二噁英類(lèi)化合物的離線(xiàn)檢測(cè)技術(shù)研究綜述

王立振

(煙臺(tái)黃金職業(yè)學(xué)院，山東 招遠(yuǎn) 265401)

二噁英是一種在環(huán)境中可持久存在有機(jī)污染物(POPs)，包含多氯代二苯并呋喃(PCDFs)類(lèi)化合物和多氯代二苯并-對(duì)-二噁英(PCDDs)[1-2]，其中屬2,3,7,8-四氯二苯并-對(duì)-二噁英(TCDD)化合物的毒性最強(qiáng)[3]，具有極強(qiáng)的致癌性。二噁英類(lèi)化合物的毒性一般以毒性當(dāng)量因子( TEF)，即某具體化合物分子的毒性當(dāng)量( TEQ) 與TCDD的毒性當(dāng)量之比，表示該二噁英異構(gòu)體分子的毒性。

環(huán)境中的二噁英主要由各類(lèi)含氯化合物參與的燃燒過(guò)程排放[4]。開(kāi)展二噁英的準(zhǔn)確定量分析，是避免人類(lèi)遭受二噁英污染的重要途徑。目前二嗯英類(lèi)化合物的檢測(cè)分析方法按檢測(cè)時(shí)間來(lái)分主要有離線(xiàn)檢測(cè)與在線(xiàn)檢測(cè)即實(shí)時(shí)檢測(cè)，國(guó)際上常用采用離線(xiàn)分析的方法檢測(cè)二噁英，即現(xiàn)場(chǎng)采集待測(cè)樣品后，經(jīng)濃縮提純后再用特定儀器去分析[5]。本文主要對(duì)二嗯英類(lèi)化合物的離線(xiàn)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

1.1 同位素高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)

目前同位素高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，是最權(quán)威的二噁英定性定量檢測(cè)技術(shù)。該方法一般包括為外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和同位素法，和外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法相比，同位素法主要具有特異性強(qiáng)、選擇性好、檢出限低，能分離每種二噁英同類(lèi)物并準(zhǔn)確度量，但是其樣品前處理復(fù)雜，測(cè)試周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、需專(zhuān)業(yè)測(cè)試設(shè)備和人員要求高。

1.2 低分辨率氣相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)

低分辨率氣相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用在檢測(cè)要求不高的情況下也能滿(mǎn)足二噁英檢測(cè)的部分要求，不過(guò)其在樣品預(yù)處理階段要求較高，需要高純度，這樣能把背景干擾盡量降低。該法具有檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)。但檢測(cè)靈敏度比較低，檢測(cè)過(guò)程容易受到其他因素的干擾，前期純化要求較高，因此該方法僅限于分析二嗯英類(lèi)化合物濃度比較高的樣品如土壤、廢水、燃油等[6]。

1.3 三重四極桿質(zhì)譜

三重四極桿質(zhì)譜是一種質(zhì)譜串聯(lián)并用的方法，采用多次分離檢測(cè)的方法，能夠有效減少雜離子的干擾，降低了背景噪音，提高了檢測(cè)選擇性與靈敏度。日本已將其用于二噁英的篩選檢測(cè)中，通過(guò)初步篩選確定二噁英的存在與否，減輕了實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)壓力。三重四極桿質(zhì)譜方法對(duì)樣品預(yù)處理中的樣品純化要求也比較高，但其盡可能把基質(zhì)背景干擾降到最小，有潛力作為二噁英實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的新的發(fā)展方向[7]。

2 生物檢測(cè)技術(shù)

二噁英的離線(xiàn)生物檢測(cè)技術(shù)一般有如下設(shè)計(jì)策略：1.在二噁英-AhR復(fù)合物的響應(yīng)因子(DRE)上加入指示性蛋白的基因片段或指示性基因片段；2. 以PCR法直接檢測(cè)二噁英-AhR復(fù)合物的響應(yīng)因子(DRE)；3. 二噁英或特異抗體AhR上修飾指示物或信號(hào)反應(yīng)物。

2.1 酶活力誘導(dǎo)法

二噁英與生物體內(nèi)的受體-AhR，具有特異親和力，二噁英與AhR結(jié)合活化后，被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而活化核內(nèi)的特定DNA片段，即二噁英響應(yīng)因子(DRE)，并增加其轉(zhuǎn)錄，從而激活 7-乙氧基-異吩惡唑酮-脫乙基(EROD)酶的活性，使 7-乙氧基-異吩惡唑酮(ERF)脫乙基產(chǎn)生熒光, 測(cè)定熒光強(qiáng)度即能反映二噁英激活A(yù)hR受體的能力，根據(jù) 2, 3,7, 8-TCDD 做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，能夠間接計(jì)算出測(cè)試樣品二噁英的相對(duì)含量[8]，，該方法前處理比較簡(jiǎn)化、檢測(cè)周期短，適用于快速定量篩選分析大批量環(huán)境樣品中的二噁英的濃度，但檢測(cè)成本比較高，檢測(cè)靈敏度低，且純化樣品中易存留雜污染物的干擾，導(dǎo)致分析結(jié)果偏高。

2.2 熒光素酶報(bào)告基因法

熒光素酶報(bào)告基因法(CALUX)是以蟲(chóng)熒光素酶基因作為報(bào)告基因，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染含AhR 的細(xì)胞株，該細(xì)胞株可因 AhR與芳香烴二噁英類(lèi)物質(zhì)接觸后，被激活，進(jìn)而表達(dá)蟲(chóng)熒光素酶蛋白。通過(guò)測(cè)定蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，即可求得樣品中與 AhR 結(jié)合的二噁英類(lèi)物質(zhì)的毒性當(dāng)量(TEQ)值。美國(guó)與日本已經(jīng)認(rèn)定此分析方法為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)分析法之一[9]與EROD方法相比，該方法檢測(cè)靈敏度較高，檢測(cè)周期短、檢測(cè)成本較低，更適合于大量環(huán)境樣品中二噁英的篩選與初步定量測(cè)定。

2.3 外切酶保護(hù) PCR 分析法

外切酶保護(hù) PCR 分析法是指，二噁英與受體(AhR) 特異性結(jié)合后再與一段特殊 DNA(DRE) 結(jié)合，該結(jié)合物能夠免遭外切酶攻擊，而外切酶會(huì)消化去除未結(jié)合的游離DNA的二噁英應(yīng)答元件(DRE)，酶切后通過(guò)實(shí)時(shí)PCR 擴(kuò)增受到結(jié)合保護(hù)的二噁英應(yīng)答元件(DRE)，即可定性和定量地測(cè)算二噁英含量[10]。外切酶保護(hù) PCR 檢測(cè)法，具有較高的靈敏度，但是其測(cè)算誤差較大，目前還未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，在食品和飼料中檢測(cè)二噁英時(shí)具有有效靈敏度和可重復(fù)性。

2.4 納米金生物條形碼技術(shù)

納米金生物條形碼技術(shù)主要原理：TCDD受體復(fù)合物被能夠與其特異結(jié)合的抗體捕獲并固定在固相載體上，在一定反應(yīng)條件下進(jìn)一步相互識(shí)別并與生物條形碼GNP-DRE 探針相結(jié)合。該條形碼探針進(jìn)行第一輪擴(kuò)增信號(hào)后，在包被親合素的固相載體內(nèi)表面，加載第二批納米金標(biāo)記的探針seq-γ，而后經(jīng)納米金催化的銀染增強(qiáng)反應(yīng)產(chǎn)生較高靈敏度的可識(shí)別信號(hào)，經(jīng)檢測(cè)并記錄其吸光度，吸光度大小與二噁英濃度具有特定關(guān)系，這樣就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)痕量二噁英的定性與定量檢測(cè)[11]。方法操作規(guī)程簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短只要5～6 h， 成本低，可同時(shí)做多個(gè)樣本的檢測(cè)，靈敏度高，檢測(cè)限達(dá)0.01 pmol/ L，線(xiàn)性范圍寬，具有很高的推廣價(jià)值。

2.5 酶聯(lián)免疫分析法

酶聯(lián)免疫分析法是以抗體與抗原的特異性吸附為基礎(chǔ)的。當(dāng)前廣泛應(yīng)用的主要有競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫分析法 ELISA[12]，該方法將與二噁英特異性結(jié)合的抗體DD3固定后，使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的2,3,7,8-TCDD半抗原和樣品中二噁英共同競(jìng)爭(zhēng)DD3抗體的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)結(jié)合上抗體的抗原標(biāo)記酶催化底物顯色，根據(jù)2,3,7,8- TCDD作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，能夠計(jì)算出該樣品中二噁英類(lèi)化合物的TEQ，這種酶聯(lián)免疫分析法中，酶催化后底物后的溶液顯色強(qiáng)度與樣品中二噁英的濃度成反比。該方法操作較簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，檢測(cè)周期比較短。但是ELISA只在高度污染的基質(zhì)中檢測(cè)時(shí), 才得到理想結(jié)果。缺點(diǎn)是靈敏度不夠，抗干擾性弱，其所測(cè)值往往偏高，抗體制造過(guò)程成本較高。

2.6 DELFIA 熒光免疫法

DELFIA 熒光免疫法[8]首先需要選擇出能與特定二噁英異構(gòu)體分子競(jìng)爭(zhēng)抗體的抗原，讓該抗原連接上銪離子，然后利用連接銪離子的抗原在反應(yīng)溶液中與待測(cè)樣品中二噁英競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，待競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)完后加入解離液液，使連接在抗原上的銪離子解離下來(lái)，加入熒光增強(qiáng)液使解離下的銪離子高效地發(fā)出熒光。然后用時(shí)間分辨熒光法檢測(cè)溶液中熒光的強(qiáng)度，該溶液中熒光熒光強(qiáng)度與二噁英的 TEQ成反比。該方法前處理比較簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本較低，檢測(cè)周期較短，重復(fù)性好，靈敏度較高。

二噁英離線(xiàn)檢測(cè)技術(shù)中，化學(xué)檢測(cè)法是比較常用的檢測(cè)方法，優(yōu)點(diǎn)是選擇性較好、靈敏度較高，而且可以對(duì)二噁英類(lèi)化合物的單體進(jìn)行定性與定量檢測(cè)；不足之處是前期樣品處理程序較為復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)、成本比較高。生物檢測(cè)法相對(duì)于化學(xué)法具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速，檢測(cè)成本較低，周期較短的優(yōu)點(diǎn)，而且能夠同時(shí)測(cè)定不同的幾種樣品，適合于大批量樣品的高效快速篩選和初步定量檢測(cè)；不足之處是很難排除其它污染物分子的干擾作用，不能獲得二噁英單體的定性分析，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性較差。不過(guò)在一定程度上生物檢測(cè)法與化學(xué)檢測(cè)法兩者具有較好的互補(bǔ)性，在不同情況下根據(jù)不同要求可靈活選用。我國(guó)對(duì)二噁英研究起步比發(fā)達(dá)國(guó)家晚，檢測(cè)方法和水平也存在一定的差距，因此對(duì)二噁英的離線(xiàn)檢測(cè)方法我們應(yīng)該繼續(xù)完善。