巨噬細(xì)胞在心肌梗死中作用的研究進(jìn)展

董 正， 吳潤(rùn)達(dá)， 孫愛軍， 葛均波*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200032 2. 上海市心血管病研究所，上海 200032

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》顯示，目前中國(guó)心血管病死亡率占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上[1]，對(duì)冠心病和心肌梗死后的治療仍是目前面臨的挑戰(zhàn)。過去幾年科學(xué)家深入研究了心臟原位巨噬細(xì)胞和炎癥反應(yīng)時(shí)募集的巨噬細(xì)胞，以及這2類細(xì)胞與心臟其他細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)之間的復(fù)雜關(guān)系[2]。并對(duì)巨噬細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用進(jìn)行了探索。

1 巨噬細(xì)胞的分型和來源

1882年，Metchnikoff首次發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可以吞噬微?；蚱渌?xì)胞，并將這種免疫保護(hù)功能稱作“吞噬作用”(phagocytosis)[3]。近年來研究表明，巨噬細(xì)胞與器官的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)、免疫耐受和免疫應(yīng)答都有密不可分的關(guān)系。在機(jī)體穩(wěn)態(tài)時(shí)，巨噬細(xì)胞起到維持穩(wěn)態(tài)的功能，比如清除組織碎片和介導(dǎo)免疫耐受。同時(shí)巨噬細(xì)胞還兼具所在器官的特異性功能，比如在心臟中可以促進(jìn)電活動(dòng)的傳導(dǎo)[4]。而在心肌梗死后，巨噬細(xì)胞則會(huì)根據(jù)組織微環(huán)境的變化，適應(yīng)性地產(chǎn)生不同的表型并參與其中。

1.1 巨噬細(xì)胞分型 20世紀(jì)80年代科學(xué)家提出了經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2)2種巨噬細(xì)胞類型[5]，用以簡(jiǎn)單區(qū)分和描述巨噬細(xì)胞的表型和功能。如今，可以通過多種方式來為巨噬細(xì)胞分型，比如通過其功能(吞噬功能、免疫功能)、特定的標(biāo)志[F4/80、CD64、Mer 酪氨酸激酶(MerTK)]、形態(tài)學(xué)及其在不同組織中的定位分型。在心臟處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，通過主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)、Ly-6C、趨化因子(C-C 基元)受體2[chemokine (C-C motif) receptor 2，CCR2]和CD11c的表達(dá)將心臟原位巨噬細(xì)胞分成4個(gè)亞群：Ly-6C-MHCⅡhiCX3CR1hiCD206intMerTK+CD11clowCCR2-CD64+巨噬細(xì)胞；Ly-6C-MHCⅡlowCX3CR1intCD206hiMerTK+CD11clowCCR2-CD64+巨噬細(xì)胞；Ly-6C+MHCⅡhi/lowCX3CR1hiCD206hi/intMerTK+CD11clowCCR2-CD64+巨噬細(xì)胞；Ly-6C-MHCⅡhiCX3CR1hiCD206intMerTK+CD11chiCCR2+CD103-CD64+巨噬細(xì)胞[6]。這些亞群在起源上有所不同。隨著年齡的增加，MHCⅡhi巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，而CX3CR1+巨噬細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。在個(gè)體剛出生時(shí)，心臟中絕大多數(shù)巨噬細(xì)胞為MHCⅡlowCX3CR1hi巨噬細(xì)胞，其在原位自我更新維持?jǐn)?shù)量。但隨著年齡的增長(zhǎng)，這種更新機(jī)制逐漸消失，而其他細(xì)胞亞群數(shù)量逐漸增加。近2年，隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)(scRNA-Seq)的不斷發(fā)展，心臟巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志和亞群區(qū)分也愈發(fā)趨于精準(zhǔn)化[7-9]。研究[9]通過無偏倚scRNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)域CD45+白細(xì)胞中至少有7個(gè)巨噬細(xì)胞亞群，這些亞群可以通過非監(jiān)督聚類的分類基因表達(dá)來識(shí)別。通過對(duì)新的亞群功能進(jìn)行發(fā)掘，也會(huì)為將來臨床針對(duì)巨噬細(xì)胞的治療提供新的靶點(diǎn)。

1.2 巨噬細(xì)胞的來源 20世紀(jì)60年代科學(xué)家們普遍認(rèn)為，循環(huán)單核細(xì)胞由骨髓來源的造血干細(xì)胞(HSC)產(chǎn)生，可進(jìn)入組織分化為組織巨噬細(xì)胞[10]。然而，近年的觀點(diǎn)認(rèn)為，許多組織原位巨噬細(xì)胞(如心臟中CCR2-和Ly-6C+巨噬細(xì)胞)自胚胎期便存在于組織之中，并一直通過自我復(fù)制維持更新，并不是靠血液中外來的單核細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充[11-17]。

最近的研究還探討了局部微環(huán)境與細(xì)胞來源對(duì)組織原位巨噬細(xì)胞表型的影響，發(fā)現(xiàn)在大腦中，骨髓來源的巨噬細(xì)胞替代原位小膠質(zhì)細(xì)胞后會(huì)表現(xiàn)出全新的巨噬細(xì)胞表型[18]。朗格漢斯細(xì)胞(皮膚巨噬細(xì)胞)對(duì)電離輻射造成的DNA損傷具有抵抗能力，這是骨髓來源的巨噬細(xì)胞所不具有的特性，反映了胚胎來源的組織巨噬細(xì)胞在各自的組織中具有自我更新的能力[19]。由于大多數(shù)器官有胚胎來源具有特殊功能的巨噬細(xì)胞群，與局部微環(huán)境的相互作用決定了巨噬細(xì)胞特性，并保留了不同器官特異性分子信號(hào)[20]，證明了局部微環(huán)境在巨噬細(xì)胞識(shí)別和功能調(diào)節(jié)中的重要性。

2 巨噬細(xì)胞在心肌梗死中的作用

由于成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞無法再生，因而心肌梗死后，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)一系列原發(fā)性與適應(yīng)性免疫炎癥反應(yīng)及后續(xù)損傷修復(fù)過程，最終使壞死心肌被瘢痕組織取代。心肌梗死后的心臟重構(gòu)與修復(fù)過程可分為3個(gè)階段：急性炎癥期、纖維修復(fù)期和穩(wěn)定增殖期，其中單核/巨噬細(xì)胞扮演了非常重要的角色。

2.1 急性炎癥期 在心肌梗死后1～3 d，即急性炎癥期，此時(shí)心臟原位巨噬細(xì)胞與心肌細(xì)胞大量死亡[21]。細(xì)胞死亡會(huì)使血液中中性粒細(xì)胞和促炎性單核細(xì)胞(小鼠為L(zhǎng)y-6Chi單核細(xì)胞，人類為CD16low單核細(xì)胞[22])向心臟聚集。Ly-6Chi單核細(xì)胞的募集增加了M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，后者具有強(qiáng)大的吞噬功能，在吞噬細(xì)胞碎片的同時(shí)也分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、活性氧類(ROS)和促炎細(xì)胞因子[如白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-12和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]等[23]。炎癥期的巨噬細(xì)胞對(duì)于組織細(xì)胞碎片的清理和梗死區(qū)域的愈合都至關(guān)重要，梗死區(qū)炎癥反應(yīng)紊亂會(huì)導(dǎo)致壞死碎片聚積、心臟功能降低，最終導(dǎo)致心力衰竭[24]。例如，在心肌梗死后，心臟巨噬細(xì)胞表面的吞噬受體MerTK表達(dá)上調(diào)，而敲除MerTK可導(dǎo)致凋亡心肌細(xì)胞的聚積，心臟中性粒細(xì)胞持續(xù)性增加和抗炎細(xì)胞因子IL-10水平降低，并最終導(dǎo)致心功能惡化[25]。

然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥期部分巨噬細(xì)胞會(huì)損傷心臟功能，導(dǎo)致不良預(yù)后。通過對(duì)小鼠心肌梗死后急性期梗死區(qū)域白細(xì)胞行scRNA-Seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一群巨噬細(xì)胞可通過干擾素調(diào)節(jié)因子3 (IRF3)介導(dǎo)與病毒感染相關(guān)的炎癥基因的轉(zhuǎn)錄。這群巨噬細(xì)胞被稱作干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞(IFNIC)。當(dāng)全面敲除編碼IRF3或1型干擾素受體的基因后，小鼠心肌梗死后存活率和心肌修復(fù)都得到了改善[9]。這表明，通過調(diào)節(jié)心肌梗死后炎癥期特定巨噬細(xì)胞的功能和數(shù)量，可以促進(jìn)心肌梗死后修復(fù)和心功能改善。

2.2 纖維增生期和穩(wěn)定期 心肌梗死后3～7 d，由于中性粒細(xì)胞的逐漸消失和Ly-6Clow巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)，炎癥階段逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樾迯?fù)階段，即纖維修復(fù)期和穩(wěn)定增生期。此時(shí)M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，并分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和IL-10[26]。這個(gè)過程依賴核受體亞家族4 A組成員1(nuclear receptor subfamily 4 group A member 1，NR4A1)的介導(dǎo)。NR4A1可通過抑制IL-6、TNF和MMP9的表達(dá)，從而使巨噬細(xì)胞向修復(fù)表型轉(zhuǎn)變。而敲除NR4A1基因會(huì)使M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，并導(dǎo)致愈合不良、纖維化增加，最終發(fā)展為心力衰竭[27]。

M2型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)損傷修復(fù)和瘢痕形成：其分泌的TGF-β和IL-10通過心肌成纖維細(xì)胞介導(dǎo)膠原蛋白的產(chǎn)生；分泌的VEGF可介導(dǎo)血管新生；并通過調(diào)節(jié)MMP和TIMP影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成。在M2型巨噬細(xì)胞的介導(dǎo)下，心肌成纖維細(xì)胞增殖并遷移到梗死區(qū)域，產(chǎn)生膠原蛋白Ⅲ和膠原蛋白Ⅰ[26,28]。此外，使用鹽皮質(zhì)激素抑制劑可以通過誘導(dǎo)修復(fù)性巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生起到心臟保護(hù)作用[29]。

研究[30-31]表明，在同時(shí)缺乏單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的情況下，心肌缺血損傷后膠原和血管生成減少，心肌破裂增加并阻礙心臟損傷后心肌修復(fù)。然而，ApoE-/-小鼠研究表明，巨噬細(xì)胞數(shù)量的大量增加會(huì)導(dǎo)致過度炎癥和心功能受損[32]。這表明，心肌梗死后繼發(fā)的炎癥和修復(fù)性級(jí)聯(lián)反應(yīng)必須受到精確調(diào)控，才能達(dá)到最佳的轉(zhuǎn)歸。如果在心肌梗死后早期炎癥細(xì)胞過量聚集，就會(huì)導(dǎo)致梗死區(qū)室壁變薄以及心肌梗死灶愈合不良。而如果沒有強(qiáng)力的炎癥反應(yīng)過程，死亡的組織碎片在缺血區(qū)域殘留，就會(huì)導(dǎo)致過多的肉芽組織增生，瘢痕修復(fù)不穩(wěn)定，甚至?xí)?dǎo)致左室破裂[33]。

3 心肌梗死中針對(duì)巨噬細(xì)胞的治療方法

在心肌梗死中以單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)進(jìn)行治療時(shí)，需要針對(duì)2個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控：第1階段，單核細(xì)胞募集和促炎性巨噬細(xì)胞清除碎片；第2階段，修復(fù)性巨噬細(xì)胞促進(jìn)心肌愈合。例如，白細(xì)胞水平顯著升高的患者可能會(huì)從抑制單核細(xì)胞募集的治療方案中獲益，而心肌纖維化廣泛的患者可能更適合抑制巨噬細(xì)胞增多或中和IL-4的治療方案。

通過使用抗體阻斷細(xì)胞因子或趨化因子影響細(xì)胞的產(chǎn)生、發(fā)育或功能，可以間接調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。例如，使用IL-1β的抗體可以減少心肌梗死后HSC的增殖，從而減少單核細(xì)胞的產(chǎn)生，減輕心臟炎癥反應(yīng)以及減少心衰的發(fā)生[34]。此外，在小鼠體內(nèi)抑制IL-1β可以減輕動(dòng)脈粥樣硬化中的斑塊進(jìn)展[35]。CANTOS研究也證明卡納單抗對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化患者有潛在的治療效果[36]。

通過納米顆粒和脂質(zhì)體運(yùn)載某種分子可以改變巨噬細(xì)胞的表型。例如，含有磷脂酰絲氨酸(PS)的脂質(zhì)體可通過模仿凋亡細(xì)胞引發(fā)巨噬細(xì)胞的抗炎反應(yīng)，這種方式在臨床治療上可以得到應(yīng)用[37]。這表明使用納米材料能夠特異性地治療心肌梗死，而通過PEG涂層以及抗體融合，可進(jìn)一步優(yōu)化脂質(zhì)體的靶向性。

此外，新興的治療技術(shù)包括基因編輯和RNA干擾，也可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的產(chǎn)生和表型。這2種方法最近都被應(yīng)用于臨床前研究[38]和對(duì)人類細(xì)胞的研究。未來通過治療方式的變革，可能針對(duì)巨噬細(xì)胞研發(fā)出更多的治療方法。

4 小 結(jié)

細(xì)胞譜系研究揭示了在穩(wěn)態(tài)時(shí)，心臟和大動(dòng)脈中的巨噬細(xì)胞大多為胚胎來源。在心肌梗死和動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，炎癥反應(yīng)招募的單核細(xì)胞可以在局部分化為巨噬細(xì)胞，后者通常具有更強(qiáng)的吞噬功能。然而，在心肌梗死后修復(fù)期招募的單核細(xì)胞則一般有利于疾病的轉(zhuǎn)歸，因其可以分化為修復(fù)型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)梗死區(qū)域的愈合以及瘢痕組織的修復(fù)。

今后，在不同器官單細(xì)胞水平上對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行更詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，以及對(duì)不同疾病分期進(jìn)行研究，可能有助于進(jìn)一步揭示巨噬細(xì)胞亞群功能及其在心血管疾病中各自的作用，使在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)特異性調(diào)控特定部位的巨噬細(xì)胞成為可能。