磷酸三苯酯(TPP)和磷酸三(2-氯異丙基)酯(TCPP)誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞HEK293凋亡的機制研究

王曉晴，劉佳琳，李斐,*，曹天貴，吳惠豐,2，孟祥敬，吉成龍,2

1. 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點實驗室，中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，山東省海岸帶環(huán)境過程重點實驗室，煙臺 264003 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，青島 266237 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

隨著溴系阻燃劑在全球范圍內(nèi)被逐步禁用，有機磷酸酯阻燃劑(OPFRs)被廣泛應(yīng)用于建筑材料、電子產(chǎn)品、塑料制品、家裝飾品和紡織品中，降低各種材料的易燃性[1]。由于是添加型阻燃劑，OPFRs進入環(huán)境的幾率較高，目前已經(jīng)在大氣、水體等多種環(huán)境介質(zhì)及生物體中檢出OPFRs，并且其濃度呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[2-5]。釋放到環(huán)境中的OPFRs在結(jié)構(gòu)上類似于具有神經(jīng)毒性的有機磷殺蟲劑，具有潛在的環(huán)境和健康風(fēng)險[6-13]，Dishaw等[1]發(fā)現(xiàn)，磷酸三(2-氯異丙基)酯(TCPP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)和磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯(TDCPP)等通過減少細(xì)胞數(shù)量、改變神經(jīng)分化等方式影響神經(jīng)發(fā)育，研究表明，部分OPFRs具有與四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)和部分有機磷農(nóng)藥相當(dāng)甚至更強的神經(jīng)發(fā)育毒性。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于TCPP和TDCPP后，均能顯著干擾其體內(nèi)性激素的平衡，具有一定的內(nèi)分泌干擾作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)灰塵中含有多種較高濃度的OPFRs，對人體健康具有潛在的不良影響。例如，Meeker和Stapleton[7]發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)粉塵中檢測到的部分高濃度OPFRs包括TDCPP和磷酸三苯酯(TPP)會降低男性相關(guān)激素水平(甲狀腺激素和雄性激素)和精子濃度，造成精液質(zhì)量下降，甚至可能引起不孕不育等不良結(jié)局。Wang等[8]的研究顯示，烷基和芳基取代的OPFRs能夠顯著抑制氨基酸脫氫酶的活性。因此，深入研究OPFRs的毒性機制是極為必要的，為該類化合物污染的早期防控和管理提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

腎臟是生物體的重要器官，在機體進行代謝、排毒和調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用。若腎臟細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞HEK293)受損，很可能干擾腎臟的正常功能，對機體造成不利影響。目前，關(guān)于OPFRs對腎細(xì)胞毒性的研究尚不充分，有必要探討OPFRs對HEK293細(xì)胞的毒理效應(yīng)機制。細(xì)胞凋亡已被認(rèn)為是污染物對細(xì)胞毒性效應(yīng)的重要表現(xiàn)。近年來，已有研究表明，OPFRs可刺激細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-18]。線粒體作為執(zhí)行細(xì)胞凋亡的主要細(xì)胞器[19]，在凋亡發(fā)生過程中，伴隨著線粒體功能(膜通透性改變、膜電位的降低)和形態(tài)的改變，導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的升高，進而通過DNA損傷的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。作為關(guān)鍵抑癌基因p53，其突變與半數(shù)腫瘤的發(fā)生相關(guān)[21-22]。當(dāng)污染物小分子以較強的作用力(嵌插作用或共價結(jié)合)結(jié)合DNA時，可通過抑制DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄或堿基錯配等方式，引起DNA點突變[23-24]。目前有關(guān)OPFRs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機制的研究工作也已展開，但凋亡效應(yīng)機制尚不明晰。

本研究選取2種代表性O(shè)PFRs(TPP和TCPP)，采用流式細(xì)胞儀和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)，研究了TPP和TCPP對人胚腎細(xì)胞HEK293的相關(guān)基因(細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激)表達量變化的影響，探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制。鑒于OPFRs對HEK293細(xì)胞中p53基因的表達水平均可造成影響，結(jié)合紫外-可見光譜和熒光光譜，進一步檢測了TPP和TCPP與p53-DNA之間的結(jié)合方式并計算結(jié)合作用常數(shù)，研究TPP和TCPP誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS升高、造成的DNA損傷與細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性，闡明TPP/TCPP與p53基因的作用機制，為OPFRs的毒性效應(yīng)機理研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：SW-CJ-1FD型潔凈工作臺和YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)；INCO2/108型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)；XDS-1B型倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；5804R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；FACSAria流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；Nanodrop2000微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)；7500Fast實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

試劑：TPP和TCPP購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素溶液(雙抗)以及磷酸鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)均購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，純度>99%，購自美國MP Biomedicals公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2’,7’-二氯熒光素雙乙酸鹽(2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate, DCFH-DA)購自美國Sigma公司；TRIzol總RNA提取試劑購自日本寶生物工程株式會社；SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為超純水。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞增殖

將復(fù)蘇的HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(90% DMEM培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和1%的雙抗)中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2和相對濕度95%。傳代培養(yǎng)，直至細(xì)胞達到對數(shù)生長期。TPP/TCPP溶于二甲基亞砜(DMSO)制成不同濃度的暴露溶液，等量的DMSO作為溶劑對照組。

達到對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗、胰蛋白酶消化、培養(yǎng)液重懸、離心和棄上清液后，再次加入培養(yǎng)液，并將其接種于96孔板中，進行培養(yǎng)。每孔加入終濃度分別為0 (溶劑對照組)、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5和10-4mol·L-1的TPP及TCPP暴露溶液。培養(yǎng)24 h后，加入培養(yǎng)液和CCK-8試劑，于培養(yǎng)箱孵育1 h，使用酶標(biāo)儀測吸光度(450 nm)。

1.3 細(xì)胞凋亡及活性氧(ROS)的影響

將處于對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞暴露于不同濃度(10-6、10-5和10-4mol·L-1)的TPP和TCPP中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，經(jīng)染色處理(細(xì)胞凋亡測定采用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒染色，ROS水平測定采用DCFH-DA熒光染料染色)，上樣分析。

細(xì)胞凋亡：收集暴露后的細(xì)胞用PBS緩沖液重懸，按照操作手冊加入相應(yīng)劑量的Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，分別避光孵育。使用流式細(xì)胞儀進行檢測(細(xì)胞數(shù)量為1×104個)，分析細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞內(nèi)ROS水平：收集暴露后的細(xì)胞用PBS緩沖液重懸，加入5 μL 5×10-4mol·L-1的DCFH-DA溶液，避光孵育1 h。使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)DCFH熒光強度，參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.4 凋亡相關(guān)基因表達水平的檢測

采用TRIzol法提取RNA。加入氯仿離心分層樣品，收集上清液(含RNA)，向其中加入異丙醇，用于沉淀還原RNA(實驗條件≤0 ℃，用以抑制RNA酶的活性)。采用微量紫外分光光度計測定RNA濃度(濃度范圍：A260 nm/A280 nm介于1.8～2.2，A260 nm/A280 nm分別為RNA于260 nm與280 nm處吸光度)。將樣品濃度調(diào)至500 mg·L-1，進行cDNA反轉(zhuǎn)。隨后，采用SYBR Green熒光定量試劑盒進行qRT-PCR檢測，檢測凋亡相關(guān)基因的表達水平，2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)[25]。

1.5 分子模擬

分子模擬技術(shù)被用于研究小分子配體與雙螺旋DNA間的結(jié)合位點和作用模式，進而確定兩者的結(jié)合作用機理。首先，通過網(wǎng)站(http://structure.usc.edu/make-na/server.html)獲得p53基因的三維結(jié)構(gòu)。采用Discovery studio 2.5(簡稱DS 2.5)研究TPP/TCPP與p53基因片段間的結(jié)合構(gòu)象，相關(guān)參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。采用動力學(xué)和模擬退火方法優(yōu)化和精確配體-受體構(gòu)象。分子對接的結(jié)果有助于剖析OPFRs與p53基因片段間的關(guān)鍵相互作用。

1.6 光譜法測定TPP/TCPP與p53基因的相互作用

光譜法通過測定吸光度及熒光強度的改變，研究小分子配體與DNA間相互作用。目前廣泛利用紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法研究污染物與DNA之間的作用。

紫外-可見吸收光譜法利用DNA堿基的光學(xué)特性，研究污染物結(jié)合DNA對吸收峰的峰位置及峰強度的影響。通過p53基因啟動子區(qū)域片段(p53-DNA)的2條互補單鏈DNA序列合成雙鏈p53-DNA溶液(5×10-4mol·L-1)。將p53-DNA稀釋至2×10-6mol·L-1，并與TPP和TCPP溶液等體積混合，配制成一定濃度的混合溶液(混合溶液中TPP/TCPP的濃度為0、1×10-6、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6和10×10-6mol·L-1，p53-DNA的濃度為1×10-6mol·L-1)。避光反應(yīng)2 h后，進行紫外-可見吸收光譜掃描，掃描范圍為190～350 nm。

圖1 磷酸三苯酯(TPP)和磷酸三(2-氯異丙基)酯(TCPP)對HEK293細(xì)胞增殖的影響注：與對照組相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 1 Effect of triphenyl phosphate (TPP) and tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate (TCPP) on the proliferation of HEK293 cellsNote:*P<0.05, **P<0.01, compared with the control.

熒光光譜法利用溴化乙錠(EB)嵌入結(jié)合DNA產(chǎn)生熒光，EB本身不具備較強的熒光，與DNA結(jié)合后熒光強度大大增強?；诖颂匦?，可通過檢測不同濃度下TPP/TCPP對EB-p53-DNA體系熒光強度的影響，研究污染物小分子與DNA間的相互作用。用PBS緩沖液稀釋p53-DNA溶液，p53-DNA稀釋液(1×10-6mol·L-1)與EB原液(1×10-3mol·L-1)按1:100的比例混合，避光30 min，使兩者充分結(jié)合，得到EB-p53-DNA體系。將不同體積的TPP/TCPP原液與EB-p53-DNA體系混合，配成終濃度為0、1×10-6、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6和10×10-6mol·L-1的混合液。避光反應(yīng)2 h后，采用熒光分光光度計進行熒光光譜掃描，參比溶液為PBS緩沖液、掃描范圍為190～350 nm，發(fā)射波譜范圍為500～800 nm，激發(fā)波長為480 nm。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TPP和TCPP對HEK293細(xì)胞增殖的影響

通過CCK-8試劑盒檢測TPP及TCPP對HEK293細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如圖1(a)和1(b)所示，10-9～10-4mol·L-1TPP及TCPP對細(xì)胞增殖存在從促進到抑制的過程(P<0.05)。因此，選取后續(xù)暴露濃度10-6、10-5和10-4mol·L-1。

2.2 TPP和TCPP對HEK293細(xì)胞凋亡及ROS的影響

處于對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞經(jīng)暴露培養(yǎng)24 h后，基于Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒及DCFH-DA熒光染料，通過流式細(xì)胞儀分別觀測其細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞內(nèi)ROS水平。圖2(a)和圖2(b)分別為不同濃度TPP和TCPP對HEK293細(xì)胞凋亡及胞內(nèi)ROS水平的影響。

由圖2(a)可知，與對照組相比，TPP暴露組的凋亡率顯著上升(P<0.05)，且與濃度呈正向的劑量-效應(yīng)關(guān)系；TCPP濃度為10-5和10-4mol·L-1時，細(xì)胞凋亡率亦顯著上升(P<0.05)；在各濃度組中，TPP比TCPP造成的細(xì)胞凋亡率更高。證明一定濃度的TPP和TCPP均可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡，TPP更易誘導(dǎo)HEK293的細(xì)胞凋亡。由圖2(b)可知，TCPP各暴露組相對于對照組ROS水平均顯著上升(P<0.05)，與凋亡結(jié)果相一致；而TPP則表現(xiàn)為：10-6和10-5mol·L-1暴露組顯著提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平(P<0.01)，而在10-4mol·L-1暴露組中，ROS含量顯著降低(P<0.01)，這可能由于高濃度(10-4mol·L-1)的TPP導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡及破碎，導(dǎo)致胞內(nèi)ROS水平無法被檢測到。Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TPP可以誘導(dǎo)氧化損傷，影響抗氧化酶和相關(guān)基因的表達，包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。

圖2 TPP和TCPP對HEK293細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的影響注：與對照組相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 2 Effects of TPP and TCPP on apoptosis and reactive oxygen species (ROS) level in HEK293 cellsNote: compared with the control, * P<0.05, ** P<0.01.

2.3 TPP和TCPP對HEK293細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達量的影響

處于對數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞暴露培養(yǎng)24 h后，采用TRIzol法提取RNA，經(jīng)變性、反轉(zhuǎn)后獲得cDNA。采用SYBR Green熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR。選取的凋亡相關(guān)基因主要包括p53、Bcl-2家族成員的編碼基因(Bcl-2、Bax、Bad和Hrk)以及Caspases家族成員的編碼基因Caspase7。目的基因及內(nèi)參基因(HPRT1)引物設(shè)計如表1所示。對qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行處理，得到HEK293細(xì)胞中各凋亡相關(guān)基因表達水平的變化如表2所示。

與對照組相比，TPP暴露組中，除了Bax及Hrk基因的表達量，p53、Bcl-2、Bad和Caspase7基因的表達量隨TPP和TCPP濃度的升高而逐漸增加。在10-6mol·L-1及10-5mol·L-1TPP暴露組中，Bcl-2表達量顯著上升(P<0.05)；10-4mol·L-1TPP暴露使Bad及Caspase7表達量顯著上升(P<0.05)，p53及Bcl-2表達量顯著上升(P<0.01)。在10-5mol·L-1TCPP暴露組中，p53及Bax表達量顯著上升(P<0.05)，Hrk表達量顯著上升(P<0.01)；10-4mol·L-1TCPP暴露使p53、Bax、Bcl-2及Caspase7表達量顯著上升(P<0.05)，使Bad及Hrk表達量顯著上升(P<0.01)?；虮磉_量的顯著改變，指示了線粒體途徑中的Bcl-2家族通過相互作用共同促使MPTP開放，進而導(dǎo)致HEK293細(xì)胞的凋亡。

qRT-PCR結(jié)果顯示，中濃度組(10-5mol·L-1)及高濃度組(10-4mol·L-1)的TPP及TCPP暴露上調(diào)了p53基因的表達水平，推測過多ROS的產(chǎn)生造成DNA損傷，進而促使p53基因過表達參與細(xì)胞凋亡。這與細(xì)胞凋亡結(jié)果存在一致性，且p53基因的表達水平隨OPFRs濃度的升高而上調(diào)。這說明，p53基因在TPP及TCPP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡中同樣發(fā)揮重要作用。此外，TPP及TCPP暴露上調(diào)了HEK293細(xì)胞p53及Bax基因，推測2種典型OPFRs通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p53基因水平，進而促進Bax的表達并轉(zhuǎn)移至線粒體。此外，表2中Caspase凋亡執(zhí)行因子Caspase7的表達量在TPP及TCPP的高濃度組(10-4mol·L-1)被上調(diào)，說明在線粒體途徑后期，Caspase7被激活，進而實現(xiàn)凋亡。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences used for qRT-PCR

2.4 分子模擬TPP/TCPP與p53-DNA的相互作用

基于qRT-PCR的實驗結(jié)果，選取p53基因作為與凋亡相關(guān)的靶標(biāo)基因，通過分子對接研究TPP/TCPP分子與p53間的相互作用方式。如圖3所示，TPP/TCPP與DNA分子通過氫鍵、疏水和π-π相互作用緊密結(jié)合。TPP的苯環(huán)通過嵌入方式插到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，從而損傷雙螺旋結(jié)構(gòu)(圖3(a))，TCPP通過溝槽結(jié)合方式影響DNA結(jié)構(gòu)(圖3(b))。

2.5 TPP/TCPP與p53-DNA結(jié)合作用的研究

通過分子對接構(gòu)象分析，發(fā)現(xiàn)TPP和TCPP能夠與p53結(jié)合，插到DNA的雙螺旋中，從而損傷雙螺旋結(jié)構(gòu)。進一步采用光譜法從分子水平探究TPP及TCPP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)機制。

紫外-可見吸收光譜法研究發(fā)現(xiàn)，加入TPP/TCPP后，p53基因片段在255 nm處的吸收峰峰位隨OPFRs濃度的增加而產(chǎn)生藍(lán)移(1.0～3.5 nm)，詳情見表3。吸光度隨OPFRs濃度的增加而增大，產(chǎn)生增色效應(yīng)(圖4(a)和圖4(c))，這說明，TPP/TCPP可能通過插入p53-DNA堿基對中，破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。圖4(b)和圖4(d)為不同濃度TPP/TCPP與EB-p53-DNA相互作用的熒光光譜。TPP/TCPP使得EB-DNA體系的熒光強度(597 nm)隨OPFRs濃度的增加而減小，造成熒光猝滅。

圖3 TPP/TCPP分子與p53在結(jié)合位點的相互作用注： 配體鍵， 受體鍵，氫鍵，具有疏水作用的受體氨基酸殘基，相應(yīng)的具有疏水作用的原子。Fig. 3 Docking views of TPP/TCPP and hydrophobic interaction between TPP/TCPP and p53 gene in the binding siteNote: Ligand bond; Non-ligand bond; Hydrogen bond and its length; Non-ligand residues involved in hydrophobic contacts; Corresponding atoms involved in hydrophobic contacts.

圖4 TPP/TCPP與p53-DNA片段相互作用的紫外和熒光光譜注：1～7表征不同濃度組，依次為0、1×10-6、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6和10×10-6 mol·L-1。Fig. 4 The UV-Vis spectra and fluorescence spectra of the interaction between TPP/TCPP and p53-DNA fragmentsNote: Curve 1 to 7 representing different concentration groups, i.e., 0, 1×10-6, 2×10-6, 4×10-6, 6×10-6, 8×10-6 and 10×10-6 mol·L-1.

表2 不同濃度TPP/TCPP對HEK293細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達量的影響Table 2 The expression of apoptosis-related genes in HEK293 cells under different concentrations of TPP/TCPP

注：與對照組相比，*P<0.05、**P<0.01。

Note: compared with the control,*P<0.05,**P<0.01.

表3 TPP/TCPP與p53基因片段作用的紫外和熒光光譜相關(guān)數(shù)據(jù)Table 3 Relevant data values of ultraviolet and fluorescence spectra of TPP/TCPP and fragments of p53 gene

3 討論(Discussion)

Bcl-2家族對細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)控作用，其中既有促進凋亡的蛋白(如Bax)，也有抑制凋亡的蛋白(如Bcl-2)[27-28]。Bcl-2家族成員大多數(shù)定位于線粒體外膜上。因此，Bcl-2家族主要通過改變線粒體膜的通透性，進而影響內(nèi)源線粒體凋亡途徑來調(diào)控凋亡[27]。本研究選取了一系列Bcl-2家族蛋白的編碼基因進行研究，包括Bcl-2(抑制凋亡)、Bax、Bad和Hrk(促凋亡)。其中，Bax基因的啟動子能夠結(jié)合與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的p53基因。當(dāng)外界刺激或內(nèi)源活性氧升高造成DNA損傷時，p53基因首先通過阻礙細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，進而修復(fù)損傷。當(dāng)損傷無法修復(fù)時，p53基因又通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29-31]。故在凋亡早期，p53基因能夠促進Bax的轉(zhuǎn)錄表達[29]。本實驗中，Bax基因的表達水平在TPP和TCPP高濃度組(10-4mol·L-1)均出現(xiàn)上調(diào)趨勢，推測TPP和TCPP上調(diào)HEK293細(xì)胞內(nèi)的p53基因水平，進而促進Bax的表達并轉(zhuǎn)移至線粒體中。

Caspase家族是凋亡的主要參與者，在線粒體途徑后期，細(xì)胞色素c(cyt c)被線粒體釋放至胞質(zhì)中。cyt c與凋亡蛋白活性因子-1(Apaf-1)結(jié)合，在dATP/ATP存在下，活化Caspase9，進而激活下游的Caspase凋亡執(zhí)行因子Caspase7，實現(xiàn)細(xì)胞凋亡。結(jié)合轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果，分析TPP及TCPP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡的機制(圖5)。一定劑量的TPP及TCPP通過上調(diào)HEK293細(xì)胞內(nèi)的p53基因水平，促進Bax等基因的表達，進而在線粒體途徑中釋放cyt c，最終激活Caspase7實現(xiàn)凋亡。

分子模擬技術(shù)有助于研究小分子配體與受體間的結(jié)合作用機理[32]。研究表明，小分子與雙螺旋DNA的結(jié)合方式主要包括靜電式、嵌入式和溝槽式[33-34]。分子對接的結(jié)果顯示，TPP及TCPP與p53片段通過嵌入式和溝槽式結(jié)合，嵌插到DNA雙螺旋中，進而損傷DNA結(jié)構(gòu)。結(jié)合紫外及熒光譜圖分析發(fā)現(xiàn)，EB的置換量與TPP的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。推測TPP在嵌入式結(jié)合p53片段的過程中，同EB競爭p53-DNA的結(jié)合位點，將EB從DNA的雙螺旋中置換出來，造成結(jié)合DNA的EB濃度降低，體系熒光強度減弱。而TCPP以溝槽方式結(jié)合p53-DNA，改變基因片段的框架結(jié)構(gòu)，造成EB的流出，引起熒光猝滅。結(jié)合實驗和分子對接結(jié)果，說明了TPP/TCPP與p53的結(jié)合，在一定程度上影響了p53-DNA的結(jié)構(gòu)，進而干擾了相關(guān)基因(Bax、Hrk、Bcl-2和Bad)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達，導(dǎo)致線粒體途徑釋放cyt c，最終激活Caspase7實現(xiàn)細(xì)胞凋亡。本研究探討了典型OPFRs誘導(dǎo)凋亡的有害結(jié)局通路(AOP)通路，為化學(xué)品的污染防控提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

圖5 TPP/TCPP誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞凋亡通路圖Fig. 5 The apoptosis pathway of HEK293 cells induced by TPP/TCPP