達(dá)到100%，其在枯水期和豐水期的平均濃度分別為213 ng·L-1和65.8 ng·L-1，具有較高的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。但是，目前關(guān)于脫水紅霉素的生態(tài)毒性效應(yīng)尚不明確。

綠藻是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)力，其初級(jí)生產(chǎn)量和種類多樣性直接影響著水生生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。同時(shí)，藻類對(duì)污染物的耐受性較低，比水體中的甲殼類動(dòng)物以及魚類更為敏感，往往高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)[20]。蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)屬于綠藻門，小球藻屬，是游離單細(xì)胞藻，直徑3～5 μm，球形或橢圓形，繁殖快，便于培養(yǎng)和試驗(yàn)，藻液分布均勻不易沉降，與污染物的接觸更充分，是國(guó)內(nèi)外常用的污染物毒性測(cè)試的受試生物之一[21]。

綜上所述，本論文擬以脫水紅霉素為研究對(duì)象，以蛋白核小球藻為受試生物，通過研究脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)、葉綠素含量和抗氧化酶活性的影響，探討脫水紅霉素的生態(tài)毒性效應(yīng)，為其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白核小球藻(編號(hào)FACHB-11)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。

紅霉素(C37H67NO13，分子量733.9，純度>98.0%)購(gòu)于百靈威科技有限公司。脫水紅霉素(C37H65NO12，分子量715.9)的配制方法[22]為：稱取1.835 g的紅霉素，溶于用硫酸調(diào)節(jié)pH為3的超純水中，12 h后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7，定容至50 mL，配制得到50 mmol·L-1的脫水紅霉素母液。硼酸、檸檬酸、硫酸鎂(七水)、氯化鈣(二水)、磷酸氫二鉀和檸檬酸鐵銨購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四水合氯化錳、硝酸鈉購(gòu)于南京化學(xué)試劑股份有限公司；無水硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和無水碳酸鈉購(gòu)于西隴化工股份有限公司。五水合硫酸銅購(gòu)自廣州光華科技股份有限公司；鉬酸鈉(二水合物)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中用到的化學(xué)藥品均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白核小球藻的預(yù)培養(yǎng)

在無菌條件下將藻種接種至GB11培養(yǎng)基中，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度(25±1) ℃，光照強(qiáng)度3 000 lux，光暗比為12 h∶12 h。每天至少震蕩3次(15 min·次-1)。預(yù)培養(yǎng)3代，鏡檢細(xì)胞正常，待藻細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性試驗(yàn)

脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性試驗(yàn)參照《化學(xué)品藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)》(GB/T 21805—2008)[23]進(jìn)行。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定正式實(shí)驗(yàn)中脫水紅霉素濃度梯度為0、0.14、0.2、0.29、0.42、0.60和0.87 mmol·L-1。采用滅菌后的BG11培養(yǎng)基，在250 mL的錐形瓶中配制相應(yīng)濃度的脫水紅霉素溶液，加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻母液10 mL，蛋白核小球藻的初始細(xì)胞濃度約為0.8×106cells·mL-1，培養(yǎng)液總體積為100 mL。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。同時(shí)由于配制脫水紅霉素母液過程中會(huì)引入硫酸鈉，為了了解硫酸鈉鹽對(duì)蛋白核小球藻的影響，根據(jù)配制脫水紅霉素時(shí)加入的硫酸鈉的量，設(shè)置低鹽和高鹽2個(gè)對(duì)照組，其硫酸鈉的濃度分別為9.92和43.15 mmol·L-1，相當(dāng)于0.2 mmol·L-1和0.87 mmol·L-1脫水紅霉素處理組中添加的鹽分，培養(yǎng)條件同上。實(shí)驗(yàn)開始后分別于24、48、72和96 h取樣測(cè)定藻細(xì)胞濃度。

藻細(xì)胞濃度采用鏡檢和分光光度法相結(jié)合的方法進(jìn)行測(cè)定，通過顯微鏡用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行藻類計(jì)數(shù)，并在波長(zhǎng)680 nm下測(cè)定藻類的吸光值，建立蛋白核小球藻細(xì)胞密度(y)和吸光度(x)之間線性關(guān)系方程為y=(15.055x+0.5417)×106，相關(guān)系數(shù)r2為0.991。

1.2.3 脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的生理生化指標(biāo)的影響

葉綠素a含量的測(cè)定：根據(jù)歐陽(yáng)少虎[24]的測(cè)定方法并適當(dāng)改進(jìn)，取暴露96 h后的藻液30 mL放入50 mL離心管中，10 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液。加入20 mL 95%無水乙醇，在渦旋混勻器上充分混勻。4 ℃冰箱中黑暗處理24 h，以充分提取蛋白核小球藻的葉綠素。24 h后，冷凍高速離心(10 000 r·min-1、4 ℃)15 min，取上清液測(cè)定其在波長(zhǎng)665 nm和649 nm下的吸光度，代入公式(1)計(jì)算葉綠素a的濃度。

全國(guó)職業(yè)院校導(dǎo)游技能大賽已經(jīng)連續(xù)舉辦了8年，賽項(xiàng)的設(shè)置越來越科學(xué)合理，真正地展示了職業(yè)院校學(xué)生的導(dǎo)游職業(yè)技能和綜合素養(yǎng)。通過對(duì)參賽方案的解讀和對(duì)第三屆全國(guó)導(dǎo)游大賽視頻的研讀，總結(jié)出了幾點(diǎn)現(xiàn)場(chǎng)導(dǎo)游詞的創(chuàng)作技巧。

Ca=(13.7OD665-5.76OD649)/4

(1)

提取粗酶液：取暴露96 h后的藻液30 mL放入50 mL離心管中，4 ℃、6 000 r·min-1下離心20 min，棄去上清液，加入預(yù)冷的0.1 mol·L-1pH為7.0～7.4的磷酸鹽緩沖液20 mL，在超聲細(xì)胞破碎儀中破碎細(xì)胞30 min。破碎完成轉(zhuǎn)移至干凈離心管，在4 ℃、6 000 r·min-1條件下離心20 min，取上清液用于測(cè)量酶活性。

蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量按照南京建成生物工程公司試劑盒說明書測(cè)定。

1.3 脫水紅霉素濃度的測(cè)定

暴露96 h后，取10 mL藻液，6 000 r·min-1離心20 min后，取上清液測(cè)定脫水紅霉素的剩余濃度。脫水紅霉素的剩余濃度采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-LTQ-orbitrap XL MS，賽默飛，德國(guó))來測(cè)定。液相條件為：色譜柱Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)；流動(dòng)相A為體積比為1∶1的甲醇/乙腈溶液，流動(dòng)相B為10 mmol·L-1的乙酸銨溶液(加入0.05%的乙酸)，梯度洗脫程序?yàn)? min時(shí)45% A，14 min時(shí)80% A，17 min時(shí)80% A，17.2 min時(shí)45% A，20 min時(shí)45% A，流速0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源，正離子模式，一級(jí)和二級(jí)模式掃描。離子源溫度350 ℃，毛細(xì)管溫度325 ℃，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速10 arb，噴霧電壓3.5 kV，毛細(xì)管電壓9 V，透鏡電壓100 V。一級(jí)全掃質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 000，分辨率30 000；二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，在一級(jí)掃描基礎(chǔ)上選取其前三強(qiáng)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離(CID)獲取其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)脫水紅霉素母離子(m/z=716.4569)和子離子(m/z=558.3651)對(duì)來定性和定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS19.0和Origin2018對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。運(yùn)用概率單位回歸分析法，計(jì)算蛋白核小球藻的24、48、72和96 h的比生長(zhǎng)率半數(shù)抑制濃度(ErC50)和生長(zhǎng)量半數(shù)抑制率(EyC50)。采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)的Levene檢驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性假設(shè)檢驗(yàn)，以0.05為顯著性水平的臨界值。數(shù)據(jù)滿足齊性要求采用LSD檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不滿足齊性要求則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)組間的差異顯著性。

2 結(jié)果(Results)

2.1 脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響

硫酸鹽組(Na2SO4)和不同濃度的脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)量和比生長(zhǎng)率的抑制率如圖1所示。由圖1可知，硫酸鹽組對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)無明顯影響，低鹽組和高鹽組在不同的暴露條件下都未表現(xiàn)出顯著性差異。脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和比生長(zhǎng)率的抑制率隨脫水紅霉素濃度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系。如0.14 mmol·L-1的脫水紅霉素處理48 h和96 h后，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)量抑制率分別為15.0%和51.3%；0.60 mmol·L-1的脫水紅霉素處理48 h和96 h后，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)量抑制率分別為70.1%和88.8%。脫水紅霉素處理組與硫酸鹽組相比，除了0.14 mmol·L-1處理組暴露24 h外，其他都具有顯著性差異。不同濃度的脫水紅霉素處理組，除了部分相鄰濃度組別不具有顯著性差異，大部分處理組都具有顯著性差異(圖1)。

圖1 脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)量抑制率和比生長(zhǎng)率抑制率Fig. 1 Inhibition of dehydroerythromycin on the yield and growth rate of Chlorella pyrenlidosa

根據(jù)概率單位法回歸分析，計(jì)算出不同暴露時(shí)間下，脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的ErC50和EyC50如表1所示。脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的ErC50和EyC50均隨暴露時(shí)間的增加而減少，在24 h時(shí)，ErC50和EyC50分別為2.107和1.444 mmol·L-1，當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)到96 h時(shí)，ErC50和EyC50分別降低為0.267和0.117 mmol·L-1，這說明脫水紅霉素的暴露時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)蛋白核小球藻的毒性越大。值得注意的是，在不同暴露時(shí)間條件下，脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的EyC50都小于ErC50，說明蛋白核小球藻的生長(zhǎng)量抑制率是更敏感的指標(biāo)。

表1 脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)率和生長(zhǎng)量的半數(shù)抑制濃度(ErC50和EyC50)Table 1 Median effective concentration (ErC50 and EyC50) of dehydroerythromycin on the specific growth rate and yield of Chlorella pyrenlidosa

注：x為脫水紅霉素的濃度對(duì)數(shù)，y為抑制率概率單位，R2表示回歸方程的可決系數(shù)；EyC50和ErC50分別表示生長(zhǎng)量半數(shù)抑制濃度和比生長(zhǎng)率半數(shù)抑制濃度。

Note:xrepresents the log value of concentration of dehydroerythromycin, andyrepresents the probit of inhibition rate;R2represents the coefficient of determination of the regression equation; EyC50/ErC50represents median effective concentration of dehydroerythromycin on the yield and specific growth rate ofC.pyrenlidosa, respectively.

2.2 脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻生理生化指標(biāo)的影響

2.2.1 葉綠素a含量

不同濃度脫水紅霉素暴露96 h后，蛋白核小球藻的葉綠素a含量變化如圖2所示。低鹽組和高鹽組都造成了蛋白核小球藻葉綠素a含量的降低，分別為對(duì)照組的69%和65%。但低鹽組和高鹽組與對(duì)照組都無顯著性差異。不同濃度的脫水紅霉素均抑制了蛋白核小球藻葉綠素a的合成。在脫水紅霉素濃度為0.14和0.87 mmol·L-1暴露96 h后，蛋白核小球藻的葉綠素a含量分別為對(duì)照組的38%和11%，為低鹽組的55%和16%，為高鹽組的59%和17%。不同濃度的脫水紅霉素處理組與對(duì)照組間均存在顯著性差異。除0.14 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1處理組與低鹽組無顯著性差異外，不同濃度的脫水紅霉素處理組與硫酸鹽組都具有顯著性差異。

圖2 脫水紅霉素暴露96 h對(duì)蛋白核小球藻葉綠素a含量的影響Fig. 2 Effect of dehydroerythromycin on the chlorophyll a content of Chlorella pyrenlidosa after exposure for 96 h

2.2.2 抗氧化酶活性

脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻SOD和CAT酶活性的影響如圖3所示。由圖3(a)可知，鹽分導(dǎo)致蛋白核小球藻的SOD酶活性略微降低，低鹽組的SOD酶活性為空白對(duì)照組的89%，且兩者之間無顯著性差異；高鹽組的SOD酶活性為空白對(duì)照組的80%，其與空白對(duì)照組有顯著性差異。脫水紅霉素的存在均導(dǎo)致SOD酶活性增強(qiáng)，可達(dá)到空白對(duì)照組的1.18～1.34倍，不同濃度脫水紅霉素組SOD酶活性與空白對(duì)照組和硫酸鹽組相比均具有顯著性差異。

如圖3(b)所示，硫酸鹽組和脫水紅霉素處理組都導(dǎo)致了蛋白核小球藻CAT酶活性的增加。低鹽組和高鹽組中，蛋白核小球藻的CAT酶活性可達(dá)到空白對(duì)照組的2.81倍和2.03倍，與空白對(duì)照組具有顯著性差異。蛋白核小球藻的CAT酶活性隨脫水紅霉素濃度增加而增加，在脫水紅霉素濃度為0.14和0.87 mmol·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的CAT活性分別為對(duì)照組的1.79倍和3.89倍。在脫水紅霉素濃度為0.2～0.6 mmol·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的CAT活性與低鹽組無顯著性差異。脫水紅霉素濃度為0.14 mmol·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的CAT活性與高鹽組無顯著性差異，其余脫水紅霉素處理組與高鹽組具有顯著性差異。

圖3 脫水紅霉素暴露96 h對(duì)蛋白核小球藻的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig. 3 Effect of dehydroerythromycin on the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities of Chlorella pyrenlidosa after exposure for 96 h

2.2.3 MDA含量

脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻MDA含量的影響如圖4所示。硫酸鹽組和脫水紅霉素組都導(dǎo)致了MDA含量的增加。低鹽組和高鹽組的MDA含量是空白對(duì)照組的1.70倍和1.80倍，且與對(duì)照組具有顯著性差異。蛋白核小球藻的MDA含量隨脫水紅霉素濃度增加先增大后降低，在脫水紅霉素濃度為0.6 mmol·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的MDA含量可達(dá)到對(duì)照組的3.11倍，當(dāng)脫水紅霉素濃度升高到0.87 mmol·L-1時(shí)，蛋白核小球藻的MDA含量降低，為對(duì)照組的2.58倍。脫水紅霉素處理組與空白對(duì)照組都有顯著性差異，濃度為0.14 mmol·L-1的脫水紅霉素處理組與硫酸鹽組無顯著性差異，而其他濃度的脫水紅霉素處理組與硫酸鹽組均具有顯著性差異。

圖4 脫水紅霉素暴露96 h對(duì)蛋白核小球藻的丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 4 Effect of dehydroerythromycin on the malonaldehyde (MDA) content of Chlorella pyrenlidosa after exposure for 96 h

2.3 藻液中脫水紅霉素濃度變化

不同濃度的脫水紅霉素暴露96 h后，藻液中脫水紅霉素的剩余濃度占其初始濃度的百分比如圖5所示?？傮w上，藻液中脫水紅霉素的剩余濃度與其初始濃度之比隨著脫水紅霉素初始濃度的增加而降低，說明脫水紅霉素的去除量隨脫水紅霉素初始濃度的增加而增加。在脫水紅霉素濃度為0.14 mmol·L-1時(shí)，藻液中脫水紅霉素的剩余量為0.135 mmol·L-1，剩余的脫水紅霉素濃度為其初始濃度的96.2%；當(dāng)脫水紅霉素的初始濃度增加到0.87 mmol·L-1時(shí)，藻液中脫水紅霉素的剩余濃度為0.493 mmol·L-1，剩余的脫水紅霉素濃度為其初始濃度的56.6%。

圖5 暴露96 h后，藻液中脫水紅霉素的剩余濃度與其初始濃度的關(guān)系Fig. 5 The relationship between the residual concentration of dehydroerythromyin and its initial concentration in algae solution after exposure time of 96 h

3 討論(Discussion)

紅霉素的生態(tài)毒性效應(yīng)得到了較為充分的研究，普遍認(rèn)為紅霉素的生態(tài)毒性較高，在環(huán)境濃度水平下就可能引起可觀察到的不利效應(yīng)。González-Pleiter等[12]研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素對(duì)羊角月牙藻(Pseudokirckneriellasubcapitata)的EC50為(0.35±0.03) mg·L-1，對(duì)項(xiàng)圈藻(Anabaena)的EC50為(0.022±0.003) mg·L-1。Eguchi等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素對(duì)羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)的EC50值為0.0366 mg·L-1，對(duì)普通小球藻(Chlorellavulgaris)的EC50為33.8 mg·L-1。El-Bassat等[17]研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素對(duì)普通小球藻(Chlorellavulgaris)的24 h半數(shù)致死濃度(LC50)值為12 mg·L-1，對(duì)尾草履蟲(Parameciumcaudatum)的48 h-LC50值是16 mg·L-1。本研究中，脫水紅霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)量和比生長(zhǎng)率的96 h-EC50值分別為0.267和0.117 mmol·L-1，即83.76 mg·L-1和191.15 mg·L-1，明顯高于紅霉素對(duì)綠藻的毒性數(shù)據(jù)，說明脫水紅霉素的生態(tài)毒性低于紅霉素。水和廢水檢測(cè)方法[25]中規(guī)定，藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)對(duì)毒物毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：96 h-EC50<1 mg·L-1時(shí)為極高毒，在1～10 mg·L-1之間為高毒，在10～100 mg·L-1之間為中毒，>100 mg·L-1時(shí)為低毒，脫水紅霉素對(duì)于蛋白核小球藻屬于中-低毒物質(zhì)。

葉綠素是各種浮游藻類中廣泛存在的天然色素，是客觀反映植物利用光照能力的一類重要指標(biāo)，往往可以作為判斷植物光合生理能力、反映環(huán)境脅迫狀況的依據(jù)[26]。因此，葉綠素含量的變化趨勢(shì)可以反映蛋白核小球藻在各發(fā)育階段的生長(zhǎng)狀態(tài)。暴露于脫水紅霉素96 h后，蛋白核小球藻細(xì)胞的葉綠素含量顯著降低，且隨著脫水紅霉素濃度的增加而降低，表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這與紅霉素對(duì)羊角月牙藻葉綠素的影響是一致的[27]。研究表明，紅霉素作為蛋白質(zhì)合成抑制劑，可以有效抑制原核生物基因的表達(dá)，而葉綠體在基因表達(dá)等方面與原核生物具有很高的相似性，因此，紅霉素可能對(duì)葉綠體基因表達(dá)有抑制作用[27-29]。而脫水紅霉素具有與紅霉素相似的結(jié)構(gòu)，其對(duì)葉綠素a的影響可能也是因?yàn)橐种屏巳~綠體基因的表達(dá)，阻礙了葉綠素的合成造成的。

MDA是膜脂中的脂肪酸的一種過氧化產(chǎn)物，也是脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)，常用來反映環(huán)境污染脅迫對(duì)藻細(xì)胞帶來的過氧化損害[39-40]。研究表明，暴露于螺旋霉素和四環(huán)素等有機(jī)污染物時(shí)，可導(dǎo)致植物細(xì)胞中MDA含量顯著升高[41-42]。本研究中，脫水紅霉素暴露也導(dǎo)致了MDA含量的升高，這說明脫水紅霉素誘導(dǎo)的SOD和CAT酶活性升高并不足以清除細(xì)胞體內(nèi)的氧化自由基，脫水紅霉素對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫，并導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物MDA的積累，影響了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞功能的不可逆損傷[27]，并進(jìn)而影響到藻的生長(zhǎng)和生理生化功能。

值得注意的是，盡管鹽分的存在未影響蛋白核小球藻的生長(zhǎng)，但是卻對(duì)其生理生化響應(yīng)產(chǎn)生了一定的影響。硫酸鹽組導(dǎo)致葉綠素a含量略微降低，與空白組之間無顯著性差異。這可能是因?yàn)榱蛩徕c能抑制葉綠體中PSⅡ活動(dòng)中的電子移轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致PSⅡ中的量子產(chǎn)率也相應(yīng)的受到抑制，影響了葉綠素的合成[43]。硫酸鹽組導(dǎo)致了SOD酶活性略微降低，CAT酶活性和MDA含量升高，這說明過量的硫酸鈉鹽分也會(huì)對(duì)綠藻產(chǎn)生氧化脅迫[44]。

暴露96 h后，藻液中脫水紅霉素的去除率隨其初始濃度增加而增高，在脫水紅霉素濃度為0.87 mmol·L-1時(shí)，脫水紅霉素的去除率可達(dá)到43%。由于脫水紅霉素難以水解和生物降解[45]，其在藻液中的消除可能主要是由于蛋白核小球藻的表面吸附、吸收以及代謝作用，但這3種途徑對(duì)脫水紅霉素去除率的貢獻(xiàn)，以及脫水紅霉素在細(xì)胞體內(nèi)的積累、代謝過程及其毒作用機(jī)理還待于進(jìn)一步的研究。